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CAPÍTULO VI
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

1. Introducción
La ingeniería genética, clonamiento de genes o tecnología del ADN recombinante consiste
en la modificación in vitro del genotipo de los organismos.

El conjunto de técnicas biotecnológicas que permiten manipular el genoma de un ser vivo se

denomina ingeniería genética. Entre estas técnicas destacan:

- tecnología del ADN recombinante: con la que es posible aislar y manipular un

fragmento de ADN de un organismo para introducirlo en otro.

- secuenciación del ADN: técnica que permite saber el orden o secuencia de los
nucleótidos que forman parte de un gen.

- reacción en cadena de la polimerasa (PCR): técnica con la que se consigue

aumentar el número de copias de un fragmento determinado de ADN, por lo tanto,
con una mínima cantidad de muestra de ADN, se puede conseguir toda la que se
necesite para un determinado estudio.

Las aplicaciones prácticas y comerciales de la ingeniería genética son numerosas,

abarcando un campo que ofrece la posibilidad de utilizar plantas y animales transgénicos,
así como, microorganismos modificados genéticamente (OMG) para producir fármacos u
otros productos de utilidad para el hombre, entre los que se pueden citar: la insulina
humana, la hormona del crecimiento, interferones, nuevas vacunas… .

2. Tecnología del ADN recombinante

Esta tecnología permite obtener fragmentos de ADN, incorporar el gen o los genes de
interés que se podrán expresar cuando se incorporan a células de otros organismos
(vegetales, animales, bacterias...)
De una forma muy simple podemos “cortar” un gen
Generación humano y “pegar” al ADN de una bacteria. Por lo tanto
de fragmentos de ADN en la tecnología del ADN recombinante podemos
diferenciar cuatro etapas básicas, que se muestran en
el esquema anexo.
Inserción de los fragmentos Ejemplo
de ADN La insulina humana ha sido el primer producto
en un vector de clonación comercial de la clonación de genes y su éxito ha sido
debido al pequeño tamaño de la molécula que hizo
posible la síntesis química de un gen.
Introducción del vector de clonación
en una célula hospedadora
La estrategia seguida para la producción de insulina
humana recombinante fue la siguiente:
- sintetizar químicamente el gen que regula la
Clonación, fabricación de insulina.
desarrolllo y selección clones - introducir el gen en una bacteria para "obligar" a
ésta a que fabrique la insulina.

2.1 Generación de fragmentos de ADN. Enzimas de restricción y expresión.

Las enzimas de restricción cortan el ADN en sitios definidos en fragmentos pequeños y
manejables, considerándose como las "tijeras moleculares".
Estas enzimas representan uno de los grupos más importantes de enzimas en la
manipulación del ADN y se aislaron en bacterias, identificándose con distintos nombres,
siendo lo más característico de ellas:
 EB2-99

1º) Las enzimas son de tres tipos (I, II o III), siendo las más empleadas las de tipo II
por la forma más simple de actuar, reconociendo una secuencia específica y
cortando las dos cadenas de la moléculas de ADN.

Las secuencias reconocidas por las enzimas del tipo II son simétricas, es decir la
secuencia de la cadena leída en la dirección 5’-3’ es la misma que la secuencia de la
cadena leída también en la dirección 5’-3’. A estas secuencias también se
denominan de tipo palíndromo (anilina, radar, dábale arroz a la zorra el abad).
Las enzimas de Tipo I cortan las dos cadenas del DNA en una posición aleatoria a cierta
distancia del sitio de restricción. No se utilizan normalmente en la investigación de DNA
recombinante ya que el sitio de corte no es preciso

2º) Las enzimas de restricción utilizadas, proceden de bacterias, que las utilizan en
defensa frente a los virus, de forma que la secuencia reconocida por la enzima no se
encuentra en el ADN de la bacteria.

3º) Estas enzimas se denominan de forma genérica nucleasas que son todas las
enzimas con capacidad de romper los enlaces fosfodiester de la cadena
polinucleotida de los ácidos nucleicos, pudiéndose dividir en:
-exonucleasas: enzimas que permiten cortar el ADN por los extremos de la
cadena.
-endonucleasas: enzimas que permiten cortar el ADN por el interior de la
cadena sin afectar a los nucleótidos terminales.
Por lo tanto, las enzimas de restricción más utilizadas, se denominan también
endonucleasas de restricción del tipo II o retrictasas.

Exonucleasa

Endonucleasa

4º) La nomenclatura de estas enzimas está formada por:

- tres letras, tomadas del género y especie de la bacteria de la que se
aislaron originalmente , seguida a veces por una letra que identifica la cepa.
- número romano que identifica el orden de descubrimiento en el caso de
que en una misma enzima se hayan encontrado distintas especificidades.

