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TECHNICAL MANUAL

Ensamblaje de
Digestiones de Enzimas
de Restricción
12/11
TM367
Ensamblaje de
Digestiones de Enzimas
de Restricción
Toda la literatura técnica está disponible en: www.promega.com/protocols/ Visite el sitio web para verificar que está utilizando la
versión más actualizada de este Manual Técnico. Envíe un correo electrónico a Promega Technical Services si tiene preguntas sobre el
uso de este sistema: techserv@promega.com

1. Descripción ................................................................................................................................................. 1

2. Consideraciones sobre el sustrato de ADN ................................................................................................... 2

3. Almacenamiento, manipulación y uso de enzimas ........................................................................................ 3

4. Configuración de una digestión de enzimas de restricción ............................................................................ 3

5. Controles experimentales ............................................................................................................................ 3

6. Protocolos adicionales para determinadas enzimas de restricción ................................................................. 4


6.A. Protocolo para la digestión rápida del ADN de los plásmidos .............................................................. 5
6.B. Protocolo para la digestión directa de productos de PCR o RT-PCR en GoTaq® Green Master Mix o
Mezcla maestra de PCR ................................................................................................................... 5
7. Referencias ................................................................................................................................................. 6

1. Descripción

Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas de restricción, son enzimas que reconocen
secuencias de ADN cortas y específicas (a menudo palindrómicas). Estos fragmentos de ADN de doble cadena
(dsDNA) en sitios específicos dentro o adyacentes a sus secuencias de reconocimiento. La mayoría de las enzimas
de restricción (ER) no cortan el ADN que está metilado en una o ambas hebras de su sitio de reconocimiento,
aunque algunas requieren metilación del sustrato.
Cada enzima de restricción tiene requisitos específicos para una actividad óptima. Las condiciones ideales de
almacenamiento y ensayo favorecen la mayor actividad y fidelidad de las enzimas. Condiciones tales como
temperatura, pH, cofactor(es) enzimático(s), composición de la sal y fuerza iónica affect actividad y estabilidad de las
enzimas. Dos reacciones buffers suelen acompañar a cada enzima de restricción Promega: La reacción óptima buffer,
que proviene del sistema 4-CORE® Buffer (Reacción Buffers A, B, C y D) o es una de las otras reacciones óptimas
buffers (Reacción Buffers E-L), y MULTI-CORE™ Buffer. El óptimo buffer rinde el 100% de actividad para la enzima
que acompaña y sirve como la reacción específica buffer para la digestión individual con esa enzima. El MULTI-
CORE™ Buffer, que está diseñado para una amplia compatibilidad con muchas ER, está provisto de enzimas que
tienen un 25% o más de actividad en este buffer El MULTI-CORE™ Buffer es útil para digestiones con múltiples REs
porque generalmente produce mayor actividad para más combinaciones de enzimas que cualquier otro buffer pero a
veces resulta en un compromiso en la actividad. Los compendios que utilizan varios RE con requisitos significativos
de different buffer pueden requerir reacciones secuenciales, con la adición de RE buffer o sal antes de que se utilice la
segunda enzima.
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Para obtener más información sobre las compatibilidades de las enzimas de restricción y
www.promega.com/guides/ para las digestiones dobles, consulte el recurso de enzimas de restricción en:
buffers, y en la aplicación Promega para iPhone/iPad, disponible en App Store.

2. Consideraciones sobre el sustrato de ADN

Los sustratos de ADN comunes para las enzimas de restricción incluyen el ADN lambda bacteriófago, el ADN
plasmídico bacteriano y el ADN genómico. El ADN de Lambda es un ADN lineal que es un estándar de la industria
para medir y expresar la actividad unitaria de muchas enzimas de restricción. El ADN del plásmido superenrollado
intacto y los ADN con un gran número del sitio de restricción diana requieren más unidades de enzima (de dos a diez
veces) por microgramo que el ADN lineal si se utilizó un sustrato de ADN lineal en el ensayo de actividad enzimática.
Los productos de PCR y los oligonucleótidos son relativamente pequeños comparados con el sustrato de ADN
utilizado en la definición de la unidad. Por lo tanto, cuando se utilizan productos de PCR y oligonucleótidos en un
digesto de restricción, es esencial considerar la concentración molar de los sitios de reconocimiento de enzimas y no
sólo la masa de ADN. Además, algunos REs requieren que las bases que flanquean rodeen el sitio de reconocimiento
del núcleo. Esto puede ser un problema cuando se corta un oligonucleótido o fragmento de ADN donde el sitio de
reconocimiento está cerca del final. Cuando las estrategias de clonación por PCR incluyen el uso de primers de PCR
que contienen un sitio de RE, el primer debe diseñarse con ADN adecuado que rodee la secuencia de reconocimiento
del núcleo. Consulte la sección de Referencias Técnicas en: www.promega.com/resources/ para obtener información
sobre la capacidad de las enzimas de restricción específicas para cortar productos de PCR que tienen sitios de
restricción cerca del final del fragmento.
La pureza del ADN es otro factor que debe ser considerado. Dependiendo del método de purificación y del cuidado que se
tenga durante la manipulación, el ADN puede contener cantidades variables de contaminantes que restringen la digestión de
enzimas. Los contaminantes pueden incluir otros tipos de ADN, nucleasas, sales e inhibidores de las enzimas de restricción.
La effect de un contaminante en un digerido RE es generalmente dependiente de la dosis (es decir, el aumento de effects
inhibidor con el aumento de los volúmenes de ADN añadidos a la reacción). Se requiere ADN relativamente puro para la
digestión de enzimas de restricción. Las nucleasasas contaminantes suelen activarse sólo después de añadir sales (por
ejemplo, la enzima de restricción buffer) al ADN. Por lo tanto, las reacciones de control apropiadas deben realizarse siempre
en paralelo con la digestión de la enzima de restricción (véase la sección 5).

