MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA

Laboratorio de Física 2

Horario: Martes de 14:00 hs a 17:00 hs.

Alumnos: Agostinelli, Federico.

Gandini, Luciano.

Resumen:

Se identifico las partes del microscopio de fluorescencia en el cual se observo el

funcionamiento del mismo por medio de irradiación a la muestra con luz de excitación y
separación de la luz emitida, que es mucho más débil de la luz de excitación.

Se analizó una muestra de células endoteliales de arteria bovina marcada con tres
fluoróforos en tres imágenes, cada una de ellas utilizando un cubo para un fluoróforo
distinto.
Luego se estudió como afecta la resolución del microscopio en la visualización de micro
esferas de látex fluorescentes de distintos tamaños.

Se midió por medio de una foto con un patrón de escala micrométrica los distintos
tamaños de las micro esferas y el limite de resolución (point spread) de cómo se observa
una fuente puntual, nos dio un valor de aproximadamente 0.2µm. A partir de las
imágenes se comprobó el valor nominal y el valor medido de cada micro esfera de látex.
Introducción:
Fluoroforo:

Moléculas que absorbe luz en una cierta longitud de onda y emite luz en una longitud de
onda mayor.

Fluoroforos:

Dapi: Absorbe luz UV, y emite luz color azul. Marca los núcleos de las células.

Budipy: Ilumina la muestra con luz de color azul para poder ver los microtubulos en
color verde.

Texas-red: Se ilumina la muestra con luz verde para observar la actina en color rojo.

Microscopia de fluorescencia:
La microcopia de fluorescencia permite alcanzar altos niveles de sensibilidad y
resolución microscópica, permitiendo una apreciación diferente de la información que
se puede obtener de los especimenes y que generalmente pasa desapercibida; Se refiere
al proceso mediante el cual un espécimen absorbe y subsecuentemente irradia luz en un
intervalo de tiempo (entre la absorción de la luz de excitación y la emisión de la luz
fluorescente) que es usualmente de nanosegundos.

La principal diferencia del microscopio de fluorescencia es que permite irradiar al

espécimen con la luz de excitación y separar la luz fluorescente emitida, que es mucha
más débil, de la luz de excitación.

La partes fluorescentes de la muestras brillan contra un fondo (background) oscuro con

suficiente contraste como para permitir la detección.

Filtros para fluorescencia:

Los filtros son los que permiten separar la luz emitida de la luz de excitación.
Hay tres categorías:

Excitación, barrera y espacios dicroicos combinado para producir un cubo de filtros.

Los filtros de excitación permiten que solo las longitudes de ondas seleccionadas de la
fuente de luz pasen a través del camino de iluminación del espécimen.

Los espejos dicroicos son filtros especializados diseñados para reflejar las longitudes de
onda de excitación y dejar pasar las de emisión eficientemente.
Los filtros de emisión dejan pasar solo las longitudes de onda emitidas por la muestra.

Las características de cada filtro se pueden ver en su espectro, que muestra el porcentaje
de transmisión en función de la longitud de onda.

Sistema de detección y procesamiento de imágenes:

Para la adquisición de imágenes, el microscopio de fluorescencia tiene instalado un

dispositivo CCD de astronomical instruments, modelo ST8, mediante imágenes de
transmisión de una grilla de calibración, se determinara el tamaño del píxel de las
imágenes obtenidas a partir de diferentes objetivos del microscopio. Esta cámara solo da
valores de intensidad de luz, por lo tanto la imagen obtenida es una escala de grises y no
a color.
También se caracterizara el ruido de oscuridad del detector que luego sera desconectado
de las imágenes adquiridas.

Los cubos utilizados fueron:

(1) 450-490/ FT 510/ LP520 (Zeiss) con filtro de excitación pasa banda 450-490 nm.
espejo dicroico pasa altos 510 nm. y filtro de emisión pasa alto 520 nm.
(2) Para transmisión (sin filtros)
(3) Cubo QD 655 (Chroma)
(4) BP 365/ FT 395/ LP 397 (Zeiss) con filtro de excitación pasa banda 365 nm. Espejo
docroico pasa alto 395 nm. y filtro de emisión pasa alto 397 nm.
Desarrollo experimental
A partir de la imagen patrón proporcionada por los docentes, graduada en 1µm se
estableció el tamaño aproximado de pixel para el aumento utilizado en todas las
imágenes a analizar. Esta imagen patrón fue obtenida por microscopia de transmisión,
pero al usar el mismo microscopio, lente objetivo y cámara la escala obtenida es
transladable a las imágenes de microscopia de fluorescencia.
Se estimo el diámetro de distintas microesferas utilizando la calibración arriba
mencionada con el objetivo de comparar el limite de resolución teórica del microscopio
con el limite observado.
Se utilizo el programa FIJI para analizar tres imágenes de microscopia de transmisión
de un preparado de células endoteliales de arteria pulmonar bovina. Se ajusto el
contraste de manera que fuera posible ver la mayor cantidad de detalles posible y se les
resto la imagen de ruido de oscuridad propia de la cámara utilizada. A las imágenes
obtenidas se le cambio el color para que fuera semejante al de la longitud de onda
emitida por el fluoróforo. Se superpusieron las tres imágenes obtenidas para obtener una
en que se observaran los tres marcadores al mismo tiempo diferenciados por su color.
Resultados:

Figura (1): actina de color rojo.

Figura (2): núcleos de color azul.

Figura (3): microtubulos de color verde.

Figura (4): composición final.

Como resultado se observó que el microscopio de fluorescencia es muy apto en el tema
del desarrollo de las ciencias biológicas.
El contraste de cada imagen puede variar en el tono de cada color correspondiente, este
es un error de medición del alumno por que este caso nuestra composición final el color
de microtubulos esta muy claro y aparecen rayas debido al ruido de la imagen.

El sangrado en el microscopio se veía en el núcleo de color verde debido a que el

espectro emitido por el fluoroforo budipy no es totalmente filtrado por el cubo utilizado
para ver el fluororfo dapi.
Este caso podria solucionarse insertando en el microscopio un filtro de emisión
pasabanda que va de 400 a 450.