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Facultad de Ciencias Biológicas

Escuela Académico Profesional de Microbiología y Parasitología


“AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE MICROORGANISMOS FERMENTADORES
DEL MUCÍLAGO DEL CAFÉ DE INTERÉS ORGANOLÉPTICO PROVENIENTES DE LA
LOCALIDAD DE VILLA RICA ”

PROYECTO DE TESIS
Para optar al título de Licenciatura en Ciencias Biológicas con mención en Microbiología y
Parasitología
AUTOR
Angel Saúl Serrano Angulo
ASESOR
Mario Alcarraz Curi
Lima, Perú
2023
I. Planteamiento del problema
El café (Coffea arabica), como grano es una semilla la cual viene del arbusto del cafeto,
perteneciente a la familia de las rubiáceas. Este crece en regiones cálidas y tropicales y su
cultivo se ha extendido en épocas relativamente recientes. Tiene como lugar de origen
Etiopía, en África Oriental, específicamente de la región llamada “Kaffa”, de donde deriva su
nombre. (Natividad, 2019)

A nivel de Perú hay un cultivo de 425 mil hectáreas. El sector cafetalero peruano es
caracterizado por pequeños productores que cultivan pequeñas áreas entre 1-5 hectáreas, y
producción promedio anual de 600-700 kilogramos por hectárea . Así, el café en el Perú
representa la primera economía en los productos de exportación tradicional, para el año
2020 fue de 648.5 millones de dólares americanos ; sin embargo, el Perú solo representa
entre el 2% y 3% del mercado mundial de exportaciones (Díaz, 2021)

A nivel regional el café es el motor de la economía en Villa Rica. En el distrito se desarrolla


su cultivo y transformación primaria, como es común entre los países productores que
comercializan principalmente café verde negociado como café convencional. Sin embargo,
una nueva generación de productores apuesta por agregar valor localmente y participa en el
segmento de cafés especiales, así como en el de cafés tostados en origen. (Ayvar &
Valenzuela,2019)

Según el Plan Nacional de Acción del Café Peruano 2019-2030, aprobado en diciembre de
2019 por el MINAGRI, el principal problema es el bajo nivel de competitividad y
sostenibilidad social y ambiental de la cadena de valor del café. Y las causas directas se
relacionan con los bajos niveles de productividad y manejo técnico, el bajo nivel y la
inconsistencia en la calidad del café, el limitado acceso y uso de servicios financieros, el
también limitado posicionamiento del café peruano en el mercado nacional e internacional,
las inadecuadas condiciones logísticas y la débil gobernanza e institucionalidad de la
cadena. Es decir, ya se tiene un diagnóstico claro de los problemas y sus determinantes,
por lo que se esperaría que este año se brinde un mayor impulso al sector. (El Peruano,
2019)

El fruto del café por lo general consiste en una capa externa de la piel, llamado exocarpio en
la que hay una capa de pasta, seguido de mucílago (mesocarpio) firmemente adherida a la
capa rígida llamada pergamino (endocarpio). El pergamino protege dos semillas rodeadas
por una membrana fina conocida como piel de plata (Evangelista, Pedroso, Silva, Marques y
Freitas, 2015; Ramos, Sanz y Oliveros, 2010).

Si bien la calidad del café es un rasgo altamente complejo, su definición depende de varios
factores, incluyendo las condiciones edafoclimáticas, tratamientos post-cosecha (incluido el
proceso fermentativo) y genética. Por ello de esta industria cafetalera el puntaje que se le
da al café en general se denomina “puntuación de taza” o simplemente ”taza”, utilizado
como una forma de de calificar y clasificar la calidad del café, considerando cualidades
tales como el aroma, sabor, acidez, cuerpo y balance. Dentro de esta calificación (de 0 a
100), los que obtienen un puntaje mayor a 80 se consideran de mayor calidad y con sabores
más distintivos.(Leroy et al., 2006, citado en Duicela 2018).