Buffers que contienen bajas concentraciones de EDTA (1mM) se utilizan a menudo para proteger el ADN de la
degradación de la nucleasa durante el almacenamiento, pero el EDTA puede interferir con la digestión de la enzima de
restricción si la concentración final en la reacción es demasiado alta. Esta situación suele producirse cuando la
concentración del sustrato de ADN es baja, por lo que es necesario utilizar un gran volumen de ADN en la digestión.
En tales casos, es mejor concentrar el ADN (por ejemplo, por precipitación de etanol). Los disolventes, sales,
detergentes y agentes quelantes orgánicos que a veces se utilizan durante la purificación del ADN también pueden
interferir con la actividad de las enzimas de restricción si se transmiten a la solución final de ADN. La diálisis o la
precipitación de etanol con acetato de amonio de 2,5 M (concentración final antes de añadir etanol), seguida de secado
y resuspensión, pueden eliminar muchas de estas sustancias. Se requiere ADN relativamente puro para la digestión de
enzimas de restricción; sin embargo, la adición de BSA acetilado a una concentración final de 0.1mg/ml puede mejorar
la digestión de ADN impuro por enzimas de restricción en efficiency Recomendamos que la BSA se incluya en todos
los compendios.
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3. Almacenamiento, manipulación y uso de enzimas

Mantener la esterilidad de los reactivos utilizados en la digestión de RE, así como de cualquier herramienta (por
ejemplo, tubos y puntas de pipeta) utilizada con dichos reactivos. Las enzimas de restricción deben almacenarse en
un congelador que no esté libre de heladas, excepto durante un breve período de tiempo durante su uso, en el que
deben mantenerse en hielo. La enzima de restricción suele ser el último componente que se añade a una reacción
para asegurarse de que no está expuesta a condiciones extremas. Cuando se están preparando muchos digestores
similares, puede ser conveniente crear premezclas de reactivos comunes.
Antes de montar la digestión de la enzima de restricción, mezcle bien cada componente, luego centrifugue
brevemente para recoger el contenido en el fondo del tubo. La reacción ensamblada debe mezclarse después de la
adición de la enzima. Mezcle suavemente todas las soluciones que contengan enzimas de restricción para evitar la
inactivación de las enzimas.

4. Configuración de una digestión de enzimas de restricción

Una digestión enzimática de restricción a escala analítica se realiza generalmente en un volumen de 20μl con 0.2-
1.5μg de ADN de sustrato y un exceso de enzima de dos a diez veces mayor. Si se utiliza un volumen inusualmente
grande de ADN o enzima, pueden producirse resultados aberrantes. El siguiente protocolo es un ejemplo de una
digestión RE típica.
1. En un tubo estéril, ensamble los siguientes componentes en el orden que se indica a continuación.

Componente Volumen
Agua estéril y desionizada 16,3µl
Enzima de restricción 10X Buffer 2µl
BSA acetilado, 10µg/µl 0,2µl
ADN, 1µg/µl 1.0µl

Mezclar con pipeta y luego agregar:


Enzima de restricción, 10u/µl 0,5µl
Volumen final 20µl

2. Mezclar suavemente con pipeta, cerrar el tubo y centrifugar durante unos segundos en una
microcentrifugadora. Incube a la temperatura óptima de la enzima durante 1-4 horas.
3. Añadir la carga buffer a una concentración final 1X y proceder al análisis del gel.
Nota: Las digestiones nocturnas suelen ser innecesarias y pueden provocar la degradación del ADN.

5. Controles experimentales

Los controles experimentales son necesarios para identificar, comprender y explicar problemas o inconsistencias
en los resultados. Los siguientes controles se utilizan comúnmente en paralelo con las digestiones RE: (1) ADN
experimental no cortado, (2) digestión de un ADN de control suministrado comercialmente y (3) digestión
"simulada" sin enzimas. También recomendamos analizar uno o dos marcadores de tamaño de different en más de
un carril por gel (es decir, las ubicaciones de different en el gel).
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6. Protocolos adicionales para determinadas enzimas de restricción

Los científicos de Promega han probado un subconjunto de enzimas de restricción para determinar su compatibilidad
con la digestión rápida (digestión de ADN en 15 minutos o menos) y la digestión directa en GoTaq® Green Master
Mix o PCR Master Mix (1,2). Los resultados se muestran en la Tabla 1.
En la Sección 6.A se proporciona un protocolo para la digestión rápida, y en la Sección 6.B se proporciona un
protocolo para la digestión directa de un producto de PCR.

