MICROSCOPIA CONFOCAL LASER

Introducción

La observación microscópica es posible cuando se dispone de objetos pequeños o de secciones finas

de material a observar. Dependiendo de las condiciones del preparado se observa simultáneamente
un cierto grosor de la muestra (profundidad de campo). En las observaciones con el microscopio
fotónico (campo claro y fluorescencia) puede suponer observar al mismo tiempo todo el grosor de
una célula. La discriminación en planos o imágenes independientes siempre es posible, aunque
técnicamente complejo, mediante la obtención de secciones correspondientes a planos
consecutivos.

La microscopía de fluorescencia confocal aporta otra solución mucho más directa. Mediante el
empleo de fuentes de iluminación de gran intensidad y sincrónicas (láser), de un juego de
diafragmas y de un sistema de captación de imagen electrónico, permite la obtención de imágenes
de finas secciones +ópticas. A partir de series de estas secciones ópticas obtenidas a diferentes
profundidades, archivadas en un computador, resulta posible reconstruir una imagen
tridimendimensional.

A pesar de que los detalles ópticos del microscopio confocal son complejos, la idea es sencilla. El
sistema óptico del microscopio, generalmente fluorescente, no ilumina toda la preparación a la vez,
sino que en cada momento sólo ilumina un pequeño punto a una cierta profundidad de la muestra.
Para ello se necesitan fuentes luminosas de gran potencia, habitualmente haces láser, cuya luz pasa
a través de un diafragma. La luz fluorescente emitida por la preparación se recoge y produce una
imagen a la entrada de un fotodetector adecuado. Se coloca un diafragma en el detector, en el lugar
que es confocal con el punto luminoso, que es precisamente donde los rayos luminosos emitidos
por el punto iluminado de la muestra quedan enfocados. La luz que procede de ese punto penetra
en el detector, mientras que la que procede de otras regiones de la muestra queda fuera de foco en
el diafragma y no es detectada. La muetsra es barrida de TV. La imagen bidimensional, digital, se
forma al almacenar en una matriz númerica las intensidades luminosas medidas en cada uno de los
puntos del barrido. La imagen en un microscopio confocal se forma en un sistema electrónico y se
genera uno o más ficheros que contienen tanto las imágenes obtenidas como la información acerca
de las con

Historia
En 1957 Marvin Minski padre de la inteligencia artificial estudiando el sistema nervioso pensó que
si se pudiera verlo en sus diferentes niveles podría entender como funcionaban los circuitos
neuronales, entonces fue así como desarrolló esta técnica llamada por él: microscopio de barrido
por etapas, de doble enfoque”.

Marvin Minsky en los años cincuenta construyó y pantentó un microscopio de barrido por etapas
de doble enfoque que permitía observar con claridad caps sucesivas de un amuestra sin tener que
rebanar el espécimen en finos cortes. Treinta años después su método es llamado microscopia de
barrido confocal, proceso de microscopia óptica más notable en nuestro siglo.
El microscopio de barrido confocal combina el microscopio de fluorescencia con imagen electrónica
y puntos de luz suministrados por láser dirigido al espécimen en particular para obtener imágenes
tridimensionales.

En los microscopios ópticos cuando el objetivo enfoca luz tomada de planos por encima y por debajo
de la superficie que se observa, la imagen se hace rápidamente borrosa, entonces, Minski pensó
que lo ideal sería recoger la luz reflejada solamente por el plano de interés, pero sin embargo, los
tejidos ubicados por encima y por debajo de ese plano también refleja luz mostrando imágenes
borrosas. La dispersión disminuye el contraste y se produce cuando la luz incide sobre las partículas
y estas la reflejan a otras partículas adyacentes hasta alcanzar la superficie detectora.

Minki hizo pasar la luz de iluminación a través de un objetivo pinole, que enfoca los rayos
garantizado un punto de luz nítido e intenso sobre una porción mínima de la muestra a la
profundidad deseada, así garantizada que esa zona sería la más intensamente iluminada y en
consecuencia la que más luz reflejada,.