La calidad en taza de café se mide a través de los atributos sensoriales que sobresalen en
la preparación de la infusión de la bebida, la cual está dada por factores de genotipo, tipo de
suelo, condiciones agroecológicas, variedad, prácticas agronómicas, de cosecha,
postcosecha y de torrefacción. La calidad de una bebida de café está ligada fuertemente a
las reacciones químicas que se presentan en el proceso de tostión y al tipo de beneficio
(conjunto de operaciones que se llevan a cabo y que dan como resultado el café pergamino
seco) realizado post-cosecha. El beneficio seco, semi-seco y húmedo son los métodos de
mayor aplicación para el procesamiento de café. (Ramos y Criollo, 2017)

El beneficio húmedo de café se realiza con el fin de retirar el mucílago que cubre los granos
del café y dicha labor influye en la calidad del café (evaluación sensorial). En este proceso
se da una fermentación natural, en estudios previos han encontrado enzimas como las
pectinasas, pectasas y bacterias pectinolíticas que se encuentran en los frutos de café, tales
como Erwinia herbicola y Klebsiella pneumoniae. Además, Enterobacter spp., E.
agglomerans, E. aerogenes, Erwinia sp., E. coli, Klebsiella ozaenae, Proteus sp., Serrata
fonticola, Citrobacter freundii anaerobias facultativas productoras de fermentaciones mixtas
(Puerta, 2012).

Dentro de la industria cafetalera, la calidad del producto es esencial para su éxito en el


mercado, la cual tiene su origen en una combinación de factores relacionados con la
agricultura, el entorno y los métodos empleados. Entre estos métodos, uno de los más
determinantes es el proceso de fermentación utilizado en la fase de producción del café.
Esta etapa es particularmente crítica, ya que puede influir de manera significativa en las
características finales que se encuentran en cada taza de café. La forma en que se lleva a
cabo la fermentación es clave: si se prolonga demasiado o si no se completa de manera
adecuada, pueden surgir problemas irreversibles en los granos. (Coronell & Herrera, 2022)

La fermentación en el café se refiere al proceso durante el cual la pulpa y el mucílago que


rodea las semillas se descomponen a través de la acción microbiana. Este proceso produce
una amplia gama de metabolitos, como ácidos orgánicos, alcoholes superiores y ésteres,
que luego agregarán complejidad y profundidad a un café. Los microorganismos
responsables de la fermentación son especies autóctonas que se originan como
contaminantes naturales del proceso, incluidas levaduras (p. ej., especies de Pichia,
Debaryomyces, Sacharomyces y Candida), bacterias (p. ej., miembros de la familia
Enterobacteriaceae, bacterias del ácido láctico y Bacillus spp.) (Vinícius de Melo et. al.
2017)
Las principales levaduras fermentadoras aisladas del mucílago y que se han
identificado en trabajos anteriores son Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, C.
tropicalis, C. krusei, C. lipolytica, C. parasilpsis, C.pintolopesii productoras de etanol y
dióxido de carbono. Dentro de las BAL están Lactobacillus acidophilus, L. fermentum, L.
plantarum, Streptococcus faecalis productoras de ácido láctico, alcohol, ácido acético, ácido
fórmico y dióxido de carbono.
Es por ello que es importante realizar estudios sobre la microbiota relacionada al
proceso fermentativo del café a fin de obtener información sobre los microorganismos
relacionados con la mejora organoléptica de este producto, además de servir para futuras
investigaciones como el análisis de metabolitos derivados de microbios y el establecimiento
de cultivos iniciadores en el beneficio del café que garanticen la generación de bebidas de
alta calidad, la estandarización de procesos , la reducción de pérdidas económicas, y la
elaboración de un café de calidad.

II. Justificación

Diversos autores mencionan la relevancia de la fermentación en el desarrollo de atributos