Tabla 1. Compatibilidad de las enzimas de restricción con digestión rápida o digestión directa.

Restriction Rápido-Digestión- GoTaq® Restriction Rápido-Digestión- GoTaq® Buffer-


Buffer- Enzima Capaz Compatible
Enzima Capaz Compatible
KpnI + +
AatII + —
MluI nt +
Acc65I nt +
NcoI + +
AccI nt +
NdeI + +
EdadI + +
Nhel + +
Alu + nt
NotI + nt
ApaI nt +
NsiI nt +
AvaI nt +
PSTI + +
BamHI + +
PvuI — +
BglII — +
PvuII + +
ClaI + +
RsaI + nt
DdeI + nt
SacII — +
DpnI + nt
SalI + +
DraI nt +
ScaI + —
Eco47III nt +
SpeI + nt
EcoRI + —
SphI + +
EcoRV + +
Stui nt +
HaeIII + nt
XbaI + +
HincII nt +
XhoI + +
Hindú + +
XmaI + nt
HpaI nt +
nt = No probado; + indica corte exitoso en 15 minutos o menos; - indica corte fallido. Los datos y la
información adicional están disponibles en las Referencias 1 y 2.

4 Promega CorporaƟon - 2800 Woods Hollow Road - Madison, WI 53711-5399 USA - Toll Free in USA 800-356-9526 - 608-274-4330 - Fax 608-277-2516
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6.A. Protocolo para la digestión rápida del ADN de los plásmidos
1. Para realizar una digestión rápida, ensamble los siguientes componentes en hielo en tubos de 0,5 ml en el orden
indicado:

Componente Volumen
Agua estéril, desionizada y libre de nucleasasas 15.8µl
Enzima de restricción 10X Buffer 2µl
BSA acetilado, 10µg/µl 0,2µl
ADN plasmídico, 1µg/µl 1µl

Mezclar con pipeta y luego agregar:


Enzima de restricción1 1µl
Volumen final 20µl
1El número de unidades de enzimas de restricción añadidas a la reacción varía entre 5 y 12
unidades, dependiendo de la concentración de la enzima de restricción utilizada.

2. Mezclar suavemente con pipeta, cerrar el tubo y centrifugar durante unos segundos a la velocidad máxima en
una microcentrifugadora. Incubar a la temperatura óptima de la enzima durante 5-15 minutos.

6.B. Protocolo para la digestión directa de productos de PCR o RT-PCR en GoTaq® Green Master
Mix o PCR Master Mix
Las enzimas de restricción enumeradas en la Tabla 1 se probaron para la digestión directa en GoTaq® Green Master
Mix o PCR Master Mix utilizando reacciones de 25 µl y una concentración final de mezcla maestra de 1X.
Nota: Incluso después de completar el ciclo térmico, la polimerasa de ADN termoestable retiene cierta actividad, que
podría rellenar los extremos pegajosos generados durante una posterior digestión de RE. Estos productos sin punta
pueden resultar en una reducción de la clonación efficiency Aunque añadir una enzima de restricción directamente a la
PCR ahorra tiempo, purificar el producto de ADN después de la digestión puede ser ventajoso para eliminar pequeños
fragmentos de restricción que podrían interferir con la ligadura posterior.
1. Para realizar la digestión de enzimas de restricción, ensamble los siguientes componentes en hielo en tubos de
0,5 ml en el orden indicado:

Componente Volumen
Producto de PCR no purificado 25µl
Enzima de restricción1 0,5µl
Volumen final 25,5µl
1El número de unidades de enzimas de restricción añadidas a la reacción varía de 1 a 6
unidades, dependiendo de la concentración de la enzima de restricción utilizada.

2. Mezclar suavemente con pipeta, cerrar el tubo y centrifugar durante unos segundos en una
microcentrifugadora. Incubar a la temperatura óptima de la enzima durante 2 horas.

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7. Referencias
1. Schagat, T. (2007) Digestión rápida del ADN utilizando enzimas de restricción Promega. Sitio Web de
Promega Corporation: www.promega.com/resources/articles/pubhub/enotes/rapid-dna-digestion-using-
promega-restriction-enzymes/
2. Tritle, D. (2006) Actividad de las enzimas de restricción Promega en GoTaq® Green y PCR Master Mixes.
Sitio Web de Promega Corporation: www.promega.com/resources/articles/pubhub/enotes/activity-of-
promega-restriction-enzymes-in-gotaq-green-and-pcr-master-mixes/

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