UNIVERSIDAD JUSTO SIERRA

ESCUELA DE MEDICINA

ACADEMIA DE CIENCIAS BIOMÉDICAS

MANUAL DE PRÁCTICAS:

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BIOQUÍMICA HUMANA

PROFESORES QUE IMPARTEN LA ASIGANTURA:

cDR. en C. MARIA DEL PILAR MÁRQUEZ BECERRA

DR. ROGELIO ARTEAGA TLECUITL

DRA. STEPHANY MONTSERRAT GUTIÉRREZ MARTÍNEZ

Ciudad de México
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 2023-2

INDICE

REGLAMENTO DE LABORATORIO

SISTEMA DE EVALUACIÓN

Practica No. 1. Conocimiento del Material y Equipo más Utilizado en el

Laboratorio de Bioquímica Humana

Practica No. 2. Toma de Muestra de Sangre Venosa

Práctica No. 3. Cinética Enzimática

Práctica No. 4. Determinación de Glucosa Pre y Post-Pandrial

Práctica No. 5. Prueba de Tolerancia a la Glucosa Oral (PTGO)

Práctica No. 6. Determinación de Hemoglobina Glicosilada

Práctica No. 7. Determinación de Triacilgliceroles y Colesterol

Práctica No.8. Determinación de HDL, LDL y no-HDL-c

Práctica No. 9. Determinación de Transaminasas Séricas

Práctica No. 10. Determinación de Urea y Ácido Úrico

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 REGLAMENTO DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA HUMANA.

1.- Únicamente serán aceptados los alumnos inscritos en la lista oficial del grupo
correspondiente.

2.- Los alumnos deberán presentarse a su clase a la hora establecida en el horario de su

grupo, la tolerancia para ingresar al aula o laboratorio será de 10 minutos después de la
hora de entrada en el caso de las clases que empiezan a las 7:00 h y de 5 minutos en las
clases subsecuentes. Posterior a ese tiempo la entrada del alumno será a criterio de los
profesores, pero NO le contará la asistencia. Una vez iniciada la clase ningún alumno
podrá salir del aula o del laboratorio a excepción de alguna indicación de los profesores.

3.- Para la justificación de alguna inasistencia deberá hacerse dentro de un periodo de 48

horas a partir de que el alumno reanude sus clases en la Coordinación Académica. La
justificación médica debe ser de una Institución del Gobierno (IMSS, SSA, etc). Si no se
cumplen estos dos requisitos el alumno tendrá falta en esa práctica.

4.- El acceso al aula y al laboratorio será con el uniforme de la Escuela, la bata estará
completamente abotonada. Está prohibido introducir alimentos, bebidas, aparatos
electrónicos funcionando. Las mochilas se pondrán en el lugar que indiquen los
profesores(as) y se mantendrán libres los pasillos y accesos.

5.- Al inicio del curso se formarán equipos de trabajo, se nombrará un encargado por cada
equipo. NO HAY POSIBLIDAD DE CAMBIO DE EQUIPO de trabajo, NI ENTREGAS
INDIVIDUALES DE REPORTE O TRABAJO DE INVESTIGACIÓN.
6.- Durante el desarrollo de la práctica los alumnos permanecerán en su mesa de trabajo
(al menos que reciban otra indicación de los profesores-as).

Las comunicaciones durante el desarrollo de la práctica deberán hacerse en un tono y

lenguaje adecuado. Si algún alumno no cumple con estas dos normas abandonará el
laboratorio, se le reportará a la dirección y no tendrá asistencia en esa práctica.

7.- Los integrantes de cada equipo tienen la responsabilidad y obligación de colaborar

para la obtención de muestras biológicas en forma rotatoria cuando así se requiera,
estando supervisados por los profesores(as). Cada equipo deberá traer marcador
indeleble a cada práctica.

8.- El material de cada práctica se entregará mediante el vale correspondiente al equipo.

El cual dejará una credencial vigente como aval, siendo responsable del deterioro del
mismo todos los integrantes del equipo. El material deteriorado o extraviado deberá
reponerse por los integrantes del equipo en un plazo de una semana, de lo contrario se
les negará el acceso al laboratorio o a presentar el examen del periodo
correspondiente.
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9.- Todos los miembros del equipo tienen la obligación de cooperar en la limpieza y
buena conservación del equipo y material, éste último será devuelto al almacén en las
mismas condiciones en que se les entregó (completo, limpio, seco) y no podrán retirarse
hasta que sea recibido de conformidad por los profesores (as).

10.- Los integrantes de cada equipo serán responsables de mantener limpias las cubiertas
de las mesas de trabajo, áreas correspondientes y dejar en su lugar los bancos.

11.- Cada alumno debe imprimir un manual de laboratorio a doble página por cuartilla,
engargolarlo en color AZUL, traerlo cada sesión práctica y utilizarlo como bitácora de
trabajo.

12.- Cada alumno debe conocer previamente la práctica a realizarse en cada sesión.

13.-Los profesores(as) estarán pendientes de la asistencia, disciplina, participación,

desarrollo del trabajo, cumplimiento de este reglamento.

14.- Para cualquier aclaración de calificaciones, se dirigirán a los profesores(as) al

finalizar la sesión; sólo en el caso le aclaraciones sobre la calificación del examen parcial,
estas deberán realizarse en el momento que se les da la revisión de su examen.

15. El representante del equipo se encargará de las entregas electrónicas de reportes de

prácticas y trabajo de investigación a través de las asignaciones por teams en el canal de
la materia correspondiente.

16.- Los reportes de práctica y trabajo de investigación se entregan por equipo, de forma
electrónica, a través del representante del equipo y ÚNICAMENTE en la ASIGNACIÓN
correspondiente (las entregas realizadas fuera de la asignación correspondiente NO
SERÁN EVALUADAS)

ATENTAMENTE.

Los profesores (as) de la asignatura.

SISTEMA DE EVALUACION

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1.-Se aplicará el siguiente porcentaje para cada una de las tres calificaciones
parciales: TEORIA 70%, LABORATORIO 30%

2.- El 30 % correspondiente a laboratorio o actividades prácticas, se integra de la

siguiente manera:

 10% Examen parcial (INDIVIDUAL)

20% Reportes de prácticas:

3.- El examen final de las asignaturas teórico- prácticas se integrará por:

 70% Examen final

 30% Revisión bibliográfica:
o Avances del trabajo + escrito final 15%
o Exposición del trabajo 10%
o Asistencia y participación en las JORNADAS MÉDICAS 5%

El trabajo escrito se revisará en forma periódica a lo largo del semestre (fechas

estipuladas en el calendario de actividades del laboratorio) en formato electrónico.

4.- Para tener derecho a los exámenes parciales el alumno deberá contar con el
80% de asistencia tanto en las actividades teóricas como prácticas

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 PRACTICA No. 1

CONOCIMIENTO DEL MATERIAL Y EQUIPO MÁS UTILIZADO EN EL LABORATORIO

DE BIOQUÍMICA HUMANA

OBJETIVOS.

 Conocer el espacio físico y las instalaciones del laboratorio de Bioquímica Humana

 Conocer las medidas de bioseguridad necesarias para el trabajo en un laboratorio

de docencia como el laboratorio de Bioquímica Humana

 Identificar, conocer y utilizar el material y equipo de laboratorio de manera correcta

 Conocer los procedimientos de solicitud, trabajo y devolución de material.

 Conocer los procedimientos para la disposición de residuos del laboratorio de

Bioquímica Humana.

INTRODUCCIÓN.

El laboratorio de Bioquímica Humana es un espacio destinado a la experimentación que

permita a los estudiantes de la licenciatura de medicina ponerse en contacto con el
método científico para conocer y aplicar algunas técnicas relacionadas con el diagnóstico,
control y seguimiento de diversas patologías, y que adicionalmente le permitan integrar
los conocimientos adquiridos en las sesiones teóricas.

Según la clasificación de la OMS, el laboratorio de Bioquímica Humana es un laboratorio

básico con nivel de bioseguridad 1, debido a que es un laboratorio de enseñanza, y por lo
tanto es importante considerar las siguiente medidas de seguridad en cuanto a (OMS,
2005):

Protección personal
1. Se usarán en todo momento monos, batas o uniformes especiales para el trabajo en el
laboratorio.
2. Se usarán guantes protectores apropiados para todos los procedimientos que puedan entrañar
contacto directo o accidental con sangre, líquidos corporales y otros materiales potencialmente
infecciosos o animales infectados. Una vez utilizados, los guantes se retirarán de forma aséptica y
a continuación se lavarán las manos.
3. El personal deberá lavarse las manos después de manipular materiales y animales infecciosos,
así como antes de abandonar las zonas de trabajo del laboratorio.
4. Se usarán gafas de seguridad, viseras u otros dispositivos de protección cuando sea necesario
proteger los ojos y el rostro de salpicaduras, impactos y fuentes de radiación ultravioleta artificial.
5. Estará prohibido usar las prendas protectoras fuera del laboratorio, por ejemplo en cafeterías,
oficinas, bibliotecas, salas para el personal y baños.
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6. No se usará calzado sin puntera.
7. En las zonas de trabajo estará prohibido comer, beber, fumar, aplicar cosméticos o manipular
lentes de contacto.
8. Estará prohibido almacenar alimentos o bebidas para consumo humano en las zonas de trabajo
del laboratorio.
9. La ropa protectora de laboratorio no se guardará en los mismos armarios que la ropa de calle.

Procedimientos
1. Estará estrictamente prohibido pipetear con la boca.
2. No se colocará ningún material en la boca ni se pasará la lengua por las etiquetas.
3. Todos los procedimientos técnicos se practicarán de manera que se reduzca al mínimo la
formación de aerosoles y gotículas.
4. Se limitará el uso de jeringuillas y agujas hipodérmicas, que no se utilizarán en lugar de
dispositivos de pipeteo ni con ningún fin distinto de las inyecciones por vía parenteral o la
aspiración de líquidos de los animales de laboratorio.
5. Todos los derrames, accidentes y exposiciones reales o potenciales a materiales infecciosos se
comunicarán al supervisor del laboratorio. Se mantendrá un registro escrito de esos accidentes e
incidentes.
6. Se elaborará y seguirá un procedimiento escrito para la limpieza de todos los derrames.
7. Los líquidos contaminados deberán descontaminarse (por medios químicos o físicos) antes de
eliminarlos por el colector de saneamiento. Puede ser necesario un sistema de tratamiento de
efluentes, según lo que indique la evaluación de riesgos del agente con el que se esté trabajando.
8. Los documentos escritos que hayan de salir del laboratorio se protegerán de la contaminación
mientras se encuentren en éste.

Zonas de trabajo del laboratorio

1. El laboratorio se mantendrá ordenado, limpio y libre de materiales no relacionados con el trabajo.
2. Las superficies de trabajo se descontaminarán después de todo derrame de material
potencialmente peligroso y al final de cada jornada de trabajo.
3. Todos los materiales, muestras y cultivos contaminados deberán ser descontaminados antes de
eliminarlos o de limpiarlos para volverlos a utilizar.
4. El embalaje y el transporte de material deberán seguir la reglamentación nacional o internacional
aplicable.
5. Las ventanas que puedan abrirse estarán equipadas con rejillas que impidan el paso de
artrópodos.

Gestión de la bioseguridad
1. Incumbirá al director del laboratorio (la persona que tiene responsabilidad inmediata respecto del
laboratorio) garantizar la elaboración y la adopción de un plan de gestión de la bioseguridad y de
un manual de seguridad o de operación.
2. El supervisor del laboratorio (que dependerá del director) velará por que se proporcione
capacitación periódica en materia de seguridad en el laboratorio.
3. Se informará al personal de los riesgos especiales y se le exigirá que lea el manual de seguridad
o de trabajo y siga las prácticas y los procedimientos normalizados. El supervisor del laboratorio se
asegurará de que todo el personal los comprenda debidamente. En el laboratorio estará disponible
una copia del manual de seguridad o de trabajo.
4. Habrá un programa de lucha contra los artrópodos y los roedores.
5. Se ofrecerá a todo el personal en caso de necesidad un servicio apropiado de evaluación,
vigilancia y tratamiento médico, y se mantendrán los debidos registros médicos.

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Debido a lo anterior es necesario en primer lugar dar a conocer a los alumnos el equipo y
material de laboratorio para que puedan hacer uso adecuado de él sin correr riesgos
innecesarios.

MATERIAL Y EQUIPOS DEL LABORATORIO.

Los materiales que se utilizan habitualmente en el laboratorio son de vidrio, plástico o

porcelana.

Las principales ventajas que hacen que elijamos uno u otro de estos materiales son:
• Vidrio. Su gran estabilidad y óptima resistencia térmica.
• Plástico. Es económico, apropiado para contener soluciones alcalinas y sirve para
fabricar materiales desechables.
• Porcelana. De gran utilidad cuando se requiere una gran resistencia térmica.

Existen diferentes tipos de vidrio, los cuales varían en su composición. En el laboratorio

se manejan los vidrios de borosilicato (Pirex®, Kimax®, etc.) que resisten al calor, a los
ataques de productos químicos y que no varían excesivamente de volumen con la
temperatura, entre otras ventajas. Otra modalidad de vidrio, el de aluminosilicato
(Corex®), es aún más resistente que los anteriores a la rotura y al rayado.

Los materiales de plástico presentan otras virtudes. Por ejemplo, las puntas de las pipetas
de pistón son de plástico y desechables, por lo que no contaminan las disoluciones en las
que las introducimos y no recogen agua por su parte externa, no siendo así necesaria su
limpieza. Además, existen materiales plásticos que pueden ser utilizados a temperaturas
elevadas, aunque, habitualmente, no tanto como el vidrio, y que resisten métodos de
esterilización agresivos como son el autoclavado y el calor seco.

MATERIAL DE VIDRIO.

Los materiales que se fabrican en vidrio son diversos y pueden dividirse en dos grupos:
volumétricos y no volumétricos:

MATERIALES VOLUMÉTRICOS

Pipetas de vidrio: Son cilindros cortos cerrados, graduados y calibrados. Se utilizan para
medir volumenes entre 0.1 y 25 mL. Hay de dos tipos: graduadas y volumétricas y de
estas últimas hay dos subtipos: terminales y subterminales. Las terminales contemplan el
volumen de la punta dentro de su graduación y las subterminales no, por lo que hay que
verificar que tipo es el que estamos manejando. Se fabrican en diferentes volumenes (1,
2, 5, 10, 25 ml) y se distinguen por un código de color.

Pipetas de pistón o micropipetas. Son dispositivos dispensadores para medir

volúmenes principalmente entre 1 y 1000 μL (aunque también se fabrican en 1, 5, 10 y 20

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mL). Se pueden encontrar dos tipos: volumen fijo o volumen variable. Cuentan con un
dispositivo que controla el pistón, con tres posiciones: Reposo, Carga y Descarga.

Es necesario utilizar una punta en el extremo de la micropipeta para su uso, estas puntas
tienen diferentes tamaños y colores de acuerdo al volumen que pueden contener, se
venden por separado y son desechables.