En la tabla se muestran los siguientes ejemplos:

Ejemplo Genero de la Especie de la Cepa de la Orden de

bacteria bacteria bacteria identificación
EcoR I Escherichia coli RY13 I
Hae III Haemophilus aegiptius III
Bam HI Bacillus amyloliquefaciens H I
 EB2-100

5º) Cada enzima de restricción reconoce una secuencia específica de nucleótidos

y corta en ese punto cada una de las cadenas de ADN.
Los sitios de restricción son secuencias cortas de 4, 5 ó 6 pares de bases donde no
solo se reconoce esta secuencia, sino que se hidroliza de forma muy específica los
enlaces fosfodiester del ADN generando dos fragmentos de restricción, uno por cada
hebra.
En la tabla se muestran algunas de las enzimas de restricción más comunes con las
secuencias de reconocimiento y puntos de corte:

Sitio de Resultado del Extremos

Enzima Origen Bacteriano
Reconocimiento Corte

5’-GAATTC-3’ 5’-G↓AATTC-3’ 5’
EcoRI Escherichia coli
3’-CTTAA↑G-5’
Bacillus 5’-GGATCC-3’ 5’-G↓GATTC-3’ 5’
BamHI
amyloliquefaciens 3’-CCTAG↑G
5’-GGCC-3’ 5’- GG↓CC-3’ Romos
HaeIII Haemophilus egytius
3’- CC↑GG-5’
5’-TCGA 5’-T↓CGA-3’ 5’
TaqI Thermus aquaticus
3’-AGC↑T-5’
5’-CTGCAG-3’ 5’-CTGCA↓G-3’ 3’
PstI Providencia stuartii
3’-G↑ACGTC-5’
Staphylococcus 5'-GATC-3’ 5’- ↓GATC 5’
Sau3A
aureus 3’-CTAG↑ -5’
5'-CCCGGG-3’ 5’-CCC↓GGG-3’ Romos
SmaI Serratia marcescens
3’-GGG↑CCC-5’

Según el tipo de enzima el corte puede generar moléculas de ADN con extremoss a)
romos b) cohesivos con saliente 3’ c) cohesivos con saliente 3, según se muestra en
la figura: HaeIII PstI EcoRI
5’-GGCC-3’’ 5’-CTGCAG-3’ 5’-GAATTC-3’

GGCC CTGCAG GAATTC

CCGG GACGTC CTTAAG

3’ 5’

Extremos romos Extremos cohesivos Extremos cohesivos

con saliente 3’ con saliente 5’

Fragmento ADN inserto Los enzimas tales como la PstI y la EcoRI

Fragmentos cohesivos de
ADN unidos por ADN ligasa
generan extremos libres que se llaman
extremos cohesivos (pegajosos), porque
pueden unirse a otros fragmentos de ADN que
hayan sido cortados por la misma enzima de
restricción, siendo esto irrealizable cuando los
extremos son romos.

Ejercicio
3.3 ¿Qué ventaja tienen los cortes que dejan
extremos cohesivos con respecto a los cortes
romos?
 EB2-101

Los enzimas tales como la PstI y la EcoRI generan extremos libres que se llaman extremos
cohesivos (pegajosos), que tienen tendencia a volver a unirse de modo espontáneo, ya
que los extremos se pueden unir a otros extremos coincidentes que pueda haber en la
cercanía, siendo esto irrealizable cuando los extremos son romos.

6º Las enzimas de restricción son fáciles de usar. Para ello las condiciones son:
- añadir la cantidad apropiada de enzima en una solución reguladora de pH
controlado.
- incubar a la temperatura optima, generalmente a 37 ºC.

Ejemplo:
Un protocolo para la digestión de ADN con Enzimas de Restricción es:
1µL de buffer 10 X; 1µl de enzima (EcoRI); 1µL de ADN; 7µL de H2O; 10µL de
Volumen total. Incubar a 37ºC durante 30 horas.

7º En las enzimas de restricción se define la unidad de actividad como la cantidad

de enzima que se necesita, para cortar un microgramo de ADN sustrato en 60
minutos a la temperatura adecuada de la prueba en un volumen de reacción de 50 µl.

Ejercicio propuesto
Una solución de ADN humano tiene una concentración de 275 g/ml. Se desea
cortar 5 mg de ADN con 10 unidades de la enzima endonucleasa de restricción Hind
III. Si la Hind III tiene una actividad en el momento de su uso de 2500 U/ml. Que
volumen de ADN y de enzima debe ser usado.

8º Entre las aplicaciones donde se utilizan las enzimas de restricción, están:

-hacer el mapa de restricción de un plásmido o bacteriófago donde el ADN
se corta con varias enzimas de restricción, solas y en parejas, para
determinar el número de sitios de corte, sus posiciones relativas en la
molécula, orden y la distancia entre ellos.
- fragmentar el ADN genómico para separar por electroforesis.
-generación de fragmentos para ser usados como sondas marcadas en
técnicas como “Southern”y “Northern” blotting.
-generación de fragmentos para ser insertados en los vectores
apropiados, formando el ADN recombinante.
Ejemplo 1
Indicar qué productos se generarán al actuar sobre el fragmento indicado de ADN de doble
hebra las siguientes enzimas de restricción:
a) Eco RI b) Alu I c) Not I d) las 3 juntas
(5') AAGAA TTGCG GAATT CGAGC TTAAG GGCCG CGCCG AAGCT TTAAA (3')
(3') TTCTT AACGC CTTAA GCTCG AATTC CCGGC GCGGC TTCGA AATTT (5')