Sin embargo de esa manera no garantizada que la luz devuelta por los tejidos que estaban por
encima y por debajo del punto que él quería observar no llegaran a la superficie del detector.
Entonces realizó un segundo ajuste, impidiendo también que la luz que el tejido encima y debajo
del plano focal reflejada alcanzara la superficie receptora, por medio de una máscara con una
apertura pequeña, de modo que sólo la luz de egreso reflejada por el plano focal pasara a través del
orificio hasta la superficie detectora.

Con todos estos ajustes, Minski logro obtener un nuevo tipo de microscopio para la observación de
especímenes vivos con un alto contraste y mejor resolución, comparable únicamente a la que se
obtenía anteriormente con microscopios electrónicos de barrido a bajo aumento o luego de
complejos procesos de análisis digital de imágenes.

Principios de funcionamiento
Debido a que la cantidad de luz incidente sobre la muestra está pequeña, es necesario usar fuentes
poderosas. La luz en es un rayo láser que se hace pasar a través del pinole, este haz de luz pasa a
través del espejo, como se observa en la figura 1, posteriormente el haz pasa a través del lente
objetivo el cual lo enfoca sobre la muestra. La luz emitida por la muestra es recibida por el lente
objetivo y reflejada por el espejo dicroico que refleja totalmente la luz que llega en un ángulo de
45°. Esta luz pasa a través de la apertura pinhole que no permite el paso de la fluorescencia originada
por los planos fuera de foco. Entonces sólo la luz del plano focal llega al detector. Inicialmente este
tipo de técnica permitía observar claramente un solo punto por lo cual era necesario hacer un
barrido de la muestra, que requería un mayor tiempo para obtener una imagen completa. Para
acelerar la velocidad de obtención de la imagen algunos microscopios desplazan al haz por medios
de espejos oscilantes, que obligan a que la luz que incide en ellos fluya rápidamente a través dela
muestra. Estos espejos permiten construir la imagen en menos de 1 segundo. Otros sistemas usan
rendijas que aceleran el proceso barriendo línea en lugar de puntos. Actualmente estos
microscopios se complementan con el procesamiento digital de imágenes dando como resultado la
construcción tridimensional de las muestras.

La fuente de luz láser se hace pasar por una ranura e incidir en un espejo dicroico. De ahí se enfoca
en la muestra pasando por el objetivo del microscopio. La luz emitida por la muestra es colectada
por el objetivo y se enfoca en una ranura detectora.

Con esto, las imágenes del microscopio confocal son notablemente superares a las que se obtienen
con el microscopio óptico convencional, ya que las imágenes generadas contienen detalles
volumétricos y de textura imposibles de alcanzar con este último en los cuales el efecto deletéreo
que sobre la imagen tiene las áreas fuera de foco es especialmente notable; además, la iluminación
de la muestra hace que se pierda rápidamente la fluorescencia. Por estas razones, el microscopio
confocal es especialmente ventajoso para observar especímenes fluorescentes, ya que además de
eliminar el efecto de las regiones fuera de foco, solamente se ilumina una pequeñísima región de la
muestra en cada momento, eliminándose con ello el efecto de “blanqueado” que, sobre la
fluorescencia, induce la iluminación continua.

Fig. 1 La fuente de la luz (verde) se hace pasar a través de una ranura “pinole de apertura” e incidir en un espejo dicroico.
De ahí es enfocada en la muestra pasando a través del objetivo del microscopio. La luz emitida por la muestra (rojo) es
colectada por el objetivo y se enfoca en una ranura detectora “pinole de detección”. La luz proveniente de los planos
fuera de foco inciden fuera de la ranura detectora.
Preparación de las Muestras
Las muestras obtenidas para microscopia confocal son preparadas del mismo modo que para
microscopía de fluorescencia esto es mediante un proceso denominado inmunofluorescencia en el
cual un anticuerpo que ha sido obtenido específicamente contra la proteína de interés, es marcado
con una molécula (fluorocromo) capaz de emitir una luz fluorescente a una longitus de onda
particular propia de la molécula luego de ser excitado a una longitud de onda menor por una luz de
alta energía entregada por el láser.

Los anticuerpos utilizados pueden ser obtenidos ya sea mediante la inmunización en el laboratorio
con la molécula de interés inyectada a animales experimentales o de distintas empresas que los
comercializan permitiendo estos la inmunolocalización de una variada gama de moléculas
antigénicas y que son usados principalmente para la inmunotinción de componentes intracelulares
o de membrana celular y que proporcionan una referencia para la localización celular dela molécula
de interés o para analizar la expresión de esta molécula en determinados tipos celulares.

