Aislamiento De Virus

1. INTRODUCCIN
Los virus varan en tamao en un rango desde menos de 100
nanmetros en dimetro a varios cientos de nanmetros en longitud
en el caso de los filoviridae Todos los virus contienen un genoma de
cido nucleico (ARN o ADN) y una capa protenica protectora (llamada
cpside). Al conjunto del genoma y cpside se le llama nucleocpside
y la misma puede tener forma icosadrica, helicoide o compleja. Los
virus pueden o no tener envoltura. Los virus envueltos obtienen sus
envolturas por gemacin a travs de las membranas de las clulas
husped. En algunos casos, los virus atraviesan la membrana
plasmtica pero en otros casos, la envoltura puede provenir de otras
membranas como del aparato de Golgi o el ncleo. Algunos virus,
geman a travs de porciones especializadas de la membrana
plasmtica de la clula husped. Los mtodos utilizados para
reconocer las infecciones por virus humanos pueden clasificarse en
DIRECTOS e INDIRECTOS, segn persigan demostrar la presencia del
virus o de alguno de sus constituyentes (antgeno o genoma viral) o
bien la respuesta de anticuerpos especficos por parte del husped en
el curso de la infeccin. Gran parte de las tcnicas utilizadas en el
diagnstico clnico se basan en pruebas serolgicas que identifican
anticuerpos especficos frente a diversas protenas antignicas. Sin
embargo, existen circunstancias en las cuales son necesarias pruebas
que detecten precozmente la infeccin viral (tratamientos especficos,
medidas profilcticas, etc.). En el momento actual, la tendencia en el
diagnstico virolgico consiste en emplear nuevas y ms sensibles
tecnologas de deteccin de antgenos y de investigacin de cidos
nucleicos con el propsito de lograr un diagnstico viral ms rpido.
El desarrollo de quimioterapia antiviral efectiva es responsable de
esta tendencia que hace de la identificacin rpida, sensible y
especfica de los virus, una necesidad.

2. MARCO TEORICO
Los virus, a diferencia de los que sucede con la mayora de las
bacterias, hongos y protozoos, slo pueden multiplicarse en el interior de
clulas vivas, no pudiendo hacerlo en un medio nutritivo carente de
clulas. Los sistemas celulares utilizados para propagar los virus en el
laboratorio son:
Animales de experimentacin
Embriones animales
Cultivos celulares artificiales
La base del diagnstico viral es la deteccin del virus o de sus
componentes. El aislamiento del virus era la tcnica standard de oro
sobre la cual se medan todas las otras pruebas de diagnstico viral,
pero hoy en da con el desarrollo de las nuevas tcnicas de Biologa

Molecular ya no es la ms sensible. De igual forma el aislamiento de

virus tiene una sensibilidad y una especificidad muy alta. Debido a
que slo se amplifica el virus, se aumenta la sensibilidad sin disminuir
la especificidad. Sin embargo, existen algunas desventajas en el
aislamiento del virus: El proceso suele ser lento, ya que demanda das
a semanas para la identificacin, y en consecuencia puede no estar
disponible a tiempo para influir en la atencin del paciente. Adems,
es un proceso laborioso y caro. Por otra parte requiere el uso de
sistemas de cultivos adecuados, por ejemplo, se necesitan varias
lneas celulares para la deteccin ptima de virus.
Los cultivos celulares son, pues, los biosubstratos ms corrientemente
empleados para la propagacin de los virus.
Un cultivo celular es obtenido, de explantes de rganos o de
embriones de animales.
Estas clulas obtenidas aspticamente se disocian tratndolas con
una enzima (tripsina) que rompe el cemento intercelular. La
suspencin de celulas libres as obtenidas se coloca en la superficie
plana de un recipiente de vidrio o plstico en donde las clulas se
adhieren y multiplican formando una fina capa de clulas que se
llama MONOCAPA CELULAR.
Esta monocapa de clulas crece en un medio de cultivo complejo que
contiene albmina, vitaminas, sales, glucosa, etc., en un sistema
buffer. Se previene la contaminacin bacteriana adicionndole al
medio antibiticos adecuados.
Los cultivos celulares en monocapa son los ms usados, aunque hay
otros sistemas (cultivos en suspensin, explantos, cultivos de
rganos, cultivos en microcarriers, etc.).
Los cultivos celulares se dividen en:
Cultivos Primarios: Se obtienen a partir de clulas, tejidos u
rganos tomados directamente del organismo y pueden subcultivarse
una o dos veces.
Lneas Celulares Diploides: Son aquellas que crecen en pasajes
sucesivos hasta aproximadamente 50 subcultivos y que conservan
por lo menos en un 75% el cariotipo correspondiente a la especie de
que provienen.
Lneas Celulares Continuas: Permite un nmero finito de
subcultivos y son heteroploides. Para considerar que se ha logrado
establecer una lnea continua, esta debe de haber sido subcultivada
por lo menos 70 veces. Las lneas celulares continuas ofrecen las
siguientes ventajas:

Disponibilidad para todos los investigadores de stocks de

clulas idnticas, ya sea congeladas en ampollas o en

monocapa de botella de cultivos, con la posibilidad de

reconstituirlas cuando sea necesario.

Facilidad relativa del pasaje y mantenimiento en todos los

laboratorios.

Libre de contaminacin con agentes extraos.

Los distintos cultivos celulares varan en cuanto a su susceptibilidad a

los diferentes virus, ya que existe una relacin especfica huspedvirus, y es en funcin de los datos clnicos y del tipo de muestra que
se elige el cultivo para inocular el material.
Luego de inoculado el cultivo celular, se incuba a 35-37 C por un
perodo de hasta 14 das promedio, esperando la aparicin de efecto
citoptico, toxicidad o degeneracin celular, observando el cultivo al
microscopio a las 24, 48, 72hs y luego 2 veces por semana. Se usan
cultivos celulares no inoculados para control y comparacin con
cualquier cambio morfolgico observado en los cultivos inoculados. El
efecto citoptico es la visualizacin de cambios morfolgicos ms o
menos caractersticos en las clulas inoculadas producidas por la
accin del virus sobre el cultivo celular.
Cuando los virus no producen efecto citoptico, se puede recurrir a
tcnicas que ponen en evidencia la presencia de aquel en el cultivo.
Las ms usadas son: hemadsorcin, hemaglutinacin y tinciones con
anticuerpos monoclonales. (Ver 2)
Hemadsorcin: Hay virus que durante su multiplicacin intracelular,
expresan en la membrana de la clula husped elementos
estructurales virales llamados hemaglutininas, glicoprotenas capaces
de unirse a receptores especficos en la membrana de glbulos rojos
de diferentes especies animales. De modo que si se agregan glbulos
rojos a un cultivo inoculado, se puede poner en evidencia la infeccin
de esas clulas a travs de la unin de los glbulos rojos a la
superficie celular.
Hemaglutinacin: Las hemaglutininas pueden ponerse en evidencia
en el sobrenadante de los cultivos utilizando el mismo fundamento
que para la hemadsorcin.

3. OBJETIVOS

Visualizar las Placas de lisis.

Describir los procedimientos tradicionales y actuales de

aislamientoe identificacin del virus del dengue e influenza.
4. MATERIALES Y METODOS

Material biolgico:

cultivoEscherichia coli ATCC

20 ml de agua de alvaal
Placas Petri
Aza bacteriolgica

Procedimiento

Se le agrega el cultivo de e. coli a 20 ml de agua de alvaal,

mezclamos con movimientos circulares
Luego en una placa Petri con agar hacemos una siembra por superficie
del cultivo joven de E.coli.
Sacamos el exceso de la siembra con una pipeta y llevamos a la estufa