Enzima Origen Bacteriano Sitio de Reconocimiento Resultado del Corte

5'GAATTC 5'---G↓AATTC---3'
EcoRI Escherichia coli
3'CTTAAG 3'---CTTAA↑G---5'
5'GCGGCCGC 5'---GC↓GGCCGC---3'
NotI Nocardia otitidis
3'CGCCGGCG 3'---CGCCGG↑CG---5'
5'AGCT 5'---AG↓CT---3'
AluI* Arthrobacter luteus
3'TCGA 3'---TC↑GA---5'
a) La enzima EcoRI identifica las secuencia 5’GAATTC, 3'CTTAAG y corta el fragmento
como:
5'- AAGAA TTGCG GAATT CGAG CTTAAG GGCCG CGCCG AAGCT TTAAA-3'
3'-TTCTT AACGC CTTAA GCTCG AATTC CCGGC GCGGC TTCGA AATTT-5’
 EB2-102

b) La enzima NotI al no identificar las secuencias 5'GCGGCCGC, 3'CGCCGGCG no puede

cortar y por tanto no actúa.

c) La enzima AluI identifica las secuencia 5’ AGCT, 3'TCGA y corta en los fragmento como:
5') AAGAA TTGCG GAATT CGAGC TTAAG GGCCG CGCCG AAGCT TTAAA (3')
(3') TTCTT AACGC CTTAA GCTCG AATTC CCGGC GCGGC TTCGA AATTT (5')

d) Cuando actúan las tres juntas, (en realidad dos) se producen los siguientes fragmentos:
Eco RI Alu I Alu I
5') AAGAA TTGCG GAATT CGAGC TTAAG GGCCG CGCCG AAGCT TTAAA (3')
(3') TTCTT AACGC CTTAA GCTCG AATTC CCGGC GCGGC TTCGA AATTT (5')
Eco RI Alu I Alu I
Los fragmentos obtenidos después de la actuación de las distintas enzimas de restricción,
se pueden separar por tamaños, es decir, según el número de pares de nucleótidos que
llevan, mediante la técnica de electroforesis y así estudiar los distintos fragmentos. Según
donde se hallen las secuencias de reconocimiento, un gen determinado puede estar
fragmentado en varios trozos, o bien un trozo puede contener varios genes, posibilidades
que hay que confirmar.

Ejemplo 2
1. Cuantos fragmentos se obtienen al actuar una enzima de restricción sobre un plásmido
que tiene dos secuencias de reconocimiento.
Rta: Debido a que los plásmidos son moléculas circulares deben obtenerse dos fragmentos.
Sin embargo si el ADN es lineal y tiene dos sitios de reconocimiento daría lugar a tres
fragmentos.
Ejemplo 3
Al analizar mediante electroforesis en gel de agarosa el producto de la digestión de
un ADN plasmídico con una enzima de restricción, se observa la presencia de 4
fragmentos de ADN de diferentes tamaños (ver fig.). ¿Cuántos sitios de
reconocimiento para esa enzima hay en dicho plásmido? (Razonar la respuesta)
Rta: Al ser el plásmido una molécula de ADN circular, el primer corte por la enzima
de restricción produce una molécula lineal, el segundo corte la separa en 2
fragmentos, y así los n cortes sucesivos dan n fragmentos. Como se observan 4
bandas, es decir, hay 4 fragmentos, la molécula de plásmido presentaba 4 puntos
de corte, dianas o sitios de reconocimiento para la enzima de restricción.
Ejercicio resuelto
3.7 Un fragmento de ADN lineal fue incubado por separado con una enzima de restricción
1 y 2 y luego con ambas. Se lo sometió una electroforesis en gel de agarosa obteniéndose
las siguientes bandas:
Enzima 1: 1 banda de 86 kb, 1 de 20 kb y 1 de 14 kb
Enzima 2: 1 banda de 90 kb y una banda de 30 kb
Enzima1/ 2: 1 banda de 70 kb, 1 de 20 kb, 1 de 16 kb y 1 de 14 kb
Dibuja el mapa de restricción que se puede deducir de estos resultados
2
90 kb Se parte de una posición inicial de una
30kb
Inicial de las enzimas (2) y a continuación se
1 1
estudiaría cada una de las opciones
con la otra enzima. En este caso habría
86 kb 20 14 6 opciones (3!), aunque en la figura
Opción a
anexa solo se representan 2 opciones.
1 1
Es importante aplicar la lógica y tratar
20 86 kb 14 de recomponer los fragmentos.
Opción b
1 2 1
20 70 kb 16 14
Resultado
 EB2-103

Como ejemplo, un fragmento de 90 será un fragmento de 70+20 y uno de 30 será uno de se

14+16. Por tanto la opción b será la compatible con el resultado.No obstante, otros mapas
de restricción pueden ser posibles

Ejercicio resuelto
Dos estudiantes de segundo año de la Familia Profesional de Química del módulo de
Ensayos Biotecnológicos realizaron el siguiente conjunto de digestiones de restricción en un
plásmido recién aislado, pBLU 230, con los siguientes resultados:
Enzimas de restricción Fragmentos de restricción
HpaI 26 kb
HindIII 13 kb, 6 kb, 4 kb, 3 kb
HpaI + HindIII 7 kb, 6 kb (2), 4 kb, 3 kb

Dibuja el mapa de restricción que se puede deducir de estos resultados.