Probeta: Son cilindros cerrados de mayor longitud que los tubos de ensayo o vasos de
precipitado, son materiales graduados y calibrados por lo que su principal aplicación es
para medir volúmenes mayores a 25 mL. Se fabrican en diversos tamaños: 25, 50, 100,
250, 500 y 1000 mL (las de mayor capacidad también se fabrican en plástico).

Bureta: Son cilindros largos cerrados de diámetro pequeño con una válvula que controla
el flujo de salida en uno de los extremos. Son materiales graduados y calibrados que se
utilizan para dispensar con precisión volúmenes de liquido a un contenedor. Su principal
aplicación es la titulación, proceso en el que se añade una solución patrón a una muestra
problema hasta alcanzar un punto final. Se fabrican en volúmenes de 25, 50, 100 mL y
para su uso se colocan en un soporte universal sujetadas con pinzas para bureta.

Matraz aforado o volumétrico: Son recipientes con forma de globo, cuello largo de punta
esmerilada y tapón esmerilado que sella herméticamente. Este material es calibrado y
cuenta con una sola graduación llamada AFORO. SE utilizan para la preparación de
soluciones que requieren de precisión alta, por ejemplo soluciones molares. Los
volumenes en que los podemos encontrar son: 5, 10, 25, 50, 100, 250 y 1000 mL.

MATERIALES NO VOLUMÉTRICOS

Tubos de ensayo: Son cilindros cerrados, no graduados ni calibrados. Se clasifican por

su tamaño medido en diámetro interior y longitud total expresados en milimetros, por
ejemplo 13 x 100. Se pueden encontrar con tapa de rosca o sin tapa, con o sin labio. Se
utilizan para realizar reacciones y pruebas químicas a pequeña escala, para hacer cultivo
de microorganismos en medio sólido y para la preparación de diluciones.

Vaso de precipitado: Son cilindros cerrados de mayor diámetro que los anteriores. Son
materiales graduados pero no calibrados por lo que no se utilizan para medir volumenes.
Se fabrican en diversos tamaños: 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000 y 5000 mL son los mas
comunes. Se utilizan para mezclar sustancias, para contener líquidos no volátiles, para
almacenar soluciones y para calentar líquidos.

Matraz erlenmeyer: Son materiales de forma cónica, graduados pero no calibrados. Se

fabrican en diferentes volumenes: 50, 100, 250, 500 y 1000 mL. Su uso es muy similar al
de los vasos de precipitado pero además pueden ocuparse para contener y almacenar
sustancias vólatiles, ya que por su forma se reduce la posibilidad de evaporación, y
también pueden utilizarse para cultivar organismos en medio líquido o sólido.

Pipeta Pasteur: Cilindro con punta delgada y larga, no graduada ni calibrada que se
fabrica en vidrio común y es desechable. Se utiliza para extraer volúmenes pequeños (sin

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cuantificarlos) de líquidos o para adicionarlos por goteo. Para su uso se requiere colocar
en el extremo mas ancho un bulbo de latex que es reutilizable.

Embudo de vidrio: Material cónico fabricado en vidrio común, que se utiliza para
transvasar líquidos a un recipiente de boca estrecha o bien para filtrar con la ayuda de
diferentes tipos de filtros. Los hay de varios tamaños y se pueden encontrar también de
plástico.

Varilla de vidrio: Se fabrican con vidrio común y se utilizan para agitar soluciones.

Termómetro de vidrio: Son materiales calibrados y graduados que se utilizan para la

medir la temperatura de líquidos. Su uso requiere cuidado debido a que contienen
mercurio.

OTROS.

Mesa de Trabajo: Es una mesa de superficie lisa generalmente fabricada en acero

inoxidable donde se realizan los procedimientos experimentales. En este espacio se
encuentran además instaladas tuberías con salidas de agua, gas, aire y/o electricidad; y
cuenta con una tarja para el lavado del material. Debe mantenerse despejada y limpia.

Mesa de granito. Es una mesa fabricada en granito que requiere una instalación especial
para que garantice una superficie lisa, plana y nivelada. En ella se coloca equipo analítico
que debe mantenerse fijo, como el espectrofotómetro y las balanzas analíticas.

Soporte universal: Es una base metálica con una varilla en la que se colocan diversos
tipos de pinzas para soportar equipo o materiales de laboratorio como las buretas.

Pinza para tubos de ensayo: Se utiliza para sostener o transportar tubos de ensayo a
altas o bajas temperaturas para evitar el contacto con la piel.

Pinza para bureta: Se utiliza para sostener las buretas en el soporte universal.

Gradilla: Base metálica o plástica que se utiliza para contener, soportar y/o transportar
varios tubos de ensayo en un mismo tiempo.

Escobillón: Se utiliza para lavar el material de vidrio y existen de diferentes tamaños.

Agitadores magnético (mosca): Son magnetos recubiertos con plástico para agitar
soluciones en la parrilla de agitación. Se fabrican en diversos tamaños.

Propipeta: Es una perilla de caucho que se adapta a las pipetas de vidrio para succionar
y expulsar líquidos, tiene tres válvulas: S, E y A. La válvula A se utiliza para expulsar el
aire y hacer vacío, la S se utiliza para succionar el líquido y la válvula E para expulsarlo.
Existen también propipetas con un sistema de embolo y perilla de succión.

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Pizeta: Recipiente de plástico que se utiliza para dispensar líquidos. Generalmente se
utiliza con agua destilada para la preparación de soluciones y enjuagado del material
después del lavado.

Mortero y pistilo: Estos materiales se fabrican en porcelana generalmente y se utilizan

para triturar y pulverizar sustancias sólidas.

Espátula: Son paletas fabricadas en plástico o acero inoxidable, de diversos tamaños y

que se usan para tomar sustancias sólidas y vertirlas en otro lugar, se utilizan sobre todo
para pesar los reactivos.

Palangana: Son recipientes de plástico que se usan para transportar y contener el

material de vidrio y plástico.

EQUIPO DE EXTRACCIÓN DE SANGRE

Para la extracción de muestras de sangre se pueden utilizar dos sistemas: jeringa o

sistema Vacutainer.

Las jeringas utilizadas son generalmente de 3 y 5 mL. Mientras que el sistema vacutainer
consta de camisa o holder, aguja y tubo para recepción de muestra.

Existen varios tipos de Vacutainer que se diferencian por el color de su tapón. Cada color
de tapón indica el aditivo, o ausencia del mismo, contenido en el tubo, por ejemplo, los
tubos de tapón color rojo no contienen reactivo, los tubos de tapón color lila o violeta
contienen EDTA, los de tapón celeste contienen citrato, etc.

Las ventajas del Vacutainer son que la persona que toma la muestra no entra en contacto
con la aguja, evitando así el riesgo de contagio, y adicionalmente se pueden obtener
varias muestras a partir de la misma punción que pueden dirigirse a diversos estudios.

En cualquiera de los dos casos se requiere además de ligadura, torundas con alcohol y
parches.

EQUIPO DE LABORATORIO.

Balanzas: Son instrumentos que se utilizan para averiguar la masa de un cuerpo. Se

clasifican en mecánicas y electrónicas:
1. Balanzas mecánicas.
Granatarias: De uno o dos platillos. Este tipo de balanza se basa en comparar el peso del
cuerpo a determinar, con otros cuerpos de peso conocido. Esto se logra ajustando unos
pesos móviles hasta lograr el equilibrio de la misma.

Analíticas: El principio de funcionamiento es el mismo pero ofrecen mayor precisión y son

mas sensibles. Característicamente, estas balanzas se encuentran dentro de una cámara
en forma de vitrina y deben estar en un lugar del laboratorio sin vibraciones ni corrientes
de aire y sobre un soporte muy estable.
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2. Balanzas electrónicas. Se consideran las más difundidas en la actualidad. Disponen de
un plato en el que se coloca el objeto cuya masa se quiere saber. El peso se mide
mediante un mecanismo electrónico.
Para su correcto funcionamiento, una balanza debe estar correctamente nivelada sobre
una superficie rígida. La balanza debe ser calibrada periódicamente y cada vez que se
traslada de lugar.

Potenciometro: Es el aparato que mide la concentración de hidrogeniones que tiene una

solución a través de un electrodo de vidrio con el que cuenta. Así, podemos caracterizar la
solución respecto a su grado de acidez-alcalinidad. Para su calibración diaria se requiere
de un par de buffers de pH conocido. Es necesario mantener el electrodo siempre limpio y
sumergido en la solución de almacenamiento o en agua destilada, además e manipularlo
con precaución pues el vidrio es extremadamente delgado y se rompe fácilmente.

Centrífuga: La centrífuga sirve para separar mezclas en función de su densidad mediante

la acción de la fuerza centrífuga. En ella, las sustancias más densas tienden a colocarse
en el fondo del tubo, al contrario que las que lo son menos. Es muy importante escoger
tubos adecuados y equilibrarlos en la balanza granataria de dos platillos antes de
colocarlos en el rotor de la centrífuga. Existen diversos tipos y tamaños de centrifugas.

Espectrofotómetro: Es un aparato utilizado para la identificación de sustancias o a la

determinación de la concentración de una sustancia en una disolución. Es posible realizar
la identificación o la medición cuantitativa en virtud de las interacciones que se producen
entre la radiación electromagnética y la materia.

Este equipo tiene los siguientes componentes:

• Fuente de radiación electromagnética. Lámparas de diversos tipos.
• Monocromadores. Seleccionan de una determinada longitud de onda
• Cubetas o celdas para la muestra. De cristal o plástico para el visible, de cuarzo para el
ultravioleta y de vidrio de silicato para el infrarrojo.
• Detectores de la radiación electromagnética. Reciben la radiación y la convierten en una
corriente eléctrica o temperatura.
• Elementos para el análisis y el registro de datos. La corriente eléctrica o el dato térmico
debe convertirse en una cifra que nos indique la presencia y/ o cantidad de la sustancia
que queremos analizar.

Parrilla eléctrica o placa calefactora. Se utilizan para calentar mediante calor seco
sustancias para concentrar el soluto, evaporar el disolvente o simplemente alcanzar una
temperatura de reacción apropiada. Algunas tienen además agitadores magnéticos para
la mezcla de sustancias al mismo tiempo que se calientan.

Baño maría: Se utiliza para realizar pruebas serológicas y procedimientos de incubación,

aglutinación, inactivación, biomédicos, farmacéuticos y hasta industriales. Por lo general,
se utilizan con agua, pero también permiten trabajar con aceite. Los rangos de

12
temperatura en los cuales normalmente son utilizados están entre la temperatura
ambiente y los 60 °C.

Campana de extracción: Es un equipo que consta de un ventilador para extraer el aire y

evacuarlo a un sitio específico que generalmente forza el paso del gas por un filtro. Dentro
de la campana se manipulan todas aquellas sustancias que son vólatiles, tóxicas y/o
corrosivas para proteger al usuario de la exposición a las mismas.

MANIPULACIÓN Y DISPOSICIÓN DE DESECHOS

Se considera desecho todo aquello que debe descartarse. En los laboratorios, la

descontaminación y la eliminación de desechos son operaciones estrechamente
relacionadas. En el trabajo cotidiano, son pocos los materiales contaminados que es
preciso retirar del laboratorio o destruir. La mayor parte de la cristalería, los instrumentos y
la ropa del laboratorio vuelve a utilizarse o se recicla. El principio básico es que todo el
material infeccioso ha de ser descontaminado, esterilizado en autoclave o incinerado.

Deberá adoptarse un sistema de identificación y separación del material infeccioso y sus

recipientes. Se seguirán las normas nacionales e internacionales y se tendrán en cuenta
las siguientes categorías (OMS, 2005):

1. Desechos no contaminados (no infecciosos) que puedan reutilizarse o reciclarse o

eliminarse como si fueran «basura» en general.
2. Objetos cortantes y punzantes contaminados (infecciosos): agujas hipodérmicas,
bisturís, cuchillas, vidrio roto; se recogerán siempre en recipientes a prueba de
perforación dotados de tapaderas y serán tratados como material infeccioso.
3. Material contaminado destinado al tratamiento en autoclave que después pueda lavarse
y volverse a utilizar o reciclarse.
4. Material contaminado destinado al tratamiento en autoclave y a la eliminación.
5. Material contaminado destinado a la incineración directa.

En el caso del laboratorio de Bioquímica Humana se contemplan los siguientes

contenedores para la disposición de los residuos:

A. Basura común. Para desechos no contaminados (no infecciosos).

B. Contenedor rojo carcasa dura. Para cortantes y punzocortantes contaminados
(infecciosos)
C. Contenedor rojo. Para material contaminado (infeccioso) no cortante o
punzocortante.
D. Contenedor amarillo. Para residuos biológicos como tejidos.

En el caso de las muestras sanguíneas, estas se vaciaran en una bolsa roja con un
apósito de gasa o algodón y se depositarán en el departamento de SELLE para su
disposición inmediata.

METODOLOGÍA.

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 1. Los alumnos recibirán una palangana con una muestra del material más utilizado
en el laboratorio de Bioquímica Humana.

2. Escucharan las indicaciones sobre el uso y aplicación respecto de cada material..

3. Los profesores harán una demostración de los principales materiales y equipos

utilizados en el laboratorio de Bioquímica Humana.

4. Los alumnos manipularan los materiales y practicaran el pipeteo con las pipetas
graduadas y las micropipetas.

5. Los alumnos conocerán el funcionamiento de los principales equipos del

laboratorio y utilizarán la balanza y centrifuga.

REPORTE.

En la sección de resultados realizar una tabla monográfica de los materiales y equipos

presentados, incluyendo dibujos y notas que resalten su uso, aplicación o precauciones
de uso.

CUESTIONARIO.

1.- Escriba al menos 3 recomendaciones de seguridad para el trabajo de un laboratorio

básico de riesgo de bioseguridad nivel 1, como el de Bioquímica Humana.

2.- Describa el procedimiento para tomar una muestra líquida utilizando una micropipeta.

3. Describa el procedimiento correcto para aforar una solución utilizando un matraz

volumétrico

4. Describa de manera general el funcionamiento del espectrofotómetro e indique el rango

que según la ley de Lambert – Beer debe considerarse para su uso.

14
 PRÁCTICA No. 2

TOMA DE MUESTRA DE SANGRE VENOSA

OBJETIVOS.

 Enseñar a los alumnos la técnica correcta para la extracción de una muestra

venosa por el método de extracción al vacio.

 Instruir a los alumnos en la toma de muestra sanguínea venosa.

 Hacer la diferenciación entre suero y plasma.

INTRODUCCIÓN.

TOMA DE MUESTRAS EN EL LABORATORIO CLINICO

El médico utiliza los resultados obtenidos por un laboratorio clínico como medio de ayuda
para el diagnostico de la enfermedad y el adecuado tratamiento del paciente.

Uno de los primeros aspectos a considerar en el laboratorio es la toma, manipulación y

procesamiento de las muestras que serán sujeto de análisis. Así las muestras solicitadas
para los análisis clínicos pueden ser, de diversos tipos:

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MUESTRAS SANGUINEAS.

