Microscopio de Fluorescencia

INTRODUCCION
Microscopa de fluorescencia: Descubierto en 1908 por Khler y Siedentopf, y se basa
en que una sustancia natural en las clulas o un colorante fluorescente aplicado al corte
es estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energa absorbida como rayos
luminosos.
Siendo escasas las molculas autofluorescentes, su aplicacin ms difundida es para
revelar una fluorescencia agregada, como en la deteccin de antgenos o anticuerpos.
Tambin se puede inyectar molculas fluorescentes especficas en un animal o
directamente en clulas y usarlas como marcadores.

Fluorocromos: Pueden usarse directamente, aprovechando la propiedad de unirse a

determinadas molculas u orgnulos. Pero lo ms habitual es que estos colorantes se
empleen conjugados a otras molculas, como anticuerpos, que son capaces de unirse de
modo especfico a estructuras concretas de la clula. Algunos colorantes denominados
fluorocromos tienen la propiedad de ser excitados (pasar a un nivel superior de energa)
cuando absorben luz ultravioleta (luz de longitud de onda corta).
Problema: La utilizacin de fluorocromos pierde grandes intensidades de luz
empleadas, entonces no pueden observadas durante largos periodos de tiempo debido a
la desaparicin de la fluorescencia.
Fluorescencia: A medida que las molculas excitadas regresan a su estado normal
liberan el exceso de energa en forma de luz visible de mayor longitud de onda que la
radiacin excitante. Los objetos fluorescentes aparecen brillantemente iluminados
contra un fondo oscuro, segn el color del colorante usado.
Epifluorescencia: Hoy da se utiliza mucho un microscopio de fluorescencia en el cual
la luz es emitida desde arriba del preparado. Por lo tanto, el objetivo del microscopio

acta como lente iluminadora y de imagen.

CONSTITUCION FUNDAMENTAL:
Fuente luminosa (lmpara de mercurio o halgena): Debe emitir la mayor cantidad de
luz ultravioleta en el lmite del espectro visible, que atraviesan el material de la
preparacin de la misma forma en que lo hace un microscopio ptico comn
Objetivos: Suelen ser de cuarzo ya que el vidrio absorbe la radiacin ultra-violeta.
Filtros: Retienen la radiacin ultra-violeta, peligrosa para el ojo humano, dejando pasar
solamente la radiacin visible, que no es peligrosa. Existen un gran nmero de juegos de
filtros de excitacin y de emisin para los diferentes fluorocromos:
*El de excitacin: Ubicada entre la fuente de luz y el preparado. Permite el paso de
ondas de luz con longitud que caiga en el rango azul con el fin que el preparado sea
alcanzado exclusivamente por la luz azul y produzca emisin de luz fluorescente.
*El de barrera: Ubicada antes del ocular para prevenir daos retinianos que podran
ser causados por rayos ultravioleta que escapan el espejo dicrmico. Corta
completamente la luz de excitacin no deseada, es decir selecciona la longitud de onda
de emisin del fluorocromo.
*Espejo Dicroico: Permite la separacin de la luz de excitacin y la fluorescencia.
Posicionado en 45 respecto al eje ptico, la longitud de onda ms corta es reflejada y la
longitud de onda ms larga lo atraviesa.

COMPARACION CON MICROSCOPIO CONVENCIONAL

Este microscopio es similar al microscopio convencional, a excepcin de que la luz
incidente que procede de una potente fuente atraviesa un primer filtro que selecciona la
longitud de onda capaz de excitar al fluorocromo.
Otra diferencia radica en que la luz de iluminacin (excitacin) no est involucrada en
la formacin de la imagen. En este sentido la microscopa de fluorescencia difiere de la
microscopa normal en la cual la imagen es formada por la luz de iluminacin.
FUNDAMENTO FISICO
La luz de una fuente de longitud de onda mltiple se mueve a travs de un filtro
excitador que solo permite que pase la radiacin excitada de la longitud de onda
deseada. Esta radiacin es reflejada por el filtro dicromtico y enfocada por la lente del
objetivo sobre la muestra, las molculas fluorescentes de la muestra se excitan y emiten
luz (por fluorescencia) de una longitud de onda especfica y mayor. Esta luz es enfocada
por el objetivo y la mayor parte pasa a travs del filtro dicromtico y no se refleja. Un
filtro de barrera final bloquea toda la luz residual con la frecuencia de la radiacin de
excitacin. Ejemplo:
1. Primer filtro de excitacin: selecciona la luz de la longitud de onda incidente. En el
esquema est seleccionando luz de longitud de onda entre 450 y 490 nm (azul)

2. Espejo dicroico: Refleja la luz de ciertas longitudes de onda y de dejar pasar otras.
En este caso refleja luz de longitud de onda menos de 510 nm (por ello refleja la luz
incidente azul) y deja pasar la luz de longitud de onda superior a 510 nm, dejando pasar
la luz verde emitida por el fluorocromo.
3. Segundo filtro de barrera: Es el filtro que selecciona la luz de longitud de onda
fluorescente. En este caso deja pasar la luz de longitud de onda 520 a 560 nm.
Entre otros aspectos o fundamentos, importantes a considerar tenemos:
*El largo de onda de la fluorescencia (emisin) es generalmente ms largo que el largo
de onda de la luz excitadora
*Mientras ms larga sea la longitud de onda, ms baja es la energa de la luz. Por lo
tanto la energa de la fluorescencia es ms baja que la luz absorbida.
*La intensidad de la fluorescencia es generalmente mucho ms baja que la de la luz de
excitacin
*La fluorescencia se desvanece.
*Cada substancia posee un espectro de fluorescencia caracterstico.

APLICACIONES
1. Autofluorescencia: Detecta la fluorescencia emitida por molculas de la muestra
misma.
2.Fluorescencia inducida: Partes especficas de la muestra pueden ser observadas
selectivamente, mediante mtodos de tincin. Ej:substancias especficas como organelos
celulares, protenas, anticuerpos, DNA, RNA, etc.
3. Sobre objetos bastante ms pequeos que la limitacin del poder de resolucin,
siempre que su emisin de luz sea lo suficientemente intensa. Ej: molcula de DNA, un
virus.