sensoriales, aspectos que se evidencian en campo, cuando se retira el mucílago, y el
proceso de fermentación es casi nulo comparado con la fermentación en tanques tina
(lavado) (Suárez et al., 2015)
Y dentro de este proceso, se destaca la importancia de los microrganismos en el café, a
través de procesos de fermentación controlada, es relevante para desarrollar perfiles de
sabores, tal y como lo sugiere Melo et al., (2014), menciona que existe mucha más libertad
para impactar el desarrollo del aroma, en lo que influye la elección de la microbiota para la
fermentación, la cantidad de oxígeno, el tiempo y la temperatura de fermentación, el
envejecimiento y las condiciones de almacenamiento.
El proceso de fermentación tiene un efecto pronunciado sobre la calidad final del café
confiriéndole características especiales y valor agregado al café, mejorando su sabor y
aroma , ya que durante la fermentación se producen una amplia gama de metabolitos, como
ácidos orgánicos, alcoholes superiores y ésteres, que luego agregan complejidad y
profundidad al café. Es así que, aunque el principal sabor característico del café proviene de
la composición química del grano, la microbiota responsable de la fermentación también
puede contribuir a las características sensoriales de la bebida y otras cualidades debido a la
liberación de metabolitos y su difusión en los cerezos durante el proceso (Fernandez, 2023).

Durante la fermentación, se elimina la capa mucilaginosa y se le confieren características


especiales en cuanto a su sabor y aroma debido a la producción de una amplia gama de
metabolitos, como ácidos orgánicos, alcoholes y ésteres, que luego agregarán complejidad
al café (De Bruyn et al. ., 2016, citado en Fernandez, 2023). Si bien el principal sabor
característico del café proviene de la composición química del grano, algunos de los
metabolitos que contribuyen a las características sensoriales de la bebida son producidos
por la microbiota asociada al proceso de fermentación (Silva et al., 2013).

El mucílago, está compuesto de azúcares naturales y alcoholes, jugando un papel crucial en


el desarrollo del sabor final del café e influyendo en aspectos cruciales como la dulzura y la
acidez. Es importante que en el proceso de lavado el mucílago se elimine por completo,
dejando únicamente el sabor que se desarrolló en la estructura celular del grano antes de
haber sido recogido. En el proceso de lavado el mucílago se elimina mediante fermentación
(Método tradicional) o utilizando métodos mecánicos (Lee, 2015)

Es de anotar que, dentro de los grupos microbianos cultivables de interés en mucílago, la


búsqueda e identificación de bacterias Gram positivas y Gram negativas presente en el
proceso de fermentación de café exhiben interés por su capacidad de degradar los
compuestos presentes en el mesocarpio, en especial la conversión de azúcares en
compuestos orgánicos e inorgánicos de importancia en la calidad del producto final (Castro,
2019)

Según Ladino, 2017 en su investigación sobre “Caracterización de bacterias ácido lácticas,


hongos y levaduras que inciden durante el procesos de fermentación de café arábica
(Coffea arabica) y su influencia en el análisis sensorial y calidad de taza”, nos menciona que
la fermentación es un proceso catabólico en donde los azúcares se convierten en energía,
se produce etanol y ácido acético, láctico, butírico entre otros y debido a la presencia de los
ácidos butírico y propiónico en particular se presenta una pérdida en calidad debido a la
difusión al grano.
A un nivel socioeconómico, ante la baja producción de grano de café, una opción es vender
a mejores precios y por calidad; por ello es importante conocer el nivel y los perfiles
organolépticos del café, ya que permiten caracterizar la producción para diferentes nichos
de mercado. El comercio de café para el Perú representó $755.59 millones de dólares en el
año 2016; la producción de café orgánico representó el 26.35% (Ramos, 2019)
Pero un detalle con este punto es que a nivel del mercado internacional existen muchos
competidores, tal es el ejemplo de Vietnam y Brasil, los cuales tienen un costo operacional
mucho menor que el peruano, el problema viene ya que no puede abaratar los costos, debido a
que según el MINAGRI del 45 al 55% del presupuesto relacionados este mercado es destinado
a la contratación de mano de obra, debido al uso de métodos tradicionales y de la poca
tecnología, en ese contexto, es de vital importancia desarrollar tecnología para tanto acelerar
como mejorar el proceso de producción además de conseguir una mejor calidad en cuanto al
café,ya que únicamente el 2.4% es del llamado café de especialidad o gourmet.
III. Antecedentes

Según Ladino, 2017 en su investigación sobre “Caracterización de bacterias ácido lácticas,


hongos y levaduras que inciden durante el procesos de fermentación de café arábica
(Coffea arabica) y su influencia en el análisis sensorial y calidad de taza” pudo aislar y
caracterizar especies de bacterias ácido lácticas como levaduras, observándose que la
concentración de estos microorganismos varió dependiendo de la variedad de café y del
tiempo de fermentación, influyendo esto en la evaluación sensorial del producto final.