Son las muestras más solicitadas por sus componentes y su importancia para el
diagnóstico. Las punciones venosas se deben estandarizar en términos de la hora de
recolección. Se debe definir muy bien el protocolo de preparación de muestras, el tiempo
de aplicación del torniquete, la postura durante la toma de sangre, la temperatura de
transporte y el almacenamiento. Los datos obtenidos de sangre venosa no pueden
compararse con los obtenidos de sangre de capilares. Los valores hematológicos también
dependen de la edad, sexo hábito de fumar, hora de día, posición erecta o supina del
paciente durante la toma, duración de la estasis venosas producida por el torniquete y la
administración de líquidos y drogas.

Los 3 métodos más importantes para obtenerlo son:

1) Punción venosa,
2) Punción capilar,
3) Punción arterial.

La sangre oxigenada por el pulmón, es bombeada por el corazón hacia todos los órganos
y tejidos para cubrir las necesidades metabólicas. Esta sangre arterial tiene prácticamente
una composición uniforme en todo el cuerpo. La sangre venosa varía según la actividad
metabólica del órgano o tejido por lo que el punto donde se extrae la muestra puede influir
en la composición de la muestra. Esta tiene menos oxigeno que la arterial y también se
diferencia por el pH, por su concentración de dióxido de carbono y su hematocrito.

La sangre obtenida por punción de la piel, que a veces se denomina en forma incorrecta
sangre. Esta es una mezcla de sangre procedente de arteriolas, vénulas y capilares por lo
que es en parte arterial, y en parte venosa.

FACTORES QUE INFLUYEN EN LA MUESTRA SANGUíNEA

Ayuno del paciente:

Si exceptuamos la glucosa, los triglicéridos y el fósforo inorgánico, los demás elementos
sanguíneos no se alteran significativamente después de un desayuno “normal” por lo que
el paciente no precisa guardar ayuno absoluto antes de la toma de sangre. Sin embargo
la lipemia provocada por un aumento transitorio de los triglicéridos (como quilomicrones)
después de una comida que contengan grasa, puede provocar interferencias con un gran
número de determinaciones químicas, debida a la turbidez. La hiperlipidemia postprandial
transitoria suele desaparecer de 4 a 6 horas después de la comida.

16
El ayuno requerido normalmente es de 8 h, aunque hay determinaciones que deben
realizarse con 10 y hasta 12 horas de ayuno. Algunas sustancias exhiben variaciones
diurnas de importancia. Por ejemplo, el cortisol, hierro, glucosa, triglicéridos y estradiol.
Estas sustancias pueden variar de 30 a 50 % durante el día. A menos que se especifiquen
lo contrario, es mejor obtener los especímenes sanguíneos de 7 a 9 hs de la mañana.

Ejercicio antes de la toma.

La actividad muscular tiene efectos, tanto transitorios como de larga duración, sobre
diversos parámetros químicos. Los efectos duraderos del ejercicio consisten en
incrementos de las actividades de las enzimas musculares medidas en suero, ejemplo:
creatinincinasa, aldolasa, aspartato-aminotransferasa y lactato-deshidrogenasa. El
ejercicio físico prolongado modifica los niveles de cierto número de las hormonas
sexuales. El volumen del plasma, esta disminuido significativamente después del
ejercicio, después de tres semanas de reposo en cama y después de exponerse al frío.
Se recomienda por lo tanto que el paciente no realice ejercicios previos a la extracción de
la muestra sanguínea.

Posición del paciente.

Debe tranquilizarse al paciente, el estrés provocado por la flebotomía puede afectar los
resultados del laboratorio como cambios en la concentración de catecolaminas y gases en
sangre. Las modificaciones posiciónales afecta: Albúmina, proteínas, diversas enzimas,
calcio, bilirrubina, colesterol, triglicéridos, angiotensina, aldosterona y renina.
Acostado: Existe un acomodo o distribución hemodinámica y de otros líquidos
corporales, sin embargo tiene mayores requerimientos y es menos utlizado.
Sentado: Empieza la salida de liquido intravascular al espacio intersticial y, por lo tanto,
se produce hemoconcentración. Es la forma en que se toma la muestra de comunmente.

Torniquete.
Actualmente se recomienda utilizar torniquete sólo para localizar mas fácilmente la vena a
puncionar, pues en el momento de la extracción sanguínea a tubo hay mayor probabilidad
de hemolisis de la muestra, sin embargo en algunos casos es necesario dejar el
torniquete también para la extracción.
El torniquete no debe prolongarse por más de 1 minuto. Se pide al paciente que cierre el
puño, lo cual distiende las venas, el ejercicio excesivo del puño debe evitarse, dado que el
mismo puede producir elevación en la concentración de potasio.

Transporte de las muestras:

Los tubos deben ser transportados en el menor tiempo posible al laboratorio. Los tubos
deben mantenerse en posición vertical para promover la formación del coagulo y
minimizar la agitación del liquido, lo cual reduce la posibilidad de hemólisis. Las muestras
para la determinación de estado ácido-base deben transportarse en hielo a 4ºC.

17
Variabilidad iatrogénica.
Están causadas por medicamentos o actos terapéuticos o diagnósticos. Las alteraciones
causadas por fármacos en las pruebas de laboratorio pueden agruparse en dos
categorías:

a) Efectos debidos a las propiedades farmacológicas o tóxicas de las drogas.

b) Efectos debidos a la interferencia con la prueba de laboratorio.

Es necesario entonces, realizar un pequeño interrogatorio al paciente para saber si el

mismo toma algún medicamento o está en tratamiento, ya que estos pueden interferir en
algunas determinaciones

MANEJO DE LAS FRACCIONES SANGUÍNEAS:

El tubo debe permanecer tapado ya que se elimina la posibilidad de contaminación
exógena de la muestra, evaporación, posibilidad de derrame y la producción de aerosoles
que incrementan el riesgo de infección en el personal al momento de la centrifugación, y
reducir la agitación del liquido, lo cual reduce la posibilidad de hemólisis

Debe evitarse también prolongada a la exposición a la luz especialmente porque se

afectarían las vitaminas A y B6, beta-carotenos, porfirinas y bilirrubina.

Coagulación de las muestras:

Los tubos deben mantenerse en posición vertical para promover la formación del coagulo,
la sangre coagula normalmente en pocos minutos, mas rápido si se agrega un activador,
la formación del coagulo debe ser completa para poder centrifugar si no se formara
fibrina.

Suero: Se denomina así a la fracción sobrenadante que resulta de la separación por

centrifugación de una muestra sanguínea extraída en un tubo sin anticoagulante.
No es aconsejable desprender el coagulo del tubo con un aplicador, porque es una fuente
potencial de hemólisis. Si el tiempo de coagulación no es el adecuado, la formación
latente de fibrina puede causar un problema en las determinaciones que se efectúan en
equipos automáticos, se puede acelerar la coagulación utilizando un activador como
trombina, o partículas de vidrio o sílice.

Plasma: Es la fracción resultante de la centrifugación de una muestra sanguínea presente

en un tubo que contiene un anticoagulante, el cual puede ser centrifugado
inmediatamente. Los anticoagulantes usados son Citrato; EDTA; heparina sódica y
heparina de litio. Los dos primeros previenen la coagulación por extracción del Calcio de

18
la sangre mediante precipitación o unión en forma no ionizada. No pueden usarse para las
determinaciones de Calcio, Magnesio y Fosfatasa alcalina.

INTERFERENCIAS ANALÍTICAS.
Hemólisis:
Denota la lisis anormal de los eritrocitos, la lisis provoca una descarga de la enzima
adenilatocinasa. Aumenta la concentración sérica del potasio, magnesio, LDH, fosfatasa
ácida y aldolasa. Larga permanencia de la sangre total en un recipiente. Contaminación
de la sangre con detergentes, agua, choque térmico. Las muestras deben obtenerse por
succión suave. La muestra debe trasvasarse lentamente por las paredes del tubo después
de ser eliminada la aguja.

Lipemia:
Provocada por una concentración alta de triglicéridos en el suero provocara resultados
aparentemente altos para todas las sustancias cuyas determinaciones se basan en la
absorbancia a las mismas longitudes de onda en que las partículas de lípido también
absorben luz.

Ictericia.
Puede interferir en las determinaciones de Albúmina, en los ensayos de colesterol que
utilizan como reactivo el cloruro férrico, en las determinaciones de glucosa basadas en el
método de la o-toluidina y en las proteínas totales por Biuret, o las reacciones que usen
filtro a 405 o a 520 nm.

OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS

Punción capilar.
La sangre capilar contiene más glucosa, más leucocitos, mas glóbulos rojos y
hemoglobina. Pero las plaquetas son más bajas. Los glóbulos rojos de la sangre de
capilares son menos frágiles que los venosos.

Sitios para la punción capilar.

Ventajas.
Son relativamente fáciles de obtener, es la forma preferida de sangre para los
frotis sanguíneos. Es el método de elección en los pacientes pediátricos, especialmente
en lactantes. Este tipo de punción también suele utilizarse en pacientes geriátricos.
19
Desventajas.
Solo puede obtenerse una pequeña cantidad de sangre y por lo tanto no pueden
hacerse repeticiones. La sangre tiende a hemolizarse o coagularse si la obtención lleva
mucho tiempo, y no es recomendada en pacientes cuya resistencia a la infección esta
marcadamente disminuida.

Punción venosa.
La facilidad de la obtención de la muestra venosa hace que este sea el método principal
de extracción. La mayoría de las sustancias analizadas se encuentran presentes en forma
soluble o dispersas en forma homogénea.

Recordar que las venas más utilizadas para la venopunción se localizan en el área
antecubital: a) vena cubital: es la más larga y gruesa de todas y es la preferida por
bordear la musculatura del brazo, b) vena cefálica: tiene iguales características que la
anterior, pero es un poco menos gruesa, y c) Vena basílica: es más pequeña que las
anteriores. Esta vena está cerca de la arteria braquial, por lo que su punción supone más
riesgo y su área es más sensible y dolorosa para el paciente.

La palpación se hará con el dedo índice, palpando con suavidad y firmeza. Las venas
tienen una consistencia esponjosa y rebotará bajo la presión del dedo. Las arterias se
encuentran a mayor profundidad y palpitan; los tendones están duros, son como cuerdas,
resistentes a la presión. Las venas trombosadas sobresalen como vasos normales pero
no poseen elasticidad.
Antes de elegir una vena hay que ver su tamaño, dirección y profundidad. Con la
experiencia se desarrolla un buen sentido del tacto para escoger la más adecuada.

Venas superficiales del brazo:

1Cefalica
2 Basílica
3 Media Basílica
4 Mediana cefálica 1
5 Radial accesoria
2
6 Cubital superficial
7 radial superficial 3
4
5
6

MATERIAL. 7

20
 1. 1 Tubo de vidrio con tapón rojo (sin anticoagulante)
2. 1 Ligadura
3. 1 Camisa para extracción de muestras al vacio
4. 1 Agujas desechables
5. 1 bote con torundas con alcohol
6. 1 Lancetas
7. 1 Centrifuga
8. 1 Pipeta Pasteur
9. 1 Bulbo de latex o caucho

METODOLOGÍA.

TÉCNICA PUNCIÓN VENOSA.

1) Lávese las manos y prepare el equipo.
2) Lleve el equipo a la unidad donde se ubica el paciente.
3) Identifique al paciente verbalmente o revisando la ficha clínica.
4) Explíquele el procedimiento a realizar.
5) Lávese las manos y colóquese los guantes
6) Acomode al paciente con la zona a puncionar sobre la almohadilla o una superficie lisa y asegúrese de
que permanezca tranquilo.
7) Revise la piel y las venas del paciente.
8) Seleccione el sitio que le merezca mayor seguridad de éxito en la técnica y de menor riesgo para el
paciente. Si es necesario, lave la zona con agua y jabón.
9) Arme la jeringa o el sistema vacutainer (holder y aguja) y prepare una torunda con alcohol al 70%
(exprímala para que no escurra alcohol)
10) Al seleccionar el sitio de punción prefiera las venas del pliegue del codo por tener mejor calibre lo
que permite un mejor acceso.
11) Coloque la ligadura 4 traveses de dedos sobre el lugar a puncionar.
12) Desinfecte un área de 5 cm de la piel del paciente en la zona seleccionada, con la torunda con
alcohol al 70%.
13) Fije la vena traccionando la piel que la circunda y solicite al paciente que empuñe la mano
suavemente.
14) Inserte la aguja con el bisel hacia arriba, puncione la vena, dirigiendo la aguja en la misma dirección
en que ésta se encuentra con un ángulo de aproximadamente 35º respecto del brazo, (puncionado
primero la piel, trate de no puncionar directamente sobre la vena, puesto que la puede atravesar e
impedirle tomar la muestra). La aguja se debe introducir entre 0.5 y 1 cm cuidando de no moverla en los
siguientes pasos.
15) Inserte el tubo adecuado si está ocupando el sistema Vacutainer, cuidando de no mover la aguja al
momento de perforar el tapón; en el caso de utilizar jeringa jalar suavemente el embolo para obtener la
cantidad de sangre requerida.
16) Una vez que se está obteniendo la muestra sanguínea suelte la ligadura y pídale al paciente que
suelte la mano empuñada.
17) Retire el tubo vacutainer o cámbielo en caso de requerir mas de una muestra
18) Retire la aguja cubriendo sin presionar con la torunda seca y al terminar de extraer la aguja
colóquela con una ligera presión en el sitio de punción, pidiéndole al paciente, dentro de lo posible, que
la afirme sin flectar el brazo.
19) En el caso de jeringa llene con la cantidad necesaria los tubos de examen, siempre llene primero los

21
frascos que tienen anticoagulantes, girándolos según corresponda.
20) Coloque tela adhesiva con un pequeño trozo de algodón seco o parche curita en el sitio de punción.
21) Acomode al paciente.
22) Lleve el equipo y deseche material punzante en receptáculo ad-hoc y el resto en basurero.
23) Retírese los guantes, lávese las manos.

Figura 1. Código de color utilizado para los tubos del sistema Vacutainer

REPORTE.

En la sección de resultados incluir:

 Dibujo de la toma de muestra de sangre venosa.

En el análisis de resultados discuta los inconvenientes que tuvo durante la toma de

sangre

CUESTIONARIO.

1.- ¿Por qué la muestra de sangre venosa es una de las más solicitadas por los médicos?
Explique.

2.- Explique las diferencias entre una muestra de sangre venosa y una de sangre capilar
(obtenida por punción del dedo).

22
3.- ¿Cuáles son las recomendaciones que se le deben hacer a un paciente al cual se le
solicitara una muestra de sangre venosa?

4.- Los tubos para la toma de muestras sanguíneas tienen tapones de diferentes colores.
Explique este código de colores.

5.- Explique la diferencia entre suero y plasma y para que se utiliza cada uno de ellos.

6.- ¿Cuáles son los sitios recomendados para la obtención de sangre por punción venosa
y porque?