Se parte de un corte con la Hind III,

disponiendo los cortes en un posible HindIII Hind III + HpaI
mapa de restricción, partiendo de un 0 y 3 kb 0 3 kb 0
siguiendo las agujas del reloj
4 kb 7 kb
4 kb
A continuación se observa el resultado
del corte de los dos enzimas y se deduce pBlu 230 pBlu 230 Hpa I
26kb 26kb
la opción más adecuada, que para este 13 kb
caso es cortar con la HpaI en el 6 kb 6 kb 6 kb
fragmento 13 = 6+7.

Ejercicio propuesto
Una molécula lineal de ADN de 1,5 kb de longitud es digerida con las siguientes enzimas de
restricción, obteniéndose los siguientes resultados
Enzimas de restricción Fragmentos de restricción
BamHI 14 kb, 1 kb
EcoRI 12 kb, 3 kb
PstI 8kb, 7kb
BamHI+ EcoRI 11kb, 3kb, 1kb
BamHI + PstI 8kb, 6kb, 1kb
EcoRI + PstI 7kb, 5kb, 3kb

Dibuja el mapa de restricción que se puede deducir de estos resultados.

Ejercicio propuesto
A continuación se muestra un esquema del fragmento de un gen que se desea cortar para
insertar en un plásmido y enviar a un centro de investigación.

5'AGTACTTATCGCGCGGCCTATA TATAGTACAGTCGACCTTAGGCCT3'
Gen
3'TCATGAATAGCGCGCCGGATAT de interés ATATCATGTCAGCTGGAATCCGGA5'

También se muestra un set de enzimas de restricción que se tiene en el congelador.

Enzima Origen Bacteriano Sitio de Reconocimiento Resultado del Corte

Sal I Streptomyces albue 5'GTCGAC 5'G↓TCGAC
EcoRI Escherichia coli 5’GAATTC 5’-G↓AATTC’
Sna BI Sphaerotilus natans 5'TACGTA 5'TAC↓GTA
AfaI Acidophilium facilis 5’GTAC 5’GT↓AC
 EB2-104

a) Señalar la enzima o enzimas que NO pueden cortar el fragmento de ADN mostrado

arriba.
b) Señalar cuál es la enzima o enzimas que dejarían extremos romos
c) Señale la enzima o enzimas que dejarían extremos salientes después de cortar.
d) ¿Qué enzima única se emplearía para quitar el gen del ADN viral?
e) ¿Qué par de enzimas diferentes se podría utilizar?
f) ¿Qué enzima o enzimas usaría para cortar el vector de ADN?
g) Supongamos que se emplea una única enzima para cortar tanto el vector como el
fragmento. Tras la unión del fragmento y el vector, ¿cuántos sitios de restricción para esa
enzima tendrá el ADN resultante?
h) ¿Cuántas moléculas de ADN posibles pueden resultar de este tipo de unión?
i) Un técnico de laboratorio despistado echa a perder el experimento, utilizando sólo la
enzima SnaB I para cortar el vector de ADN, y la Afa I para cortar el fragmento del ADN con
el gen de interés. A continuación liga el fragmento al vector cortado. ¿Puede arreglar este
experimento volviendo a extraer el fragmento con SnaB I? ¿Y con AfaI?. Explícalo.

2.2 Inserción de los fragmentos de ADN en un vector de clonación

La inserción de los fragmentos de ADN cortados por las enzimas se realiza en vectores de
clonación, que son agentes transportadores, capaces de introducirlos en las células
hospedadoras para su desarrollo.
Los vectores de clonación son pequeñas moléculas de ADN, que tienen la capacidad de
autoreplicarse dentro de las células hospedadoras.
Se utilizan con frecuencia varios tipos de vectores de clonación, como son los plásmidos,
virus, cósmidos y cromosomas artificiales.

2.2.1 Plásmidos: moléculas de ADN circular, con un tamaño menor que el del cromosoma
de la célula hospedadora, replicándose con independencia del cromosoma bacteriano ya
que tienen su propio origen de replicación. Se encuentran en forma libre en algunas
eucariotas unicelulares y en el citoplasma de muchas procariotas como las bacterias.
Son ampliamente usados por su facilidad de aislamiento y es recomendable que dispongan
de un solo sitio de restricción y su utilización se ve favorecida por algún marcador que
permita detectarlo.
En la tecnología
Construcción de un Plásmido artificial (pBR322) del ADN
recombinante se
Origen de replicación Resistencia tetraciclina Resistencia ampicilina utilizan plásmidos
(plásmido EcoI) (gen del pSC101) (gen del RSF21241) naturales que son
modificados para
producir vectores
que tengan las
pMB9
características
deseadas, como se
pBR312 (demasiado grande)
muestra en el
ADN innecesario esquema anexo.
eliminado
pBR313 (demasiado grande)
ADN innecesario
eliminado
pBR322 (4,36 kb)

Nomenclatura utilizada para denominar plásmidos

Un plásmido importante en la historia de la manipulación genética desarrollado por
Francisco Bolivar y colaboradores es el pBR322 donde p significa plásmido; BR identifica
investigadores ó laboratorio que en este caso significa Bolivar y Rodriguez y 322 identifica
al plásmido en particular.
 EB2-105