Haile (2019) señala que las cantidades de azúcares disponibles (como glucosa y fructosa) y
aminoácidos libres presentes en el grano, junto con el nivel de actividad microbiana y grado
de fermentación, son determinantes en la formación de concentraciones. Estas
concentraciones a su vez desempeñan un papel crucial en la generación de compuestos de
Maillard y sustancias volátiles durante la etapa de tostado. Además, el autor destaca la
importancia de elegir microorganismos adecuados que impacten positivamente en el perfil
de sabor y aroma del café durante la fermentación. Por lo tanto, es esencial ejercer un
control preciso sobre el proceso de fermentación para garantizar este efecto positivo en las
características sensoriales del café final.

Avallone (2001), menciona que si bien en una primera etapa de la fermentación la


microbiota del fruto del café está formada por bacilos aerobios Gram (-), tales como Erwinia
y Klebsiella, una vez ya avanzada la etapa fermentativa hubo un mayor incremento
poblacional se observó con bacterias ácido lácticas y levaduras, mientras que aquellos
microorganismos que contaron con un medio de pectina se mantuvieron constantes durante
la etapa de fermentación. Cualitativamente, las bacterias del ácido láctico pertenecían
principalmente a la especie Leuconostoc mesenteroides, pero las demás microfloras eran
relativamente heterogéneas.

Cruz-O'Byrne (2021) en su estudio sobre “Diversidad microbiana asociada al


proceso de fermentación espontánea del grano de café y la producción de cafés especiales
en el norte de Colombia” encontró una diversidad compuesta por 695 géneros bacterianos
y 156 fúngicos. La comunidad microbiana estaba dominada por la bacteria del ácido láctico
Leuconostoc, la levadura Kazachstania y la bacteria del ácido acético como las del género
Acetobacter.

Coronell & Herrera, 2022, en su estudio sobre la identificación de géneros


bacterianos fermentadores presentes en el mucílago del café durante el proceso de
fermentación de las muestras obtenidas de dos fincas de la Serranía del Perijá, Cesar, se
encontró un total de diez morfotipos, donde ocho corresponden a grupos de bacterias y dos
levaduriformes. Siendo las levaduras más frecuentes en el proceso de fermentación, en el
aislamiento microbiano realizado donde demuestra que al caracterizar la microbiota
ambiental de la pulpa del café, existía la presencia y abundancia de los principales géneros
de bacterias y levaduras, donde se encontraban bacterias que hacían parte de la familia
Enterobacteriaceae y Saccharomycetales con casi un 70 % de prevalencia para el género
de Lactobacillus spp. quien representa un papel importante en la fermentación del café, así
como también levaduras endófitas como las Saccharomycetales que presentaron una
frecuencia de hasta un 69,15 % en la pulpa del café en estado de fermentación

De igual forma, Nasanit R y Satayawut K, 2022 en un estudio realizado en Tailandia con


variedad Arábica donde se caracterizó las comunidades microbianas de la fermentación del
café, donde también se hizo presente el crecimiento de colonias correspondiente a
bacterias ácido lácticas como es el caso del género Lactobacillus, resultado el cual fue
similar a otras investigaciones de este tipo.
Fernandez-Güimac, 2023 En su estudio “Explorando la diversidad de microorganismos y la
actividad potencial de pectinasa aislada de la fermentación húmeda de café en el noreste de
Perú” evaluó la microbiota asociada a la fermentación del café de dos regiones del norte del
Perú. Aisló bacterias y hongos de fincas cafetaleras de las regiones Amazonas y Cajamarca
y se identificaron mediante marcadores moleculares 16S rRNA e ITS. Obteniéndose una
actividad pectinasa potencial que se registró mediante la formación de un halo transparente
alrededor de las colonias. Como resultado se encontró 29 y 9 especies pertenecientes a
bacterias y hongos, respectivamente
Vinicius (2014) informó sobre un enfoque experimental para la identificación y
selección de levaduras autóctonas de café y su uso potencial como cultivos iniciadores
durante el paso de fermentación del procesamiento húmedo. Un total de 144 aislados de
levadura que se originaron a partir de granos de café fermentados espontáneamente fueron
identificados mediante enfoques moleculares y evaluados en cuanto a su capacidad para
crecer en condiciones de estrés asociadas al café. Según la secuenciación del gen ITS-
rRNA, Pichia fermentans y Pichia kluyveri fueron los aislamientos más frecuentes, seguidos
de Candida Candida glabrata, quercitrusa, Saccharomyces sp., Pichia guilliermondii, Pichia
caribbica y Hanseniaspora opuntiae.