23
 PRÁCTICA No. 3.

CINÉTICA ENZIMÁTICA

OBJETIVOS.

a) Analizar el efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de una reacción

enzimática.

b) Calcular por métodos gráficos la velocidad máxima y la constante de Michaelis de una

reacción enzimática.

INTRODUCCIÓN.

ENZIMAS.

Las enzimas son catalizadores biológicos, es decir son sustancias de origen biológico que
aceleran reacciones químicas (Koolman, 2010).

Estas moléculas juegan un papel central en los procesos biológicos. Actúan en forma
secuencial y organizada para catalizar los cientos de reacciones biológicas que se llevan
a cabo en el metabolismo de todo organismo vivo. Estas degradan las moléculas
nutrientes, conservan y transforman la energía química y generan macromoléculas
biológicas a partir de precursores más simples, entre otras muchas funciones. A través de
la acción de enzimas regulatorias, las rutas metabólicas están finamente coordinadas
dando como resultado una relación armoniosa entre las diferentes actividades que
mantienen la vida.

Tabla 1. Principales características de las enzimas

a) Son termolábiles y su actividad depende en ciertos casos

del pH del medio.
b) El reconocimiento de la enzima con el reactivo a
procesar (denominado sustrato) es altamente específico
c) Tienen gran eficiencia, es decir, transforman un gran
número de moléculas de sustrato por unidad de tiempo
d) Están sujetas a una gran variedad de controles celulares,
genéticos y alostéricos.

Todas las reacciones químicas tienen lugar porque cierto número de moléculas reactantes
poseen la suficiente energía como para alcanzar un estado activado, llamado estado de
24
transición, en el que es muy elevada la probabilidad de que se rompan o se establezcan
enlaces para formar los productos. Este estado de transición reside en la cima de la
barrera energética que separa los reactantes de los productos, como muestra la Figura 1.
En ella se observa el diagrama de energía para una reacción química, no catalizada y
catalizada, donde la energía libre de activación es la cantidad de energía necesaria para
llevar todas las moléculas de un mol de sustancia, a una temperatura determinada, al
estado de transición.

Figura 1. Energía libre de activación relacionada a reacciones catalizadas y no catalizadas

Existen dos métodos generales mediante los cuales puede acelerarse la velocidad de una
reacción química. Uno de ellos es la elevación de la temperatura (ya que provoca un
incremento en la velocidad de las moléculas); el otro consiste en utilizar un catalizador. El
catalizador se combina con los reactantes de modo transitorio activándolos, produciendo
un estado de transición de menor energía que en la reacción no catalizada. Una vez
formados los productos el catalizador queda libre, y puede ser de nuevo utilizado. Las
enzimas disminuyen la energía de activación, de tal forma que aumentan la velocidad de
la reacción catalizada, sin afectar a las funciones termodinámicas ni a las constantes de
equilibrio.

El estudio de las enzimas es sumamente importante para la práctica médica. En algunas

enfermedades (especialmente los desordenes genéticos heredables) se encuentra una
deficiencia o incluso una total ausencia de una o varias enzimas lo cual origina una sin fin
de complicaciones. Para algunas otras enfermedades la actividad excesiva o deficiente de
una enzima puede ocasionar diversas manifestaciones clínicas.
25
La medición de la actividad de las enzimas en plasma sanguíneo, eritrocitos, líquidos
corporales o tejidos es una herramienta muy útil para el diagnóstico de una amplia
variedad de patologías. Muchas drogas ejercen su efecto biológico a través de
interacciones con las enzimas.

Con excepción de algunas moléculas catalíticas de RNA, todas las enzimas son proteínas
y su actividad catalítica depende en su totalidad de su estructura y de algunos
componentes que facilitan su función como son las coenzimas y/o los cofactores.

CLASIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS.

Muchas enzimas son nombradas agregando el sufijo “asa” al nombre de su sustrato o a la

palabra o frase que describa su actividad. Como ejemplo tenemos que la ureasa se
encarga de catalizar la hidrólisis de la urea y la DNA polimerasa cataliza la polimerización
de nucleótidos para formar el DNA. Algunas otras enzimas fueron llamadas de acuerdo a
su descubridor o a su principal función. Por ejemplo, la pepsina, una enzima importante
en la digestión de los alimentos lleva su nombre de acuerdo al termino “pepsis” que en
griego significa “digestión”.

Así pues, a cada enzima se le asignan dos nombres. El primero es corto y es como se
conoce a la proteína de manera coloquial, es el nombre sugerido. El segundo es más
completo e infiere propiedades sobre la reacción que la enzima desarrolla, se le conoce
como nombre sistemático, este nombre permite reconocer a la enzima sin ambigüedad y
localizarla en el metabolismo y se ha otorgado a cada enzima por un comité científico
internacional. Este sistema agrupa a las enzimas en 6 clases, cada diferente subclase de
acuerdo a la reacción que catalizan como se muestra a continuación:

1: Oxido-reductasas (reacciones de oxido-reducción),

2: Transferasas (transfieren grupos funcionales),
3: Hidrolasas (reacciones de hidrólisis),
4: Liasas (reacciones de adición a los dobles enlaces),
5: Isomerasas (reacciones de isomerización), y
6: Ligasas (formación de enlaces con consumo de ATP).

A cada enzima se le asigna un número con cuatro dígitos. Los tres primeros indican la
clase, subclase y sub-subclase, respectivamente, y el último es un número de orden.

COFACTORES ENZIMÁTICOS

La actividad de algunas enzimas depende solamente de su estructura como proteína,

mientras que otras necesitan, además, uno o más componentes no proteicos, llamados
cofactores. El cofactor puede ser un ion metálico o bien una molécula orgánica, llamada
coenzima, aunque algunos enzimas necesitan de ambos. El cofactor puede estar

26
fuertemente unido a la proteína (suele ser el ión metálico, aunque puede igualmente ser
un coenzima) y recibe entonces el nombre de grupo prostético, o débilmente unido, por lo
que en realidad actúa como un sustrato específico de la enzima (co-sustrato; suele ser
una molécula orgánica, coenzima).

El complejo enzima-cofactor catalíticamente activo recibe el nombre de holoenzima.

Cuando se separa el cofactor, la proteína restante, que por sí misma es inactiva
catalíticamente, se designa con el nombre de apoenzima.

HOLOENZIMA = APOENZIMA + COFACTOR

Figura 2. Imagen de una holoenzima que requiere de una coenzima y un cofactor para su función

En las enzimas el cofactor puede actuar como centro catalítico primario, grupo puente
para reunir el sustrato y la enzima ó agente estabilizante de la actividad enzimática
(conformación).

MECANISMO DE ACCIÓN

Las moléculas de enzimas contienen hendiduras o cavidades denominadas sitio activo. El

sitio activo está formado por las cadenas laterales de residuos específicos, lo que
ocasiona que tenga un arreglo tridimensional particular, diferente al resto de la proteína.
Este sitio es afín por la estructura tridimensional del sustrato:

27
 Figura 3. Representación de la formación del complejo enzima-sustrato.

El sitio activo la enzima (E) une al substrato (S) formando un complejo enzima-substrato
(ES). En el complejo ES, E transforma a S en él o los productos, formando el complejo
enzima-producto (EP), finalmente la enzima libera del sitio activo a P, regenerándose
(Figura 3).

E + S  ES  E + P

La estructura del sitio activa captura al sustrato y lo orienta de manera optima dando
como resultado un complejo enzima-producto que tiene una energía de activación menor
aumentando de esta forma la velocidad de la reacción. Además de esta característica,
existen varios factores que aceleran la velocidad de reacción como son: Cantidad de
sustrato, temperatura, pH, etc.

CINETICA ENZIMÁTICA.

La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por

enzimas. Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la
reacción catalítica y de la especificidad de la enzima. La velocidad de una reacción
catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos
no es necesario purificar o aislar el enzima. La medida se realiza siempre en las
condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan
concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción
observada es la velocidad máxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien
midiendo la aparición de los productos o la desaparición de los reactivos.

Los estudios sistemáticos del efecto de la concentración inicial del sustrato sobre
la actividad enzimática comenzaron a realizarse a finales del siglo XIX. Ya en 1882 se
introdujo el concepto del complejo enzima-sustrato como intermediario del proceso de
catálisis enzimática. En 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten desarrollaron esta
teoría y propusieron una ecuación de velocidad que explica el comportamiento cinético de
los enzimas.
28
 Para explicar la relación observada entre la velocidad inicial (v0) y la concentración
inicial de sustrato ([S]0) Michaelis y Menten propusieron que las reacciones catalizadas
enzimáticamente ocurren en dos etapas: En la primera etapa se forma el complejo
enzima-sustrato y en la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar a la formación
del producto, liberando el enzima libre:

En este esquema, k1, k2 y k3 son las constantes cinéticas individuales de cada proceso y
también reciben el nombre de constantes microscópicas de velocidad. Según esto,
podemos afirmar que:
v1 = k1 [E] [S]
v2 = k2 [ES]
v3 = k3 [ES]

Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unido al sustrato (ES), de forma que la
concentración total de enzima, [ET], (que es constante a lo largo de la reacción) es:

[ET] = [E] + [ES]

Como [E] = [ET] - [ES], resulta que: v1= k1 [S] [ET] - k1 [S] [ES]

Este modelo cinético adopta la hipótesis del estado estacionario, según la cual la
concentración del complejo enzima-sustrato es pequeña y constante a lo largo de la
reacción (Figura de la derecha). Por tanto, la velocidad de formación del complejo enzima-
sustrato (v1) es igual a la de su disociación (v2+ v3):

v1 = v2 + v3

Además, como [ES] es constante, la velocidad

de formación de los productos es constante:

v = v3 = k3 [ES] = constante.

Como v1=v2+v3, podemos decir que:

k1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES]

Como v1=v2+v3, podemos decir que:

k1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES]

29
Despejando [ES], queda que: siendo: Km = (K2 + K3) / K1 en donde la expresión
(k2+k3)/k1 se ha sustituido por Km, o constante de Michaelis-Menten. Este enlace nos
aporta una explicación sobre las razones que hacen de la Km un parámetro cinético
importante.

Por lo tanto, en el estado estacionario, la velocidad de formación del producto es:

v = v3 = k3 [ES] =

Para cualquier reacción enzimática, [ET], k3 y Km son constantes. Vamos a considerar

dos casos extremos:

Si introducimos el parámetro Vmax en la ecuación general de la velocidad, (la fórmula

recuadrada anteriormente), obtenemos la expresión más conocida de la ecuación de
Michaelis-Menten:

Hay enzimas que no obedecen la ecuación de Michaelis-Menten. Se dice que su

cinética no es Michaeliana. Esto ocurre con los enzimas alostéricos, cuya gráfica v frente
a [S] no es una hipérbola, sino una sigmoide (Fig. 2). En la cinética sigmoidea, pequeñas
variaciones en la [S] en una zona crítica (cercana a la Km) se traduce en grandes
variaciones en la velocidad de reacción.

FIG. 2. Gráfica de una enzima con

comportamiento Michaeliano. Noten la forma
sigmoidea de la gráfica.

30
MATERIAL Y REACTIVOS

1. 1 Gradilla
2. 4 Tubos de ensayo de 15 x 150 mm
3. 1 Pipeta de vidrio de 10 mL,
4. 1 micropipeta de 10 a 100 uL
5. 1 micropipeta de 100 a 1000 uL
6. 1 Propipeta
7. 1 Escobillón
8. 1 Pizeta
9. Sanitas
10. 1 Espectrofotometro
11. 1 Kit Glucosa Oxidasa Trinder
12. Solución patrón de glucosa 1 mg = 1 ml (10 mL)

METODOLOGÍA.

1.- Preparar la serie de tubos como indica la siguiente tabla:

tubo Glucosa (mL) Agua (mL) Enzimas (mL)

1 0.00 1.00 3.0

2 (Dil 1:10) 0.10 0.90 3.0

3 (Dil 1:10) 0.25 0.75 3.0

4 (Dil 1:10) 0.50 0.50 3.0

5 0.10 0.90 3.0

6 0.25 0.75 3.0

7 0.50 0.50 3.0

8 1.00 0.00 3.0

** Para colocar las muestras en los tubos 2, 3 y 4 se tiene que hacer una dilución 1:10 de
la solución de glucosa.

2.- Agitar cada tubo e incubar 5 min a temperatura ambiente. Respetar el tiempo de
incubación.

3.- Leer las muestras en el fotocolorímetro contra el tubo No. 1 como blanco.

31
RESULTADOS:

 Calcular la concentración de sustrato en cada tubo, tomando en cuenta la

concentración inicial de la solución de glucosa.

 Calcular la velocidad de reacción para cada tubo después de los 5 minutos de

reacción tomando en cuenta que V = D.O.

 Con los datos obtenidos hacer una tabla con los siguientes datos:

No.Tubo Moles de Velocidad

glucosa/mL (S) (v)

 Hacer una gráfica con los valores obtenidos en papel milimétrico poniendo la [S]
en las ordenadas y V en las abscisas.
 Calcular las concentraciones inversas de la [S] y la V (1/[S] y 1/V) y hacer una
gráfica en papel milimétrico colocando 1/[S] en las ordenadas y 1/V en las
abscisas (gráfica de Lineweaver-Burk).
 Calcular y marcar en cada gráfica la Km y la Vmax.
 Realizar el análisis de resultados.

CONCLUSIONES.

 Concluir en base al análisis de datos realizado y a los objetivos propuestos.

32
BIBLIOGRAFÍA

1. Koolman J & KH Roehm. 2005. Color Atlas of Biochemistry. Ed. Thieme Verlag
Second edition, 437 pp.
2. Champe P, Harvey R & D Ferrier. 2007. Bioquímica. Ed. Lippincott, Williams &
Wilkins. 4ª. Edición. 519 pp
3. Lehninger A, Nelson D & M Cox. 2001. Principios de Bioquímica. Ediciones
Omega, S.A.1ª ed. 1264 pp

CUESTIONARIO.

1. Describa que es una enzima y explique su mecanismo de acción en función de la

energía de activación de las reacciones

2. ¿Qué factores afectan la acción enzimática?

3. Explique el significado de la contante de afinidad de una enzima

4. ¿Cuál es la aplicación del cálculo de los parámetros cinéticos de una enzima

mediante el modelo de MIchaellis-Menten?

33
 PRÁCTICA No. 4.

DETERMINACIÓN DE GLUCOSA PRE Y POST-PANDRIAL

OBJETIVOS.

 Comprender la importancia de las determinaciones de glucosa pre y post-pandrial

en el metabolismo de los carbohidratos.

 Realizar las determinaciones de glucosa pre- y post-pandrial en el laboratorio.

 Establecer la importancia de estos estudios en el control de la DM.

INTRODUCCIÓN.