Tanto los anticuerpos preparados comercialmente como los obtenidos mediante inmunización, para
ser observadas al microscopio confocal (o de fluorescencia) deben ser unidos a una molécula
fluorescente (fluorocromo) que permitirá su detección al ser excitados por el láser, y al estar unido
al anticuerpo, que a su vez se unirá a la molécula que se quiere identificar, se podrá detectar la
presencia y localización de dicha molécula.

Son muy utilizadas también colorantes fluorescentes que tiene alta afinidad, principalmente pro
ácidos nucleicos lo que permiten marcar, preferentemente, el núcleo celular.
Es posible utilizar múltiples fluocromos con la salvedad que cada uno de ellos tenga una excitación
y emisión en longitudes de onda diferentes entre sí y que exista un láser que este dentro del rango
de excitación de ese fluorocromo.

Utilidades del microscopía confocal.

La microscopía confocal permite estudiar estructuras biológicas, siendo muy útil en la investigación
biomédica. Permite monitorear los movimientos de las moléculas dentro de las células. Por ejemplo
el movimiento del Calcio. Permite la localización y posterior estudios de las moléculas intracelulares
con mayor resolución que la microscopia convencional, permite observaciones en células vivas de
una gran cantidad de procesos que pueden ser registrados. Con uso de software y posterior al
procesamiento de la imagen permite realizar colecciones de secuencias seriadas, reconstrucciones
3D, mediciones de colocalización de marcadores, imágenes laterales del objeto, superposición de
imágenes obtenidas por diferentes técnicas.
Ventajas de la Microscopia Confocal

La microscopia confocal ha permitido que se desarrollen nuevas técnicas de preparación de los

especímenes a observar ampliando así la significativamente las posibilidades de estudiar las
relaciones estructura- función.

Con las opciones de obtención de imágenes, se han desarrollado, otros métodos que permiten
mejorar significativamente la calidad de las imágenes que se obtienen con el microscopio óptico.
Estos métodos se basan en el procesamiento digital de imágenes, por medio de procesamientos
matemáticos que permiten calcular y eliminar las regiones que se encuentran fuera de foco. Otros
métodos, para mejorar la calidad de imágenes en la microscopía óptica, se basan en modificaciones
en los ángulos de incidencia de la luz y en el uso de varios haces de luz para iluminar las muestras.
Estos avances en el procesamiento de las imágenes está haciendo posible obtener mediante
software específicos, imágenes en 3 dimensiones y lograr esquemas detallados de la morfología de
tejidos y células.
La importancia de la microscopia confocal radica entonces en que constituye una nueva y poderosa
herramienta para examinar las estructuras celulares y sus funciones. Podemos resumir sus ventajas
diciendo que:

1) Pueden observarse tejidos intactos así como secciones gruesas sin necesidad de hacer
cortes histológicos.
2) Se obtiene un aumento notable en la resolución, especialmente en muestras con
fluorescencia
3) Reduce el blanqueado de la fluorescencia
4) Permite hacer reconstrucciones tridimensionales más precisas de mejor calidad y en menor
tiempo que por otros métodos. Por todo lo anterior, es claro que en el corto plazo, el
microscopio confocal pasará a formar parte del instrumental normal de trabajo, tanto en
laboratorios de análisis clínico-patológico, como en los laboratorios de investigación básica,
ya que se ha convertido en un auxiliar indispensable en los estudios de tipo funcional, en
los cuales se pretende determinar los procesos que se llevan a cabo en tejidos vivos. Como
resultado del desarrollo de la microscopía confocal y de los métodos digitales de análisis de
imágenes, es posible actualmente abordar cuestiones relativas a las relaciones estructura
función en los seres vivos de manera más eficiente, sencilla y rápida.

Bibliografía

1.- Hibbs, A. 2004. Confocal Microscopy for Biologists. Edit. Klumer Acaddemis/Plenum Publisher.
New York. USA. 462 pg.

2.- Lichtman J. 1994. Investigación y Ciencia. La ciencia de la Luz. Microscopía Confocal. 29: 36-41.