IV. Hipótesis
En las fermentaciones espontáneas del café es posible aislar y seleccionar
microorganismos que mejoran la taza/calidad del café
V. Objetivos
5.1 Objetivo General
- Aislar y caracterizar microorganismos de interés organoléptico, fermentadores del
mucílago del café, provenientes de la empresa cafetalera Monreal SAC, ubicada en
la localidad de Villa Rica.
5.2 Objetivos específicos
- Aislar bacterias y caracterizar morfológica, fisiológica y microscópicamente
bacterias ácido lácticas (Lactobacillus plantarum) y bacterias (Leuconostoc
mesenteroides) encargados de la fermentación del mucílago del café
- Aislar bacterias y caracterizar morfológica, fisiológica y microscópicamente
levaduras (Saccharomyces cerevisiae, Pichia fermentas y Pichia guilliermondii)
encargados de la fermentación del mucílago del café
- Obtener un cepario de los microorganismos aislados para investigaciones futuras.
VI. Materiales y métodos
6.1 Material biológico
Se utilizaron los frutos de café provenientes de fincas de la empresa cafetalera
Monreal SAC, ubicada en Villa Rica
6.2 Procesamiento de la muestra

6.2.1 Fermentación.
Una vez recepcionada la muestra se dispone a someterlas a un proceso de
fermentación a fin de generar un aumento en la biomasa, para ello se dispone en un
recipiente cerrado y estéril la muestra hasta una altura de 11 cm, tomando tiempos de
fermentación de 18, 24 y 30 horas, teniendo en cuenta parámetros como la temperatura,
humedad y sólidos solubles.
Una vez culminado el tiempo de fermentación, se procede a homogeneizar la
muestra y obtener el extracto para las pruebas de aislamiento.
6.2.2 Aislamiento de microorganismos
6.2.2.1 Aislamiento de bacterias ácido lácticas
Para el aislamiento de bacterias ácido lácticas tales como Lactobacillus plantarum,
se realiza en agar MRS. Posteriormente, se procede a realizar diluciones seriadas con
solución salina estéril (0.85%) hasta 10-6 en 6 tubos de ensayo previamente llenados con
9ml de SSE. Se añade 1 ml del fermento de café al primer tubo y se prosiguió con las
diluciones. Para sembrar se usó la técnica de diseminación, en donde usando la pipeta se
tomó 1 ml del tubo con la dilución 10-6 y se colocó en la placa de Petri, posteriormente, se
usó el asa Digralsky y mediante un movimiento circular se esparció la muestra. Luego,
mediante el uso de Parafilm se selló la placa y se la etiquetó. Finalmente, se incubó la
muestra de 24 a 48 horas a 37°C

Para esta bacteria (Leuconostoc mesenteroides) en específico, se utiliza, el medio