Los carbohidratos son sustancias naturales compuestas de carbono, hidrógeno y

oxígeno. Antiguamente se les conocía como “hidratos de carbono”.
En la década de 1880 se reconoció que dicho concepto era erróneo, ya que los
estudios estructurales de estos compuestos revelaron que no eran hidratos, pues no
contenían moléculas intactas de agua. Además, otros compuestos naturales tenían
fórmulas moleculares diferentes a las anteriores.
En la actualidad los carbohidratos se definen como aldehídos o cetonas
polihidroxilados, o bien, derivados de ellos.
La glucosa es el carbohidrato más abundante en la naturaleza. También se le
conoce como azúcar sanguínea, azúcar de uva, o dextrosa. Los animales obtienen
glucosa al comer plantas o al comer alimentos que la contienen. Las plantas obtienen
glucosa por un proceso llamado fotosíntesis.

Fotosíntesis
6 CO2 + 6 H2O + Energía C6H12O6 + 6 O2
Oxidación glucosa

Los mamíferos pueden convertir la sacarosa (azúcar de mesa), lactosa (azúcar de

la leche), maltosa y almidón en glucosa, la cual es oxidada para obtener energía, o la
almacenan como glicógeno (un polisacárido). Cuando el organismo necesita energía, el
glicógeno es convertido de nuevo a glucosa. La glucosa puede convertirse a grasas,
colesterol y otros esteroides, así como a proteínas. Las plantas convierten el exceso de
glucosa en un polímero llamado almidón (el equivalente al glicógeno), o celulosa , el
principal polímero estructural.

34
 La glucosa ocupa un papel central en metabolismo de las plantas, los animales y
muchos microorganismos. Es un componente rico en energía, por lo que es un buen
combustible biológico; la completa oxidación de la glucosa en agua y dióxido de carbono,
un proceso que produce un cambio de energía libre de 2,840 Kj/mol. Además, la glucosa
se puede almacenar como un polímero denominado glucógeno, lo cual hace que las
células puedan almacenar una gran cantidad de esta azúcar sin afectar de forma
importante la osmolaridad. Cuando las demandas energéticas del organismo se
incrementan, la glucosa puede liberarse de estos depósitos para convertirse en energía
(ATP) en presencia o ausencia de oxigeno.
La glucosa no es solo un excelente combustible, sino que también es un precursor
muy versátil de una gran variedad de metabolitos intermediarios en varias rutas
metabólicas. Por ejemplo, La bacteria E. coli obtiene a partir de la glucosa los esqueletos
de carbono para sus aminoácidos, coenzimas, ácidos grasos y otros intermediarios
metabólicos que son necesarios para su crecimiento. En los animales y en algunas
plantas, la glucosa tiene uno de los siguientes 3 destinos:
 Puede ser almacenada (como glucógeno)
 Puede oxidarse a compuestos de 3 átomos de carbono (piruvato) vía la glicolisis
para obtener ATP e intermediarios metabólicos.
 Puede oxidarse a ribosa-5-fosfato a través de la vía del fosfoglucanato.

Los organismos que no pueden obtener la glucosa la pueden producir. Por ejemplo las
plantas obtienen la glucosa a través del proceso de fotosíntesis al reducir el CO2
atmosférico a triosas y convertir estas a glucosa.
La glucosa es la principal fuente de energía para el metabolismo celular. Es un
monosacárido con formula empírica C6H12O6. Es una hexosa pues posee 6 átomos de
carbono y es una aldosa al tener un grupo carboxilo en uno de sus extremos. En su
forma libre se encuentra como azúcar en las frutas y en la miel. Es el compuesto orgánico
más abundante en la naturaleza y es la fuente primaria de síntesis energética mediante
su oxidación catabólica. Además, es el componente principal de polímeros de
importancia estructural como la celulosa y de polímeros de almacenamiento energético
como el almidón y el glucógeno.

GLUCOSA EN SANGRE.
Al ser el principal componente energético para la mayoría de las células, los
niveles de glucosa en sangre son cuidadosamente regulados. Cuando el organismo
ingiere glucosa a través de la alimentación, los niveles de glucosa en sangre se
incrementan en poco tiempo. Cuando la glucosa se encuentra en el torrente sanguíneo,
esta puede ser utilizada por las células o almacenarse como glucógeno. Los niveles de
glucosa en sangre siempre deben ser constantes.
El nivel de glucosa en la sangre es el resultado de un equilibrio entre los
mecanismos que la producen y los que la consumen. Cuando los niveles de glucosa en

35
sangre bajan, las células alfa del páncreas producen glucagon, una hormona que se
encarga de mediar la liberación de glucosa a partir del glucógeno almacenado en un
proceso denominado glucogenogénesis. Además, el glucagón incrementa la sensación de
hambre del organismo para que ingiera comida y recupere los niveles en sangre y los
depósitos intracelulares. Por su parte, cuando los niveles de glucosa en sangre son
elevados, las células beta del páncreas producen insulina, la principal hormona
reguladora de la glucosa la cual al liberarse del páncreas, llega al torrente sanguíneo y se
une a las células a través de receptores específicos denominados GLUT y permite el paso
de la glucosa del torrente sanguíneo al espació intracelular para ser oxidado en energía.
Cuando el paciente no puede ingerir glucosa de la dieta y las reservas de
glucógeno son insuficientes se activa un mecanismo metabólico que se encarga de
generar glucosa a partir de compuestos no glucosidicos denominado gluconeogenesis. La
gluconeogenesis puede generar glucosa a partir de lípidos, proteínas, ácidos nucléicos,
etc. Este proceso al igual que la glucogenólisis tienen como único objeto mantener los
niveles de glucosa en sangre constantes para ser utilizados por las células en caso de ser
necesario.

Glicemia.- Es la concentración de glucosa en el plasma sanguíneo.

Hiperglicemia.- Es la concentración de glucosa en sangre por arriba de los valores de
referencia.
Hipoglucemia.- Es la concentración de glucosa en sangre por abajo de los valores de
referencia.

Valores de referencia: 65 a 110 mg/dl

*** Las concentraciones de glicemia inferiores a 30 mg/dl o superiores a 300 mg/dl son
muy peligrosos para la salud del paciente ya que pueden producirles confusión,
convulsiones, pérdida del conocimiento, mareos, estado comatoso o la muerte.

La glucosa es absorbida rápidamente después de una comida. En una persona

normal los niveles de glicemia se empiezan aproximadamente a los 20 minutos después
de la ingesta de los alimentos, alcanzando su valor máximo en un promedio de 2 horas.
Las personas que tienen algún problema en el metabolismo de este monosacárido
metabolizan este azúcar a una velocidad diferente, lo cual es utilizado por los médicos
para detectar dichas alteraciones en pruebas de laboratorio sencillas que miden la
glicemia pre-pandrial (antes de comer) y post-pandrial (después de comer a las 2 hrs).
El metabolismo de la glucosa está íntimamente relacionado con dos patologías
muy importantes en todo el mundo y sobre todo en nuestro país como lo son la Diabetes
Mellitus (DM) y la obesidad. La primera es un síndrome orgánico multisistémico crónico
que se caracteriza por un aumento de los niveles de glucosa en la sangre (conocido
médicamente como hiperglucemia) resultado de concentraciones bajas de la hormona
insulina o por su inadecuado uso por parte del cuerpo. Esto ocasiona en el paciente
36
múltiples alteraciones orgánicas que lo llevan a padecer un proceso crónico muy
desgastante. El segundo que se define como un aumento en la grasa corporal que por lo
general se acompaña por un incremento en el peso es el resultado de una dieta deficiente
y mal balanceada que favorece el aumento de los depósitos de grasa. Ambas patologías
están íntimamente relacionadas y pueden ser monitoreadas midiendo los niveles de
glicemia.

MATERIAL Y REACTIVOS.

1.- 1 Kit Glucosa Oxidasa Trinder, que contiene:

A Reactivo de color de enzimas.

B. Solución patrón de glucosa 100 mg/dl (5.55 mmol/l)

2. 1 Equipo de extracción de sangre con tubos al vacio (Tubos sin anticoagulante, camisa,
ajugas y ligadura).

3. 1 bote con torundas con alcohol.

4. 1 Pipeta Pasteur

5. 1 Bulbo de latex

6. 4 Tubos de ensayo de 13 X 100

7. 1 Gradilla

8. 2 Celdas para espectrofotómetro

9. 2 Pipetas de 5 ml

10. 1 Micropipeta de 20 microlitros.

12. 1 Balanza

13. 1 Centrifuga

14. 1 Baño maria

15. 1 Espectrofotómetro.

16. 1 paq. Sanitas

17. 1 Pizeta

18. 1 Escobillón

37
METODOLOGÍA.

Fundamento de la determinación de glucemia (método glucosa oxidasa-Trinder).

La glucosa oxidasa (GOD) oxida a la glucosa liberando peróxido de hidrógeno;

este reacciona con fenol y 4-aminofenazona en presencia de la peroxidasa (POD)
generando antipirilquinonimina de color rosa-violeta, cuya intensidad es proporcional a la
concentración de glucosa en la muestra.

GOD

Glucosa + O2 ------------------- Ácido glucónico + H2O2

POD

2H2O2 + 4-aminofenazona + fenol ----------------- Quinonimina + 4 H2O

DESARROLLO EXPERIMENTAL.

1.- Extraer una muestra de sangre venosa al sujeto de estudios que tenga entre 8 y 10
horas de ayuno. El sujeto de estudio deberá ingerir alimentos inmediatamente
después de la toma de la muestra. En cuanto finalice de comer se debe tomar el tiempo
hasta completar una hora cuando se le tomara una segunda muestra.

2.- Esperar a que se forme el coagulo en la muestra y retirarlo con la ayuda de un

aplicador de madera.

3.- Centrifugar la muestra a 2500 rpm durante 5 minutos.

3.- Con ayuda de una pipeta Pasteur retirar el suero del tubo (parte superior del tubo) y
transferirlo a otro tubo de ensayo de 13 x 100 limpio y seco (esta es la muestra
prepandrial).

4.- Marcar 3 tubos de ensayo de 13 x 100 como muestra (M), patrón (P) y blanco (B).

5.- Adicionar a cada uno de los tubos lo que se indica la siguiente tabla:

REACTIVOS MUESTRA PATRON BLANCO

Suero 20 microlitros -------- ------------

Solución patrón ------- 20 microlitros ------------

Reactivo de color 2.0 mililitros 2.0 mililitros 2.0 mililitros

38
6.- Mezclar cuidadosamente e incubar los tubos en baño maría 37ºC durante 10 minutos.

7.- Leer los valores de absorbancia de los tubos en el espectrofotómetro a una longitud de
onda de 520 nm contra el blanco de reactivo. Hacer el cálculo para obtener la glucemia
en mg/dl.

8.- Transcurrido el tiempo del punto No. 1, extraer otra muestra de sangre al sujeto de
estudio y los pasos del 2 al 7 de esta técnica.

Cálculos:

Concentración de glucosa (mg/dl) = Extinción de la muestra x 100

pre y postpandrial. Extinción del patrón

10.- Valores de referencia:

Glucemia prepandrial: 65-110 mg/dl (4.2-6.4 mmol/l)

RESULTADOS.

 Elaborar la siguiente tabla con los valores obtenidos de todos los equipos.

Condiciones del sujeto de prueba [Glucosa ]

Lectura de en la
Equipo
Horas de Edad y Antecedentes Absorbancia muestra
ayuno Sexo familiares analizada

Realizar el análisis de resultados de todos los equipos.

39
CONCLUSIONES.

 Concluir en base al análisis de datos realizado y a los objetivos propuestos.

CUESTIONARIO.

1.- Explique cuál es el mecanismo de acción de la insulina.

2.- ¿Cuáles son los valores de glucemia pre-pandrial que sugerirían que el paciente es
diabético?

3.- ¿Cuál es el tiempo de ayuno recomendado para realizar la determinación de glucemia

prepandrial y porque?

4.- Explique el mecanismo fisiopatológico de la diabetes mellitus tipo II.

40
 PRÁCTICA No. 5

PRUEBA DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA ORAL (PTGO)

OBJETIVOS.

 Estudiar la respuesta de un individuo a la sobrecarga de glucosa mediante una

curva de tolerancia de glucosa, así como evaluar e interpretar dicha curva.

 Estudiar el fundamento, indicaciones y aplicaciones clínicas de la prueba de

tolerancia a la glucosa como auxiliar en el diagnóstico de la diabetes mellitus y
otros trastornos metabólicos.

INTRODUCCIÓN

La Diabetes mellitus (DM) es un conjunto de desordenes metabólicos que se caracteriza

por hiperglucemia resultante de la síntesis insuficiente, por un aumento en la destrucción
o por una respuesta ineficaz ante la insulina. Consecuentemente la hiperglicemia crónica
se presenta por una captación celular inadecuada de la glucosa.

Sin insulina para regular el metabolismo de la glucosa, los tejidos implicados

principalmente (hepático, adiposo y muscular) no pueden absorber de manera adecuada
los nutrientes y en cambio actúan como si el organismo estuviera padeciendo una
inanición. En el hígado la gluconeogénesis se acelera debido a que se movilizan grandes
cantidades de aminoácidos de los músculos y aumenta la síntesis de enzimas
gluconeogénicas. La glucogenólisis produce mas glucosa incrementando la condición
hiperglucemica. El aumento de la lipolisis en el tejido adiposo libera grandes cantidades
de ácidos grasos a la sangre, mientras que en el hígado esas moléculas se degradan
mediante β-oxidación en condiciones de baja concentración de oxalacetato (debida a la
alta gluconeogénesis) produciendo grandes cantidades de acetil-CoA, el sustrato para la
formación de cuerpos cetónicos que desencadena la cetoacidosis.

Por otro lado, debido a que la capacidad del riñón para reabsorber es limitada aparece
glucosa en la orina (glucosuria). La glucosuria produce diuresis osmótica, un proceso en
el que la presencia de solutos en el filtrado produce una pérdida excesiva de agua y de
electrólitos (Na+, K+ y Cl-): en casos graves los pacientes pueden deshidratarse, a pesar
del consumo de grandes cantidades de líquidos (McKee & McKee, 2009).

La forma de diagnosticar esta enfermedad, es a través de los signos y síntomas

(hiperglucemia, hipertensión arterial, polidipsia, poliuria, polifagia, etc.). Sin embargo, en
muchas ocasiones, la DM2, cursa asintomática, por lo que para confirmar o descartar la
41
presencia de esta enfermedad, se han desarrollado pruebas del tipo estímulo - respuesta.
La más conocida de estas pruebas, es la Curva de Tolerancia a la Glucosa Oral (CTGO).

Curva de Tolerancia a la Glucosa Oral

Esta es una prueba que mide la capacidad que tiene el organismo para metabolizar la
glucosa, de manera que en los sujetos con alteraciones en el metabolismo de los
carbohidratos, esta capacidad se encuentra alterada, y en el caso particular de los sujetos
con DM2, esta capacidad se encuentra disminuida.

Previamente a la prueba, 3 días al menos, es necesario que el paciente mantenga una

dieta que contenga aproximadamente 300 g de carbohidratos y alrededor de 3000
calorías. Así mismo, el paciente debe mantener una actividad física normal las 48-72
horas previas. La prueba se debe realizar solo en sujetos ambulantes y nunca en
pacientes encamados u hospitalizados.