El plásmido pBR322 tiene las caracteristicas necesarias para ser un buen vector de
clonación, como son:
- plásmido multicopia ya que pueden encontrarse hasta 15 copias por célula, aunque
utilizando cloranfenicol, puede aumentarse hasta 1000-3000.
- bajo peso molecular, que es de 4363 pb.
- contiene genes con resistencia a los EcoRI
antibioticos que permite una selección
adecuada de las células que contienen Gen BamHI
r
Amp
el plásmido. Contiene dos marcadores
de resistencia a los antibióticos PstI SalI
ampicilina (Ampr) y tetraciclina (Tetr). pBR322
- un único origen de replicación 4363pb
- varios sitios de restricción, aunque
uno solo para la enzima EcoRI. Gen
r
Tet

En la figura anexa se muestra el mapa Origen

del plásmido pBR322: replicación

2.2.2 Bacteriófagos o virus: son virus que infectan las bacterias, dependiendo de ellas
para su propagación.
Los fagos están constituidos por una
cabeza
cubierta proteica o cápsida en forma de
icosaedro en cuyo interior está contenido
cuello su material genético, que puede ser ADN
vaina o ARN de simple o doble cadena, aunque
el 95% de los fagos conocidos es ADN de
cola
doble cadena (ADNds) con 5.000 a
500.000 pares de bases.
fibras
Los fagos representan sistemas relativamente simples comparados con las bacterias y por
esta razón han sido ampliamente usados como modelo en la expresión de los genes.

Uno de los fagos temperados más conocido es el fago lambda () de 48,5 kb que codifica unos 46
genes y el descubrimiento de su genoma completo representó un hito en la genética molecular.
Los extremos de su genoma están formados por cortas secuencias de ADN simple hebra que son
complementarios y cohesivos. La región del genoma que contiene estos extremos cohesivos se
denomina sitios cos (cohesive sites).
El fago  sin modificar (salvaje) no es indicado como vector de clonación porque tiene demasiados
sitios de restricción, utilizándose como estándar de pesos moleculares para la electroforesis en gel.
Para evitar estos sitios de restricción se han construido fagos  modificados, en los cuales los sitios
de restricción no deseados han sido alterados de forma que la correspondiente enzima no los
reconozca.

Los virus más empleados como vectores de clonación son los fagos M13 y lambda ()
donde se introduce el inserto con técnicas de:
-inserción: el inserto se introduce de la misma forma que en los vectores tipo
plasmido: cortando el gen a clonar y el ADN del fago con las mismas enzimas de
restricción y ligando sus extremos para obtener un ADN recombinante.
-sustitución: se utiliza cuando el tamaño del inserto es demasiado grande (no le cabe
en la cabeza) y es necesario eliminar parte del ADN vírico que no se requiere para la
infección y replicación.
 EB2-106

Cuando están formados los ADN recombinantes, se pueden empaquetar dentro del fago por
adición de células bacterianas que contienen todas las proteínas necesarias para ensamblar
un fago completo. De este modo, el vector bacteriófago está preparado para la inserción del
ADNr dentro de las células E.coli. Este proceso se denomina empaquetamiento in vitro.

gen a insertar

ADN del virus ADN recombinanante Ensamblado virus Virus con el ADN

En definitiva, para clonar ADN, se purifica el ADN del fago y se corta con una
enzima de restricción dando lugar a un brazo izquierdo, una región central y un
brazo derecho. Se aíslan los brazos y se unen con ADN ligasa al fragmento de
ADN de interés, cortado con la misma enzima. Posteriormente se ensamblarán las
distintas partes del virus, quedando el virus completo para que se inserte el
ADNr en las células hospedadoras por el proceso de TRANSDUCCIÓN, proceso
similar a la transformación.

2.2.3 Cósmidos: son plásmidos que combinan las propiedades de los plásmidos y de los
fagos. Tienen la ventaja de ser pequeños (4-6 kb) pudiendo acomodar fragmentos de ADN
de un tamaño superior (47 kb). Los cósmidos contienen la secuencia “cos” del fago lambda,
necesaria para el empaquetamiento del ADN del fago dentro de su cubierta proteica.
El ADN entre dos sitios cos se
empaquetará en la cabeza del
fago que una vez dentro de la
célula hospedadora se
comportará como un plásmido,
pero con la ventaja de que
ADN vírico ADN a introducir estos "fagos" no son virulentos
y no causan lisis.
Por lo tanto la expresión génica
Extremos y la producción es posible,
cohesivos pudiendo utilizar como medio
Cósmido de selección la adición de
genes de resistencia ampicilina
aprovechando su
comportamiento de plásmido.
Cromosoma
Cósmido bacteriano
A pesar de sus ventajas los
Empaquetamiento cósmidos pueden ser
en bacteriofago inestables.
Infección
Escherichia coli
 EB2-107

2.2.4 Cromosomas artificiales, también denominados por sus siglas en inglés YAC ( Yeast
chromosome artificial) son vectores que se construyen a partir de un plásmido, introduciendo
las unidades funcionales principales de un cromosoma, imitando la formación de ADN
cromosómico, con telómeros, centrómero y origen de replicación, diseñados especialmente
para adaptarse al tamaño de insertos en mamíferos y clonación en células eucariotas.
Pueden aceptar grandes insertos (2000 kb) y ser más estable cuanto mayor sea la inserción,
a diferencia de cualquier otro tipo de vector.
Cuando uno monta un rompecabezas, es más fácil ensamblar un número pequeño de fragmentos grandes que
un número grande de fragmentos pequeños, y lo mismo ocurre cuando se trata de determinar el genoma de un
organismo. Los YACs proporcionan fragmentos más grandes de cromosoma y por lo tanto se necesitan menos
para ensamblar el mapa físico del mismo. Por ésa razón, los YACs han resultado particularmente útiles en la
fase temprana del Proyecto Genoma Humano.