Mayeux, el cual consta de Peptona 10 g, extracto de levadura 5 g, sacarosa 100 g, citrato
de sodio 1 g, glucosa 5 g, gelatina 2.5 g, agar 15 g en un litro de agua destilada.
Posteriormente, se sometió a calentamiento hasta hervir durante aproximadamente 2
minutos, procediéndose a esterilizar. Finalmente se siembra y se procede con la incubación
a 37°C de 12 a 48h
6.2.2.3 Aislamiento de levaduras Saccharomyces
Para el aislamiento de las levaduras procedentes de este proceso de fermentación
se siembra en placas con Agar YPG a un pH de 5.5 +Cloranfenicol (0.04%) con la finalidad
de evitar el crecimiento bacteriano , adicionando metabisulfito de sodio (200 mg/L), debido a
la tolerancia de cepas saccharomyces a este compuesto. Posteriormente se procede a
sembrar en placas y finalmente se pone a incubar a 30°C durante 72 horas.
6.2.2.3 Aislamiento de levaduras no Saccharomyces
Para el aislamiento de levaduras del grupo no Saccharomyces lo que realiza es la
siembra en agar lisina (0.056%) o amonio (0.056%) como fuente de nitrógeno, para
posteriormente incubarlas a 30°C por un tiempo de 24 a 48h.
Posterior a eso, de las colonias aisladas, se dispondría a un chromAgar para
detectar la presencia de Pichia guilliermondii y Pichia fermentans.
6.2.3 Caracterización morfológica
6.2.3.1 Caracterización morfológica de bacterias
Para la obtención de características macroscópicas, a nivel de colonia se observaron la
forma, color y textura de las colonias.
Posteriormente se realiza una coloración Gram, para después analizar cada una de las
cepas obtenidas mediante la observación microscópica, analizando en bacterias la forma
celular (cocos, bacilos, espirilos, cápsulas,etc.).

6.2.3.2 Caracterización de levaduras


Para las levaduras, de igual forma se evaluaron características como el color, consistencia y
forma de las colonias.

6.2.4 Caracterización bioquímica de bacterias


Para la caracterización bioquímica, se realiza la fermentación de azúcares (para el caso de
Leuconostoc), tales como arabinosa, celulosa, fructosa, sacarosa, trehalosa, crecimiento a
ph 4.8, crecimiento a 10% de etanol.
Para el caso de Lactobacillus plantarum, se realiza las siguientes pruebas de fermentación
de azúcares (Glucosa, Lactosa, Maltosa, Manitol, Manosa, Melobiosa, Rafinosa, Ramnosa,
Ribosa, Sorbitol, Sucrosa, Trialosa, Xilosa)
Para las pruebas se prepara un caldo de fermentación con extracto de levadura y peptona
de carne más los distintos carbohidratos (con los azúcares mencionados anteriormente) al
1%, adicionalmente se añadió una solución de púrpura de bromocresol para indicar la
producción de ácidos orgánicos al momento en que el medio vire de color púrpura a un
color amarillo. Se preparó la batería de tubos para las cepas seleccionadas y se dejó
incubando a 30°C hasta realizar la lectura. (Huamán 2010)

6.2.4.2 Caracterización bioquimica de levaduras


Para las pruebas se prepara un caldo de fermentación con extracto de levadura y peptona
de carne más los distintos carbohidratos (glucosa, lactosa, fructosa, galactosa, xilosa,
rafinosa y celobiosa) al 1%, adicionalmente se añadió una solución de púrpura de
bromocresol para indicar la producción de ácidos orgánicos al momento en que el medio
vire de color púrpura a un color amarillo. Se preparó la batería de tubos para las cepas
seleccionadas y se dejó incubando a 30°C hasta realizar la lectura. (Huamán 2010)

VII. Cronograma de actividades

Actividad Meses

S O N D E F M A M J J A
Revisión bibliográfica x x x x
Aislamiento x x
Purificación x x
Caracterización x x x
Pruebas bioquímicas x x x
Elaboración del escrito x x x x x x

VIII. Presupuesto

Bienes 0
Material de Laboratorio 500
Material de Limpieza 100
Material de procesamiento automático de datos 2200
Medicinas 10
Material químico 600
Impresos 50
Materias primas 0
Materiales de impresión 500
Material de escritorio 100
Equipos de comunicación 500
Equipos de laboratorio 10000
Mobiliario en general 500
Equipos de cómputo 1800
Equipos de oficina 100
Equipo electrodoméstico 700
Enseres 30
Servicios 100
Movilidad local 30
Viáticos y alojamiento 300
Pasaje 150
Encuadernación, anillados y empastados 100
Fotocopias y transparencias 20
Otros 0
TOTAL 18390

Fuente de financiamiento: Laboratorio de Bioprocesos Industriales

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