La CTGO, consiste en lo siguiente: Después de un ayuno de 10 a 12 horas, se obtiene del

sujeto bajo estudio, una muestra de sangre en ayunas para determinar la glucemia
(concentración de glucosa en la sangre). De acuerdo con el criterio del Expert Committee
on the Diagnosis and Classification of Diabetes (ECDCDM, 2002), si el valor de glucemia
en ayunas es igual o mayor a 126 mg/dl la realización de la prueba está contraindicada,
pues se corre el riesgo de provocar un shock hiperglucémco. Si la glucemia en ayunas es
menor de 126 mg/dl, entonces se le administrar al paciente una carga de glucosa, (75
gramos de glucosa disuelta en 250 miligramos de agua. En realidad, el criterio establece
1.75 gramos de glucosa por kilogramo de peso corporal, hasta un máximo de 75 gramos),
y posteriormente, se toman muestras de sangre a intervalos regulares de tiempo, de
acuerdo con alguno de los muestreos convencionales: Una muestra cada hora hasta las
dos horas (tres muestras), o en el mejor de los casos, una muestra cada 30 minutos hasta
las 2 horas (5 muestras).

Finalmente, con los valores de concentración de glucosa y tiempo obtenidos, se dibuja

una gráfica que generalmente se representa como una curva (Figura 1).

42
 Figura 1. Valores de concentración de glucosa plasmática para el diagnóstico de
anormalidades en la Curva de Tolerancia a la Glucosa Oral (ECDCDM, 2002), donde:
IFG = Impaired Fasting Glucose (Deterioro de la Glucosa en el Ayuno-DGA)
IGT = Impaired Glucose Tolerance (Deterioro de la Tolerancia a la Glucosa-DTG)

La OMS recomienda que la prueba de tolerancia oral a la glucosa (PTOG) se mantenga

como prueba diagnóstica, debido a que posee mayor sensibilidad y especificidad que la
glucosa sérica en ayuno; sin embargo, el inconveniente de esta prueba es que representa
mayor costo y es poco reproducible, por lo que la glucosa sérica en ayuno sigue siendo el
método diagnóstico preferido (ADA, 2008).

Interpretación

Según se muestra en la Figura 1, los valores sanguíneos normales son:

Inicio (0 minutos): 60 – 100 mg/dL

30, 60 y 90 minutos: menos de 200 mg/dL

120 minutos: menos de 140 mg/dL

43
Los términos Deterioro de la Glucosa en el Ayuno (DGA) y Deterioro de la Tolerancia a la
Glucosa (DTG) se refieren a estados metabólicos intermedios entre la homeostasis
normal de la glucosa y la diabetes. Los individuos con DGA tienen niveles de glucosa
sérica prepandrial mayores a 110 mg/dL pero menores a 126 mg/dL. El término DTG se
refiere a individuos que al cabo de las dos horas de prueba de la CTGO manifiestan un
nivel de glucosa sérica mayor a 140 mg/dL y menor a 200 mg/dL.

Normalmente estas dos condiciones no se consideran entidades clínicas por si solas pero
indican un factor de riesgo para el paciente de padecer en un futuro diabetes.

DGA y DTG se asocian con el síndrome de la resistencia a la insulina, que es la

disminución de la capacidad de los tejidos efectores, como el hígado, el tejido adiposo y el
músculo, de responder adecuadamente a las concentraciones circulantes normales de
insulina (Champe et al., 2007) y se asocia generalmente a hiperinsulinemia
compensatoria para mantener la homeostasis de glucosa, obesidad, dislipidemia
(hipertriacilglicerolemia) e hipertensión.

Las personas no diabéticas obesas pueden compensar la resistencia a la insulina con

niveles de la hormona, por lo que un número importante de pacientes obesos no
desarrollan diabetes, sin embargo en algunos casos las células β se vuelven cada vez
mas disfuncionales y no pueden segregar suficiente insulina para corregir la
hiperglucemia predominante

Si la glucemia en la muestra de las dos horas es igual o superior a los 200 mg/dL, se
diagnostica DM (Figura 1).

CTGO en Diabetes Gestacional

Debido al creciente número de pacientes afectados por la Diabetes es necesario

identificar a los grupos de riesgo. Durante el embarazo se presenta una mayor
probabilidad de desarrollar resistencia a la insulina e incluso Diabetes mellitus Gestacional
(DMG) en aquellas mujeres mayores a 25 años, con sobrepeso u obesidad, con
antecedentes familiares de metabolismo anormal de los carbohidratos o que
pertenecientes a grupos étnicos de riesgo (por ej. Americanos, Hispanoamericanos,
Asiamericanos, Afroamericanos e Isleños del Pacífico). Aquellas mujeres embarazadas
que cubran estos criterios requieren ser evaluadas desde su primer control pre-natal para
DG. Y aún si en este primer control registran valores normales requieren ser revaloradas
entre las 24 y 28 semanas de gestación.

Para el diagnóstico de DMG puede utilizarse la CTGO con las siguientes indicaciones: Se
determina glucemia en ayuno de 10 a 12 horas, y si el nivel del glucosa está por debajo
de los 126 mg/dL se administran 50 g de glucosa por vía oral, y se realiza una sola

44
determinación de glucosa una hora después de la administración de glucosa. La
respuesta normal deberá ser de < de 140 mg/dL a la hora de la prueba.

METODOLOGÍA.

MATERIAL Y REACTIVOS

1. 1 Pizeta con agua destilada

2. 1 Escobillón
3. 1 Glucómetro
4. 1 bote con torundas con alcohol
5. 5 Lancetas
6. 1 frasco con solución dextrosol líquida.
7. 1 Probeta de 250 mL
8. 1 Vaso desechable
9. 1 paq. de sanitas

FUNDAMENTO

La prueba se basa en la respuesta que tiene el organismo ante una sobrecarga de

glucosa puntual, y la capacidad del mismo de recuperar la homeostasis de la glucosa en
un tiempo corto (2 horas).

DESARROLLO EXPERIMENTAL

1. Mantener al paciente bajo una dieta con un contenido de carbohidratos normal

(200 a 300 g/día para adultos) por lo menos un día antes de la prueba.
2. Previó ayuno nocturno de 10 horas determinar el nivel de glucosa utilizando el
glucómetro (tiempo 0 minutos)
3. Administrar solución dextrosol vía oral suficiente para una dosis de 75 g de
glucosa. El tiempo de administración no debe rebasar los 5 minutos.
4. Posteriormente de la ingesta de glucosa, determinar la concentración de glucosa
utilizando el glucómetro cada 30 minutos.

5. Anotar los valores obtenidos en cada tiempo.

6. Construir la gráfica de la curva de tolerancia de glucosa oral

45
RESULTADOS.

Tabla 1. Valores obtenidos de glucosa en sangre

Tiempo 0 30 60 90 120
(min)

Glucosa en
sangre
(mg/dL)

Gráfica 2. Curva de Tolerancia a la Glucosa Oral obtenida del paciente analizado

46
ANÁLISIS DE RESULTADOS.

 Realizar el análisis de los resultados obtenidos. Considerar las condiciones del

sujeto de prueba (horas de ayuno, edad, sexo y antecedentes familiares)

CONCLUSIONES.

 Concluir en base al análisis de datos realizado y a los objetivos propuestos.

CUESTIONARIO.

1.- ¿Qué factores influyen en la forma de la curva de tolerancia a la glucosa?

2.- ¿En qué casos se presenta la condición denominada “resistencia a la insulina”?

3.- ¿Por qué no se utiliza esta prueba comúnmente para el diagnóstico de DM?

4.- ¿Qué significado clínico tiene una curva con una campana de respuesta muy ancha,
es decir que los datos de los 30, 60 y 90 minutos sean muy parecidos?

BIBLIOGRAFÍA

1. American Diabetes Association. 2008. Standards of medical care in diabetes.

Diabetes Care. 31 (Suppl 1):S12-54.

2. Champe P, Harvey R & D Ferrier. 2007. Bioquímica. Ed. Lippincott, Williams &
Wilkins. 4ª. Edición. 519 pp.
3. McKee T & JR McKee. 2009. Bioquímica: Las Bases Moleculares de la Vida. Ed.
McGraw Hill 4ª. Edición. Pp. 606-607.

4. The Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus.

2002. Report of the Expert Committee on the Diagnosis and Classification of
Diabetes Mellitus. Diabetes Care: 25 (Suppl 1)

5. Trujillo Arriaga HM. 2007. La curva de tolerancia a la glucosa oral. Un enfoque

alternativo. Depto. de Ingeniería Eléctrica, Área de Ingeniería Biomédica, UAM-I.
Contacto S 64: 21–24.

47
 PRÁCTICA No. 6

DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA GLICOSILADA

OBJETIVOS.

 Aplicar la técnica de cromatografía de intercambio iónico para la cuantificación de

Hb-glicosilada.

 Conocer las indicaciones y aplicaciones clínicas de la determinación de

Hemoglobina glicosilada

 Conocer los alcances de la determinación de Hemoglobina glicosilada en el control

metabólico de la diabetes mellitus.

INTRODUCCIÓN.

La hemoglobina es una proteína tetramérica que se encuentra exclusivamente en los

eritrocitos, donde su función principal es transportar oxígeno desde los pulmones a los
capilares de los tejidos (Champe et al, 2008).

La hemoglobina de los seres humanos está compuesta por tres variedades de

hemoglobina llamadas: hemoglobina A, hemoglobina A2 y hemoglobina F.

La hemoglobina A es la más abundante en los adultos porque sola representa,

aproximadamente, 97%. Dentro de esta misma fracción hay varios grupos, también
conocidos como fracciones menores (HbA1a, HbA1b y HbA1c), las cuales se diferencian
entre sí de acuerdo con la velocidad de movimiento durante el proceso de electroforesis
(Schroter, 1980).

La HbA1c es la más abundante de los componentes menores de la hemoglobina en los

eritrocitos humanos; se forma por la condensación de la glucosa en la porción N-terminal
de la cadena beta de la hemoglobina, de tal forma que el organismo se encuentra
expuesto a la modificación de su hemoglobina por la adición de residuos de glucosa: a
mayor glucemia, mayor glucosilación de la hemoglobina

Existe una relación directa entre la HbA1c y el promedio de glucosa sérica porque la
glucosilación de la hemoglobina es un proceso relativamente lento, no enzimático, que
ocurre durante los 120 días de vida media del eritrocito; esto explica que se piense que la
HbA1c representa un promedio de la glucemia en las últimas 6 a 8 semanas. (Pérez,
2009).
48
Los resultados descritos por Fitzgibbson en 1976 mostraron que las concentraciones de
HbA1c se incrementan conforme el eritrocito envejece. En los pacientes diabéticos el
incremento es significativamente mayor, en comparación con pacientes sanos.

Sin embargo, hay ciertas advertencias que debemos de tomar en cuenta al momento de
interpretar los resultados. La HBA1c no representa las concentraciones de glucosa
durante los 120 días que tarda el proceso de glicosilación, sino un promedio debido que
los eritrocitos presentes en la muestra tienen diversos tiempos de vida. Estudios clínicos
sugieren que un paciente tendrá 50% de su HbA1c formada en el mes previo a la toma de
muestra; 25% en el mes previo a esto y 25% restante en los meses dos y cuatro
(Goldstein et al, 1986)

Tabla 1. Correlación de hemoglobina glicosilada con glicemia sérica.

Prueba de Promedio de
hemoglobina glicemias
glicosilada (mg/dL)
(%)

5-6 80-120
6-7 120-150
7-8 150-180
8-9 180-210
9-10 210-240
10-11 240-270
11-12 270-300

En la Tabla 1 se presenta una correlación entre los resultados obtenidos en la prueba de

hemogobina glicosilada y el nivel de glucosa sérica promedio que representa realizada
por la Federación Mexicana de Diabetes

Hemoglobina glucosilada como prueba diagnóstica

La Asociación Americana de Diabetes establece como criterios diagnósticos de diabetes

mellitus tipo 2 cuando se obtiene:

a) Glucosa plasmática en ayuno (GA) igual o mayor a 126 mg/dL (7 mmol/L).

b) Síntomas de hiperglucemia más una glucemia casual mayor o igual a
200 mg/dL (11.1 mmol/L).
c) Glucosa plasmática a las dos horas mayor o igual a 200 mg/dL (11.1 mmol/L)
durante la prueba de tolerancia oral a la glucosa (PTOG o CTOG).

Actualmente hay un gran interés en extender el uso de la medición de la hemoglobina

glicosilada como método diagnóstico de diabetes mellitus. Sin embargo, como prueba
diagnóstica es poco sensible pues resulta del promedio de glicemia en los últimos tres
49
meses, por lo que algunos autores hicieron algunas recomendaciones para considerar la
HbA1c como prueba diagnóstica en ciertos pacientes:

i) Puede considerarse como prueba de escrutinio si se obtiene un resultado que incluya

una muestra de glucosa en ayuno >100 mg/dL, o bien prueba de glucosa al azar >130
mg/dL.
ii) HbA1c entre 6.5 y 6.9% sumada a una prueba de glucosa específica (GA o CTOG)
que indique hiperglicemia deberá establecer el diagnóstico de diabetes.
iii) HbA1c >7% confirmado por otra HbA1c u otra prueba específica de glucosa
plasmática (GA o CTOG) podrá establecer el diagnóstico de diabetes (Saudek et al,
2008)

Sin embargo, no hay estudios con suficiente significado estadístico que determinen que la
HbA1c por sí sola pueda considerarse prueba diagnóstica y, hasta la fecha, la ADA no
recomienda usar las concentraciones de HbA1c para el diagnóstico de diabetes mellitus
(ADA, 2008)

Condiciones que modifican el resultado de hemoglobina glucosilada

Se ha descrito que existen diferentes factores que pueden llegar a modificar las
concentraciones de HBA1c, como las hemoglobinas anormales y las alteraciones
derivadas de fármacos y ciertos padecimientos.

Las variaciones genéticas y las formas derivadas de modificaciones químicas pueden

afectar los valores de HbA1c. La hemoglobina normal de los adultos (HbA) se glucosila a
la forma HbA1c, pero cuando existen formas anormales éstas pueden formar otros
productos glucosilados, como HbS1c y otras más en lugar de HbA1c. Además, existen
estudios que sugieren que las hemoglobinas anormales se glucosilan a diferente
velocidad que la HbA, lo cual podría alterar también los resultados.

Cualquier condición clínica que acorte la supervivencia de los eritrocitos o disminuya su

vida media puede dar resultados falsos de HbA1c. La anemia por deficiencia de hierro
puede llevar a incrementos en HbA1c por arriba de 2%, lo cual puede ser reversible al ser
tratado con hierro. En cambio, la anemia hemolítica tiene el efecto opuesto al de la
deficiencia de hierro al reducir las concentraciones de HbA1c.