Por otra parte, al ser eucariotas son a menudo mejor que los vectores procariotas para la
expresión de los genes eucariotas, siendo la levadura unicelular Saccaromyces cerevisiae
una de las más utilizadas en la manipulación genética.

Unión del ADN al vector de clonación

La unión del fragmento de ADN al vector de clonación se produce mediante unión covalente
realizada por la acción de la ADN ligasa.
Cuando se unen fragmentos creados por una endonucleasa de restricción quedan mellas
(“nick”) que la enzima ADN ligasa repara uniendo nucleótidos adyacentes, tal como se
muestra en la figura.
Sitio de reconocimiento
Enzimas de restrición
5’ GAATTC
3’ CTTAAG
C
Corte de ADN por
Enzimas de restrición
G AATTC
5’
CTTAA G
3’
Inserción de Fragmentos de ADN
fragmento de ADN producidos por la misma
AATTC
foráneo G 3’ enzima de restrición
G
CTTAA 5’
5’ G AATTC G AATTC 3’
3’ C TTAAG C TTAAG 5’

ADN ligasa
une 5’ G AATTC G AATTC 3’
los fragmentos 3’ CTTAAG CTTAAG 5’
Molécula de ADN recombinanate

La unión del vector y el ADN que se va a clonar se produce por los llamados extremos
cohesivos, siendo este el método más fácil y común. Para ello debe utilizarse la misma
enzima de restricción para cortar tanto el vector como el inserto, siendo las etapas:
a) Corte del vector y del inserto con la misma enzima.
b) Mezcla del inserto y el vector de ADN.
c) Adición de la enzima ADN ligasa ( p. ej . T4 ligasa) y ATP.
d) Reacción lenta, utilizando una temperatura baja durante la noche.
e) Transformación de las células hospedadoras.
 EB2-108

2.3 Métodos de introducción del vector

El siguiente paso será introducir el vector de clonación que contiene el gen que se quiere
clonar en la célula hospedadora, para que al multiplicarse origine un clon celular que lleve
el gen insertado. Existen varias técnicas que dependerán del tipo de célula
fundamentalmente.
En las bacterias (células procariotas) se utilizan los procesos de:

-Transformación: ocurre espontáneamente en ciertos tipos de bacterias y se

consigue artificialmente sometiendo a la célula bacteriana a tratamientos físicos y
químicos. La célula capta moléculas de ADN que se encuentran en el medio externo,
las introduce en su interior y las incorpora a su genoma. Para que las células puedan
admitir el ADNr es necesario hacerlas “competentes” y la competencia puede
conseguirse de forma:

- natural: se da solo en algunas bacterias (aproximadamente el 1%) que son

capaces de incorporar de manera natural el ADN bajo condiciones de
laboratorio y muchas más pueden ser capaces de hacerlo en su ambiente
natural.

- artificial: inducida por procedimientos específicos de laboratorio, en donde

las células se convierten en permeables en condiciones que normalmente no
ocurren en la naturaleza.

Ejemplo
La bacteria Escherichia coli se hace competente enfriando las células y el plásmido
en hielo durante 20-30 min, en presencia de cationes divalentes como Ca2+ (CaCl2),
sometiéndola después a un shock térmico corto de 42 °C durante 2 minutos que
provoca que el ADN entre en la célula, preparando las membranas celulares para
ser permeables al ADN plasmidial. Los iones Calcio y la temperatura alteran la
permeabilidad de la membrana plasmática, permitiendo la entrada de ADN foráneo.
Las bacterias competentes son bastante frágiles y deben manipularse con cuidado.
2+
2 Ca 2+
Ca Ca Choque térmico
+

2+
2+
Ca 2+ Ca
Ca
0º C 42º C

La transformación es un proceso en que solo una pequeña parte de las células son
transformadas: se necesitan del orden de 106 -107 celulas transformadas por cada g
de ADN introducido.

-Transducción: los vectores recombinantes se empaquetan in vitro en las cápsides

proteicas del fago, y se introducen en la célula hospedadora, donde los vectores se
replican formando muchas copias del fago llevando todas ellas el fragmento de ADN
de interés en la clonación. Los vectores fágicos pueden transportar fragmentos de
hasta 20 kb (kilobases). En la siguiente figura puede verse el proceso de
transducción generalizada en varias etapas:
a) El virus se aproxima a una bacteria. Como puede observarse en la figura
lleva un genoma ya con el gen que interesa clonar.
b) En el contacto entre el virus y las células las partículas de fago se
adsorben a la pared celular bacteriana, en cuya zona de contacto se produce
un poro.
 EB2-109