La Hb-carbamilada suele aparecer en pacientes con insuficiencia renal y su concentración

es proporcional a la concentración de urea y es indistinguible de la HbA1c por algunos
métodos; esto puede incrementar falsamente las concentraciones de HbA1c. Pero a pesar
de la posible interferencia con la Hb-carbamilada los resultados de la HbA1c son válidos
para los pacientes diabéticos con insuficiencia renal crónica utilizando el método
adecuado.

Así mismo, las altas concentraciones de Hb-acetilada descritas en pacientes que ingieren
ácido acetil salicílico en dosis mayor a 4 g/día y en algunos sujetos alcohólicos pueden

50
presentar incrementos falsos de concentraciones de HbA1c (Pérez et al, 2009)

METODOLOGÍA.

MATERIAL Y REACTIVOS

1.- 1 Kit para la determinación de Hb-glicosilada que contiene:

a) Solución para hemolisis.
b) Tubo con resina de intercambio catiónico y buffer.
c) Solución patrón de glicohemoglobina.
d) Filtro separador.
2.- 1 Espectrofotómetro.
3.- 1 Centrifuga.
4.- 1 Celdas para espectrofotómetro.
5.- 11Balanza de dos platillos.
6.- 1 Vortex
7.- 1 Micropipeta de 1 ml
8.- 1 Camisa para vacutainer
9.- 1 Torundas con alcohol
10.-1 Ligadura
11.-1 Agujas para vacutainer
12.-1 Escobillón
13.- 1 Pizeta con agua destilada
14.- 1 Micropipeta de de 20 a 100 μL
15.- 1 Tubo para vacutainer con anticoagulante
16. 1 paq. Sanitas

FUNDAMENTO

La valina N-terminal de cada cadena ß de la Hb A1c se une a la glucosa de manera no

enzimática y muy estable. De manera que la unión de la glucosa con la hemoglobina
permanece durante el ciclo de vida del eritrocito.

La determinación de la Hemoglobina glicosilada nos permite evaluar el promedio del nivel

glicémico del paciente en los últimos tres meses.

La prueba se basa en la separación de la fracción glicosilada de una muestra de sangre,

mediante una cromatografía en columna con resina de intercambio catiónico. En la resina
quedan unidas aquellas moléculas de hemoglobina que no se unieron a glucosa y se
eluyen las moléculas de hemoglobina glicosilada. Finalmente la fracción glicosilada se
cuantifica mediante espectrofotometría midiendo la absorbancia a 415 nm.

51
DESARROLLO EXPERIMENTAL

1. Extraer la muestra de sangre del sujeto de prueba por el método de vacutainer,

recolectar en tubos con anticoagulante. Homogenizar la muestra.
2. Colocar 0.1 mL de sangre total en un tubo limpio, seco y etiquetado
(HEMOLIZADO), y agregar 0.5 mL de reactivo de lisis. Agitar vigorosamente e
incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
3. Tomar 0.1 mL del hemolizado y colocarlo en el tubo blanco con la resina de
intercambio. Colocar el filtro a 2cm de la superficie del líquido y mezclar por
inversión durante 5 min
4. A los 5 minutos empujar el filtro separador hasta el tope para obtener el filtrado.
5. Colocar en un tubo limpio, seco y etiquetado el filtrado (GLICOHEMOGLOBINA).
6. Tomar 0.02 mL del hemolizado, colocarlos un tubo limpio, seco y etiquetado
(HEMOGLOBINA TOTAL), agregar 5 mL de agua destilada y agitar durante 5
minutos.
7. Ajustar el espectrofotómetro a una longitud de onda de 415 nm usando como
blanco agua destilada.
8. Medir la absorbancia de la glicohemoglobina y de la hemoglobina total en el
espectrofotómetro.
9. Realizar el mismo procedimiento para el patrón.

CÁLCULOS % HB GLICOSILADA = R1/R2 x 10

Donde:

R1= ABS muestra Hb glicosilada / ABS muestra Hb total

R2 = ABS patrón HB glicosilada / ABS patrón Hb total

RESULTADOS.

Tabla 2. Valores obtenidos de hemoglobina glicosilada de los todos los equipos.

No. Edad/sexo Ayuno ABS ABS R1 % Hb glic Observaciones

Equipo (h) mHbGlic mHbTot (antecedentes
familiares)

52
Tabla 3. Valores obtenidos de Hemoglobina glicosilada y total del patrón.

ABS pHbGlic ABS pHbTot R2

ANÁLISIS DE RESULTADOS.

 Realizar el análisis de TODOS los resultados obtenidos.

CONCLUSIONES.

 Concluir en base al análisis de datos realizado y a los objetivos propuestos

CUESTIONARIO.

1.- ¿Qué aplicaciones tiene la prueba de Hemoglobina glicosilada?

2.- ¿Qué factores pueden afectar la determinación de Hemoglobina glicosilada?

3.- ¿Qué medidas deben tomarse cuando se obtienen valores de Hemoglobina glicosilada
mayores a 7% en un paciente?

4.- ¿Porqué no afectan las horas de ayuno en la determinación de Hemoglobina

glicosilada?

BIBLIOGRAFÍA

1. Champe P, Harvey R & D Ferrier. 2007. Bioquímica. Ed. Lippincott, Williams &
Wilkins. 4ª. Edición. 519 pp
2. American Diabetes Association. 2008. Standards of medical care in diabetes.
Diabetes Care. 31 (Suppl 1):12-54.
3. Goldstein DE, Little RR & HM Wiedmeye. 1986. Glycated hemoglobin:
methodologies and clinical applications. Clin Chem.32(10 Suppl): 64-70.
4. John WG, Mosca A, Weykamp C & I Goodall. 2007. HbA1c Standardisation:
History, Science and Politics. Clin Biochem Rev. 28:163-168.
5. Pérez Páez I, Rodríguez Weber FL, Díaz Greene EJ & R Cabrera Jardines. 2009.
Mitos y realidad de la hemoglobina glucosilada. Med Int Mex. 25(3):202-209
6. Saudek CD, Herman WH, Sacks DB, Bergenstal RM, Edelman D & MB Davidson.
2008. A New Look at Screening and Diagnosing Diabetes Mellitus. J. Clin.
Endocrinol. Metab. 93: 2447 - 2453.

53
 PRACTICA No. 7
DETERMINACIÓN DE TRIACILGLICEROLES Y COLESTEROL.

Objetivos.

Enseñar al alumno en la técnica de la determinación de trigliacilgliceroles.

Formar al alumno en la técnica de determinación de colesterol sérico.

Conocer el fundamento, las indicaciones y aplicaciones clínicas de la

determinación de colesterol sérico total en sangre

Emplear el método de la determinación de triacilgliceroles para la clasificación de

hiperlipidemias.

Introducción.

Los ésteres de glicerol con ácidos grasos (AG), los acilgliceroles, se denominan
habitualmente glicéridos por los científicos de la salud. Existen 3 tipos generales de
glicéridos que son los monoacilgliceroles, diacilgliceroles y triacilgliceroles (TAG, o TG).
Los TAG son las principales moléculas de reserva energética, y su poder calorífico, cerca
de 38 KJ/g, es muy superior a los carbohidratos y proteínas. Los TAG son los más
comunes dado que son las formas principales de almacenamiento y transporte de AG. El
TAG es el producto final de la vía de síntesis de los acilgliceroles. Las grasas naturales
contienen más del 99% de TAG; son mezclas de TAG en los que las 3 posiciones del
glicerol están esterificados por AG diferentes. Las plantas y los animales de sangre fría
tienen TAG más ricos en AG insaturados que los animales de sangre caliente con el fin de
comunicar cierta fluidez a sus tejidos. En los seres humanos, los TAG subcutáneos son
más fluidos que los que recubren las vísceras. Los TAG sintéticos pueden formarse por
esterificación del glicerol con un solo AG, dando un éster.

Como los TAG son solo ligeramente solubles en agua y no pueden formar por si
mismos micelas, forman gotillas aceitosas dentro de los adipositos. Estas gotillas lipídicas
citosólicas son la reserva energética principal del cuerpo.

SINTESIS DE TRIACILGLICEROLES. El glicerol fosfato es el aceptor inicial de los

AG, durante la síntesis de TAG por la vía general son dos las rutas para la producción de
glicerol fosfato. Tanto en el hígado (sitio primario de la síntesis de TAG), como en el
tejido adiposo se puede elaborar a partir de glucosa empleando las reacciones de la
glucólisis para formar fosfato de dihidroxiacetona (DHAP); a continuación la
deshidrogenasa de glicerol fosfato desdobla al DHAP hasta glicerol fosfato (se utiliza
NADH). Hay una segunda vía en el hígado pero no en el tejido adiposo, en la que se
recurre a la cinasa del glicerol para convertir glicerol libre en glicerol fosfato (se utiliza
ATP).

54
 La síntesis de una molécula de TAG a partir de glicerol fosfato y acil-CoA por la vía
general abarca 4 reacciones que consisten en añadir secuencialmente 2 AG provenientes
de la Acil-CoA grasa, remoción de fosfato y añadidura de un tercer AG proveniente de
Acil-CoA. En el tejido adiposo, los TAG se almacenan en el citosol de las células listo
para su movilización cuando el cuerpo lo necesite como combustible. Se guarda poco
TAG en el hígado, la mayor parte sale como ésteres de colesterilo, colesterol, fosfolípidos
y apoB-100 para formar VLDL. Las VLDL nacientes se secretan hacia la sangre en la
maduran y funcionan en la descarga de los lípidos producidos de manera endógena hacia
los tejidos periféricos.
En la vía intestinal se inicia con el 2-monoglicérido, uno de los productos de la
0digestión lípidica, solo se necesitan 2 Acil-CoA y la acción de la acil transferasa para
formar el TAG.

MOVILIZACIÒN DE LOS DEPÓSITOS GRASOS. Los TAG o grasas, de los que

suele haber depósitos en todas las células, aunque son más abundantes en el tejido
adiposo, cuya principal función consiste, precisamente en servirles de almacén de energía
(un hombre de 70 kg al principio del ayuno tiene unos 15 kg de grasa, lo que supone el
almacenamiento de unas 135 000 kcal como TAG).

Cuando se produce un déficit calórico (ayuno), se movilizan esos depósitos de

TAG, que junto a su contrario, el depósito de grasas, esta controlado por la acción de
diferentes hormonas. Si predominan en la sangre las hormonas lipolíticas (ACTH,
glucagon, adrenalina, hormona del crecimiento, etc) el equilibrio se desplaza hacia la
movilización; si por el contrario, predominan las hormonas lipógenas (la principal es la
insulina), ocurrirá lo contrario. Las triglicérido lipasas, aquellas enzimas que hidrolizan
TAG son las siguientes: lipasa pancreática, lipasa sensible a hormonas, lipasa ácida,
lipoproteína lipasa y lipasa hepática; cada una de ellas desempeña funciones importantes
en el metabolismo. La degradación de TAG se inhibe en el estado bien alimentado.

EFECTOS METABÓLICOS. El hígado produce TAG a menudo los TAG se miden

como un reflejo de la ingestión y del metabolismo de grasas (lípidos) o como parte de una
evaluación de factores de riesgo coronario. Los TAG comprenden la mayor porción de
lípidos en la dieta, en el tejido adiposo y en la sangre. Después de una comida los TAG
aparecen en la sangre como el mayor constituyente de los QM, bajo circunstancias
normales, los TAG dentro de los QM son despojados de los AG a medida que pasan a
través de varios tejidos (especialmente el adiposo y el músculo esquelético). El hígado
absorbe los QM restantes de modo que estos desaparecen de la sangre en 2 o 3 hrs. Los
restantes TAG, junto con los TAG sintetizados en el hígado, son empacados de nuevo
como VLDL y secretados en la sangre desde el hígado, Los TAG son una forma de
almacenamiento de energía que se deposita en el músculo y en el tejido adiposo, y son
generalmente liberados y metabolizados entre las comidas, de acuerdo con las
necesidades de energía del organismo.
No todos los AG que inundan el hígado se pueden eliminar mediante la oxidación
o síntesis de cuerpos cetónicos. Esos AG excesivos se convierten en TAG, que se
empacan y se secretan en las VLDL; los QM se sintetizan a partir de los lípidos de la dieta
en las células de la mucosa intestinal después de una comida.
55
 La degradación de lipoproteínas catalizada por la lipasa de lipoproteína en el
tejido adiposo es baja en los diabéticos, las cifras plasmáticas de QM y VLDL se elevan,
lo que origina hipertrigliceridemias. En la diabetes tipo I la concentración muy elevada de
AG que se liberan de los adipositos como respuesta a los bajos niveles de insulina
fomenta la síntesis hepática de TG. En el ayuno los TG almacenados se degradan sólo
conforme el cuerpo los requiera.

Dislipidemia: La resistencia a la insulina en personas obesas conduce a un

aumento en la producción de insulina para mantener los niveles de glucosa sanguíneos.
La resistencia a la insulina en el tejido adiposo induce aumento en la actividad de la lipasa
sensible a hormonas, lo que eleva los niveles de AG circulantes. Estos AG se transportan
al hígado y se convierten en TAG y colesterol, el exceso de TAG y colesterol se libera
como VLDL, lo que incrementa la cifra de TAG en el suero, al mismo tiempo disminuye las
concentraciones de HDL.

Los TAG que contienen AG que no contienen enlaces dobles se conocen como
grasas saturadas, su consumo se relaciona con niveles plasmáticos elevados de
colesterol total y colesterol LDL, así como un mayor riesgo de cardiopatía coronaria. Sus
principales fuentes son los productos lácteos, las carnes y algunos aceites vegetales
como el de coco y el de palma.

Los TAG con predominio de AG con un doble enlace se conocen como grasa
monoinsaturada. Casi siempre provienen de verduras y pescado; disminuyen el
colesterol plasmático total y el LDL, pero aumentan el HDL. Los TAG que contienen AG
con más de un enlace doble se conocen como grasas polinsaturadas. AG omega-6
(linoleíco) obtenidos de aceites vegetales (olivo, algodón, girasol, maíz, soya) disminuyen
el colesterol plasmático, los niveles de LDL y de HDL; las nueces, el aguacate, y el fríjol
de soya también contienen AG omega-6. AG omega-3 (linolénico) suprimen arritmias
cardiacas, disminuyen los TAG séricos, reducen la tendencia a la trombosis y disminuyen
mucho la mortalidad cardiovascular, pero tienen poco efecto en los niveles de colesterol
de LDL o HDL. Se encuentran en grasa de salmón, aceite de linaza, anchoas, sardinas.
La deficiencia de AG se caracteriza por dermatitis descamativa, caída de pelo y
cicatrización deficiente de las heridas.