c) Cuando el fago es adsorbido el virus inyecta su ADN al interior de la célula

bacteriana, dejando fuera la cápside del fago y comenzando el ciclo.
d) Replicación del material genético viral: se inicia la síntesis de proteínas
virales y ADN. Los fagos normalmente cortan el ADN de la célula
hospedadora en pequeños fragmentos.
e) Síntesis de las envolturas proteicas, como la cabeza y cola.
f) Empaquetamiento del ADN dentro de la envoltura proteica mediante un
mecanismo llamado “head full” o llenado de las cabezas del fago y
ensamblaje de la envoltura: formación de bacteriofagos dentro de la célula.
g) Lisis y liberación de las partículas virales: las proteínas virales provocan la
ruptura (lisis) y son liberados de nuevo, completando un ciclo e iniciando otro
cuando infecta a otra célula. En esta etapa terminaría el ciclo lítico donde
obtendríamos muchos fagos con el ADN recombinante.
g) En el nuevo ciclo el fago con el ADN modificado infecta otra bacteria
inyectando su ADN en una célula receptora.
h) El ADN modificado dentro de la célula receptora puede eventualmente
recombinarse, sustituyendo el ADN de la célula donadora por la receptora.
Este nuevo ciclo constituye el ciclo lisogénico. Ver figura.
Los fagos virulentos son aquellos que exhiben un ciclo de vida lítico, mientras
que los fagos temperados muestras ciclos lisogénicos, aunque en condiciones
determinadas también pueden exhibir ciclos de vida líticos

Ciclo lítico

Inyección ADN modificado Replicación proteínas virales

Infección en una nueva célula Liberación nuevos fagos

Ciclo lisogénico
Inyección ADN modificado Recombinación ADN

Para llegar a estos resultados los investigadores partieron por un procedimiento bastante simple.
Primero inyectaron fagos en un cultivo de bacterias Bacillus subtilis y encontraron que al hacer esto el
virus tendía a matar las bacterias (ciclo lítico). Luego filtraron el contenido del recipiente donde
estaban las bacterias para remover tanto a éstas como a los virus, pero reteniendo proteínas
pequeñas. Utilizaron este líquido en un cultivo fresco de Bacillus subtilis con fagos (igual que el
primero) y observaron algo sorprendente: ahora los virus tendían ahora a colocar su ADN dentro del
ADN de la bacteria (ciclo lisogénico) e infectarlas sin matarlas y cambiando radicalmente el
comportamiento de estos virus.
 EB2-110

Los fagos pueden amplificarse haciéndolos crecer en

placas sembradas con bacterias, donde se formarán
calvas, o bien infectando células en un medio líquido y
recogiendo las células lisadas.

- métodos físicos: están basados en la introducción mecánica de las moléculas

de ADN modificado en el interior de la célula. Alguno de estos métodos son:
- microinyección directa: técnica muy efectiva aunque laboriosa donde se
emplea una microjeringa para la introducción del ADN recombinante en las
células embrionarias en el proceso de obtención de animales transgénicos.
- electroporación: proporciona descargas eléctricas (2500 volts) por unos
pocos milisegundos a una mezcla de células hospedadoras y moléculas de
ADN recombinante, formando poros en las células y por este mecanismo
introducir ADN en las células como plásmidos.
- pistola genética (biolistic particle delivery):
Aguja percutora
técnica donde se introduce el ADN adherido a
micropartículas que se disparan sobre las
células. Cartucho
(pólvora)
Esta técnica se ha demostrado muy útil en la
transformación de células vegetales.
Macroproyectil
Microproyectil
En la figura adjunta se muestra una pistola (Tungsteno
genética que dispara microproyectiles de recubierto
Tungsteno (4 m) recubiertos con el ADN que ADN)
se quiere introducir en las células. Aire
Placa para detener
macroproyectil

Cápsula Petri
con células diana

2.4 Clonación. Desarrollo, selección y detección de clones

En los procesos de clonación se utiliza un gran número de células, pero no todas las células
producidas contienen el gen que se desea clonar, por lo que hay que detectarlo y separar
las células que contienen ADN recombinante de las que no lo contienen.

La selección de colonias se realiza en medios de cultivo selectivos, que dejan desarrollar

solo las células con el material genético de interés. Los métodos que a continuación se
detallan: Resistencia
- incubación en un medio al que se a la ampicilina
r
agrega el antibiótico y por tanto sólo (Amp )
crecerá aquella colonia que porte el ADN
que lleve el gen de resistencia a ese
antibiótico.
Por ejemplo, supongamos un ADN Célula Célula
foráneo que introducimos en un vector transformada no transformada
que lleva genes de resistencia a
Nutrientes
ampicilina. Se prepara un medio de + ampicilina
cultivo con ampicilina.
 EB2-111

Las células que no han sido transformadas no crecerán, mientras que aquellas que
tengan el plásmido crecerán ya que contendrán el gen de resistencia al antibiótico,
no obstante, habrá que buscar una prueba para distinguir si las células tienen el
plásmido solo o con el inserto (ADN foráneo) correspondiente.

- incubación en un medio con defectos nutricionales: células hospedadoras

mutantes que no puedan crecer en ausencia de un nutriente.
Como ejemplo, si empleamos un vector que lleve el gen TRP1 para la síntesis del
triptófano y se introduce en una levadura con incapacidad de producir este
aminoácido, solo crecerán las células transformadas en un medio que no contenga
este aminoácido.

La detección trata de identificar si las células seleccionadas por los métodos anteriores
contiene el gen insertado y se realiza mediante técnicas de:

- hibridación: consiste en detectar secuencias de ADN en colonias transformadas

mediante hibridación “in situ” con sondas marcadas radioactivamente con 32P o
actualmente utilizando desoxinucleótidos fluorescentes.
Normalmente se presiona con un papel de nitrocelulosa sobre la placa de agar que contiene
las colonias bacterianas, cada una de las cuales representa un fragmento de ADN
recombinante distinto. Algunas colonias se adhieren al papel formando un réplica de la
copia. A continuación, el papel se trata con una solución alcalina para romper las células y
liberar el ADN, que permanece proóximo a la colonia. Se añade la sonda marcada que
hibrida solo con el ADN que contenga la secuencia complementaria. La colonia marcada se
visualiza por radiografía.

-ensayos inmunológicos: detectando la proteína codificada por el ADN

recombinante mediante anticuerpos específicos.

-métodos genéticos que se deben a que los insertos de ADN foráneo producen
cambios en la célula anfitriona.
Ejemplo
Supongamos que se quiere clonar el gen que codifica la nitrito reductasa. Para ello
se utiliza como célula hospedadora una cepa de E.coli mutante que carece del gen
que codifica la nitrito reductasa. Las cepas que tengan el gen que codifica la nitrito
reductasa podrán degradar el nitrito. La causa de ésto sólo puede ser que la
mutación ha revertido o que se ha conseguido introducir el gen de la nitrito reductasa
en E. coli.

- genes marcadores: además del origen de replicación, los vectores de clonación

llevan otros genes denominados marcadores, que sirven para identificar las células
que contienen el vector de clonación. Se suelen utilizar como marcadores:

- genes de luminiscencia: en este caso, la célula que contenga el gen que se

quiere clonar, tendrá la propiedad de emitir luz, ya que el marcador que se le
incorpora determina que se exprese esa característica. Este sistema se
emplea cuando la célula hospedadora es una célula eucariota.
Ejemplo
El plásmido pGLO es un plásmido comercial que se utiliza como vector. Está
formado por varios genes, pero el gen más importante, y por el cual pGLO se
usa como marcador, es el gen GFP: Green Fluorescence Protein que
proporciona a la célula transgénica fluorescencia al exponerlo a la luz
Ultravioleta.
GFP saltó a la fama cuando empresarios japoneses comercializaron los famosos pez gusiluz
que modificados genéticamente expresaban el gen GFP haciéndolos fluorescentes en la
oscuridad.
 EB2-112

- genes que se inactivan por inserción (inactivacion insercional): consiste en

introducir el ADN foráneo en un gen marcador del vector, de forma que este gen se
inactive.

Ejemplo
En algunos vectores (plásmidos, fagos) se inserta un fragmento funcional de lacZ:
gen de E. coli que expresa una enzima (-galactosidasa) que puede hidrolizar el
enlace O-glucosídico del compuesto X-Gal, según la siguiente reacción:
5-Br-4-Cl-3-indolil--D-galactósido (X-Gal)  Br-Cl-Indol (azul)+ -D- galactopiranosa
En el inicio de este gen se
inserta el ADN foráneo a clonar,
provocando la interrupción de la
codificación del gen. Por lo
Célula + pUC19 Célula + pUC19 Célula tanto, los fragmentos de ADN
+ Inserto no transformada clonados interrumpen el gen lacZ
no produciendo la β-
galactosidasa.
Nutrientes Las colonias con el gen sin
+ ampicilina
+ X-gal
interrumpir de -galactosidasa
tendrán color azul en presencia
Incubación de X-gal, mientras que las
durante la noche colonias que permanezcan
blancas en presencia de X-gal
Colonias blancas Colonias azules
serán células que han sido
(pUC19 + Inserto) (contiene pUC19 solo)
transformadas por el vector que
Colonias resistentes a la ampicilina contiene el ADN foráneo en sitio
adecuado y, por tanto, ha
inactivado el gen de la -
galactosidasa.

Finalmente se hace un cultivo para producir gran cantidad de células que contengan el clon
buscado, para su aislamiento y estudio. A la vez que se reproducen las bacterias lo hace
también el plásmido con el gen que interesa, resultando un clon de células que llevan el gen
de interés, pudiendo formar diferentes clones con genes de interés para el hombre. A este
conjunto de clones se denomina biblioteca genómica o genoteca que a semejanza de una
biblioteca, los libros son los clones.

Cuestiones tipo test

1) ¿Cuál de las siguientes herramientas de la tecnología del ADN recombinado está

emparejada INCORRECTAMENTE con su uso? a) endonucleasa de restricción -
producción de fragmentos de ADN para clonar genes. b) ADN ligasa - enzima que corta al
ADN, creando extremos cohesivos. c) ADN polimerasa - copia secuencias de ADN en la
reacción en cadena de la polimerasa. d) transcriptasa inversa - producción de ADNsc desde
un ARNm. e) electroforesis - análisis RFLP.

2) ¿Por qué proceso se seleccionan las bacterias que contienen plásmidos recombinantes?
a) retirando el ADN de todas las células en un cultivo para ver qué células tienen plásmidos
b) examinando las células con un microscopio electrónico c) exponiendo las bacterias a un
antibiótico que mata a las células que carecen del plásmido d) produciendo anticuerpos
específicos para cada bacteria que contiene un plásmido recombinante e) utilizando
trazadores radiactivos para localizar los plásmidos