Las personas con deficiencia de lipasa de lipoproteínas o apoC-II

(hiperlipoproteinemia tipo I) manifiestan una acumulación impresionante de QM en el
plasma (hipertrigliceridemia), es un trastorno autonómico recesivo raro.
Si la remoción de los QM residuales por el hígado es defectuosa, éstos se
acumulan en el plasma; lo anterior ocurre en la hiperlipoproteinemia tipo III llamada
también disbetalipoproteinemia familiar. Los pacientes que son monocigóticos para la
apo-E2 experimentan deficiencia de la depuración de remanentes de QM y partículas de
IDL, con hipercolesterolemia y ateroesclerosis prematura.
La abetalipoproteinemia es una hipolipoproteinemia rara causada por un defecto
de la proteína de transferencia de TAG que tiene como resultado incapacidad para cargar
a la apo-B con lípidos. Como consecuencia, no se forman QM ni VLDL y se acumulan
TAG en hígado e intestino.

56
 VALORES DE REFERENCIA. Normal menos de 150 mg/dL
Limítrofe alto: 150-199 mg/dL Alto: 200-499 mg/dL Muy alto: 500 mg/dL o superior.
Los niveles altos de TAG pueden estar asociados con un mayor riesgo de
enfermedad cardiaca y accidente cerebrovascular, lo cual resulta especialmente válido si
se tiene en cuenta que las personas con niveles altos de TAG a menudo presentan otras
afecciones, como diabetes y obesidad, que incrementan la probabilidad de enfermedad
cardiovascular. Niveles altos de TAG pueden indicar: cirrosis, hipotiroidismo, diabetes
mal controlada, síndrome nefrótico, pancreatitis, baja proteína en la dieta y alta en
carbohidratos, consumo de alcohol y edad.

Niveles bajos de TAG pueden indicar; síndrome de mala absorción, desnutrición,

hipertiroidismo, dieta baja en grasas. Otras afecciones por las que se puede realizar el
examen de determinación de TAG son: síndrome de quilomicremia, hipertrigliceridemia
familiar, hiperlipidemia adquirida, diabetes mellitas tipo I.
El embarazo puede interferir con los resultados de examen, los medicamentos que
pueden incrementar los niveles de TAG son: colestiramina, estrógenos y anticonceptivos
orales. Los que pueden reducir son: ácido ascórbico, asparginasa, clofibrato y colestipol.

¿Qué causa altos niveles de TAG? Exceso de peso, consumo excesivo de

calorías, edad, medicamentos, enfermedades, herencia. El tratamiento
recomendado es el perder peso, control de la ingesta de carbohidratos y azúcares, bajo
consumo de alcohol, bajo consumo de grasa total y saturada. Si con estas medidas no
disminuyen los niveles de TAG se inicia tratamiento con medicamentos tipo ácido
nicotínico y gemfibrozil; si se sufre de enfermedades hepáticas, diabetes, gota, úlceras,
arritmias cardiacas se debe advertir para el uso de ácido nicotínico.

La niacina en dosis de 1.5 g/día es un inhibidor potente de la lipólisis en el tejido

adiposo, principal productor de AG libres circulantes. La niacina induce una disminución
en la síntesis hepática de TAG, necesarios para la producción de VLDL. La LDL se
obtiene de la VLDL en el plasma, por lo tanto, disminuye tanto el TAG plasmático como el
colesterol en VLDL y LDL. Por eso, la niacina es muy útil en el tratamiento de
hiperlipoproteinemia tipo II b.

El colesterol es la segunda fracción más grande de los líquidos plasmáticos, está

distribuido en todas las células del cuerpo, especialmente en el tejido nervioso, se
encuentra en grasas de animales pero no en grasas de plantas. El colesterol es el
principal esterol del cuerpo humano (los esteroles son una clase de esteroides que
contienen un grupo hidroxilo en el C3 y una cadena alifática de al menos ocho átomos de
carbono unida al C17), tiene una cadena hidrocarbonada de ocho átomos de carbono
numerados del 20 al 27 como una continuación del núcleo esteroideo. El colesterol es un
alcohol complejo relacionado con los lípidos, el cuál puede ser sintetizado por todas las
células del cuerpo excepto las cerebrales e ingerido en los alimentos de origen animal.
Como alcohol puede formar ésteres con los ácidos grasos, que son la forma de
almacenamiento del colesterol. Se trata de un componente estructural de las membranas
celulares y de las lipoproteínas plasmáticas y es también el material a partir del cual son
sintetizados los ácidos biliares, provitaminas y las hormonas esteroideas. En los seres
humanos, el intestino y el hígado son los órganos más importantes en su síntesis. El
57
colesterol es secretado del hígado a la sangre y a la bilis, incluyendo los ácidos biliares, y
el primer paso en la síntesis de esteroides a partir del colesterol tiene lugar dentro del
hígado. Alrededor de tres cuartas partes del colesterol esterificado por el hígado es
transportado a los tejidos corporales donde penetra a las células y es usado. En la corteza
suprarrenal, el colesterol actúa como un precursor para la pregnenolona, que a su vez es
precursora de la progesterona, testosterona, estrógeno, aldosterona y cortisol. En
la piel, el colesterol es el precursor de la vitamina D que es activada por la aplicación de
luz ultravioleta. También colabora en la cualidad de resistencia de la piel al agua.

El colesterol es un constituyente primario de las lipoproteínas de baja densidad

(LDL, del inglés low-density lipoproteins), pero puede encontrarse también en
lipoproteínas de alta densidad (HDL, del inglés high-density lipoproteins) y en las de muy
baja densidad (VLDL, del inglés very low density lipoproteins).

Aunque el colesterol se considera un lípido corporal, no sirve como los lípidos

verdaderos, como fuente de energía para el metabolismo, pues el cuerpo es incapaz de
desintegrar el anillo esterol. Es el único lípido que se excreta en cantidades apreciables.

Los alimentos derivados de productos animales contienen colesterol. El colesterol

de la dieta es llamado colesterol exógeno. Alimentos particularmente ricos en colesterol
son los huevos; los productos lácteos, como la mantequilla, el queso y las cremas, y la
mayoría de las carnes. Parte del colesterol contenido en estos productos animales se
encuentra en forma de ésteres de colesterol. Por tanto, una dieta habitual contiene una
mezcla de colesterol y ésteres de colesterol.

La concentración sérica del colesterol permanece en forma notablemente

constante de un día a otro en una persona sana, pero tiende a aumentar con la edad y
cambia con las poblaciones, además de que hay variación amplia entre individuos. La
mayor parte del colesterol corporal es producido por síntesis, y se le llama colesterol
endógeno, un adulto normal sintetiza de 1.5-2.0 g de colesterol/ día, puede absorber
fácilmente el colesterol contenido en la dieta, sólo un tercio de esa cantidad es
proporcionada por los alimentos. La mayoría de los países occidentales ingieren 400-600
mg (1.1 y 2.1 mmol)/día y absorben 300-400 mg (0.8 a 1.0 mmol)/día. Cuando la ingesta
es relativamente pequeña, la absorción es eficaz, sin embargo cuando sobrepasa
aproximadamente los 500 mg (1.3 mmol)/día, la absorción es menos eficaz. Si se tiene
cuidado y se evitan las comidas ricas en colesterol, es relativamente fácil reducir la
ingesta diaria a unos 400-500 mg (1.0 a 1.3 mmol)/día, a pesar de lo cual se absorberán
unos 200 a 300 mg(0.5 a 0.8 mmol)/día. Para reducir más la absorción, es necesario
disminuir la ingesta diaria de colesterol a unos 100-300 mg (0.25 a 0.8 mmol)/día, lo que
requiere notables restricciones dietéticas, ya que la ingesta media diaria por persona de
carne, huevos y otras sustancias habituales contienen un mínimo de 500 mg (1.3 mmol).

Las grasas saturadas probablemente incrementan el riesgo de enfermedad

coronaria. Se ha observado una estrecha relación entre la dieta y este padecimiento en
cuanto a que altos niveles del colesterol sérico en sangre parecen incrementar el riesgo
de enfermedad coronaria. Los niveles de colesterol sérico en sangre aumentan con una
ingesta alta en grasas saturadas y colesterol.

58
 Cualquier anomalía, tanto en el metabolismo del colesterol como en su transporte
plasmático, parece estar relacionada con el desarrollo de aterosclerosis, endurecimiento
arterial que puede desembocar en infarto de miocardio, apoplejía, aneurisma o gangrena.
Además, los cálculos biliares, más frecuentes entre los habitantes de los países
occidentales, están formados predominantemente por colesterol, todas ellas son
enfermedades importantes y relativamente frecuentes.

En la clínica el colesterol es de gran importancia ya que se relaciona con

enfermedades del metabolismo lipoproteico tales como hipercolesterolemia e
hiperlipidemia.

Hiperlipidemia es el aumento de una o más fracciones lipídicas con un incremento

simultáneo de lipoproteínas. Las hiperlipidemias primarias son enfermedades “sui
generis”, o sea, trastornos del metabolismo lipídico que no dependen de otra enfermedad
aparente básica. A diferencia de ellas, las secundarias son consecuencia de un
padecimiento existente, y como síntoma de otra enfermedad subyacente cambian durante
el transcurso de esta.

Anteriormente el colesterol se reportaba solamente como colesterol total.

Actualmente es más significativo medir el colesterol total y las fracciones de colesterol.
Las dos fracciones comúnmente medidas son, colesterol de HDL llamado colesterol
“bueno” y colesterol de LDL referido algunas veces como colesterol “malo”. Aunque el
mecanismo aún no se conoce a la perfección, en apariencia las HDL desempeñan un
papel importante para transportar el colesterol lejos de los tejidos (transporte inverso del
colesterol). De este modo la HDL proporciona cierto grado de protección contra las
enfermedades de la arteria coronaria. Las LDL transportan el colesterol a los tejidos para
ser depositado como grasa.

Si la concentración de colesterol total es elevada en un paciente, el médico puede

usar los valores de las fracciones HDL y LDL como auxiliares para evaluar el factor de
riesgo a un infarto. Otros factores tales como la falta de ejercicio y el fumar incrementan el
riesgo.

Ningún nivel sérico de colesterol ha sido determinado como valor anormal crítico,
sin embargo en individuos mayores de 30 años, una concentración de colesterol elevada
sigue siendo uno de los mejores indicadores de las poblaciones en riesgo para el
desarrollo de cardiopatía isquémica.

Al nacer, los valores de colesterol sérico van de 50 a 100 mg/dl; a un mes del
nacimiento los niveles se aproximan de 100 a 230 mg/dl y permanecen en estos niveles
hasta los 20 y 21 años. Sin importar el tipo de muestra que se analice, ciertos factores
afectan la exactitud de los resultados de colesterol. Estos factores se denominan
preanalíticos. Los niveles de colesterol son afectados por la edad, la dieta y el sexo.
Incluso la disposición del paciente a la prueba puede afectar los resultados. Se ha
demostrado en estudios que los valores de colesterol pueden incrementarse de un 10-
20% en un paciente no relajado en comparación a un paciente relajado. Los niveles
permanecen elevados durante varias horas después de episodios de mucha tensión. Los
niveles de colesterol aumentan antes de la menstruación, alcanzan un máximo en la
59
ovulación y después declinan. Al parecer los estrógenos disminuyen los niveles de
colesterol por lo que en mujeres postmenopaúsicas el nivel tiende a incrementarse. Los
valores presentan un aumento no mayor de 3% tras ingerir alimentos. Influye también el
momento en que se toma la muestra, los valores son superiores en un promedio de 35
mg/dl en los meses de diciembre y enero. La hemólisis puede ser despreciable si la
hemólisis es poca, no tiene efecto sobre los niveles de colesterol, si hay mucha hemólisis,
se producen algunos efectos dilucionales. La mayoría de los laboratorios sitúan la
concentración plasmática de colesterol normal en el hombre en ayunas entre 120 a 220
mg/dl (3.1 y 5.7 mmol/l). En jóvenes adultos sanos el valor medio es de 175 mg/dl (4.5
mmol/l). Estas mediciones suelen realizarse después de un ayuno nocturno de 12-14
horas. Existen tablas de valores de acuerdo a la edad y sexo. Sin embargo, estos valores
no son niveles recomendados. Organizaciones tales como la American Heart Association
and the National Cholesterol Education Program Expert Panel en Estados Unidos,
recomiendan mantener el nivel de colesterol total por debajo de 200 mg/dl (< 5.18 mmol/l)
para considerarse deseable, un nivel entre 200-239 mg/dl (5.18-6.19 mmol/l) se
consideran en límite alto, y nivel igual o mayor de 240 mg/dl (>6.22 mmol/l) se considera
alto.

Material y reactivos.

1. 1 Equipo de vacutainer (camisa, tubo con anticoagulante y aguja)

2. 1 Ligadura
3. 1 frasco con torundas con alcohol.
4. 4 Tubos de ensayo de 13 x 100 mm y de 18 x 150 mm
5.1Espectrofotómetro.
6. 2 Cubetas para el espectrofotómetro.
7. 2 Micropipeta de 50 microlitros
8. 2 Pipeta Pasteur
9. 1 Pipeta de 5 ml
10. 1 Gradilla
11. 1 Búlbo de latex.
12. 1 Propipeta
13. 1 Micropipeta de 50 microlitros.
14. 1 Centrífuga
15. 1 Balanza de dos platillos.
16. 1 Escobillón
17. 1 Pizeta
18. 1 Sanitas
19. 11Kit para determinación de TAG que contiene: Solución tampón (R1), Solución de
enzimas (R2) y Solución patrón de TAG
20.- 1 Kit para la detertminación de colesterol que contiene: Patrón de colesterol (200
mg/100 ml), Reactivo de color de enzimas

Fundamento (determinación de triacilgliceroles).

Los TAG incubados con lipoproteinlipasa (LPL) liberan glicerol y AG libres. El

glicerol es fosforilado por glicerolfosfato deshidrogenasa (GPO) y ATP en presencia de
60
glicerol quinasa (GK) para producir glicerol 3-P (G3P) y ADP. El G3P es entonces
convertido a dihidroxiacetona fosfato (DHAP) y peróxido de hidrógeno por acción de
GPO. Al final el peròxido de hidrógeno reacciona con 4-aminofenazona y p-clorofenol,
reacción catalizada por la peroxidasa (POD) dando quinona y agua. La quinona da una
coloración roja cuya intensidad es proporcional a la concentración de triglicéridos
presentes en la muestra.

Fundamento (determinación de colesterol).

Método Enzimático-colorimétrico Trinder

La colesterol esterasa hidroliza los ésteres de colesterol presentes en la muestra

dando colesterol libre y ácidos grasos, una posterior oxidación enzimática mediante la
colesterol oxidasa forma peróxido de hidrógeno y colesterina.

El peróxido se valora por la reacción de Trinder, mediante el cromógeno, fenol y 4-

aminoantipirina, en presencia de peroxidasa , formando una quinonimina cuya coloración,
es proporcional a la concentración de colesterol presente en la muestra.

Ésteres de colesterol + Agua Colesterol Colesterol + Ácidos grasos

esterasa

Colesterol + Oxígeno Colesterol 4-Colesterona + Peróxido de hidrógeno

Oxidasa

Peróxido de hidrógeno + Fenol Peroxidasa Quinonimina + Agua

Desarrollo experimental.

1. Obtener sangre por punción venosa del sujeto de prueba sometido a un ayuno de
12-14 horas utilizando el equipo de vacutainer con un tubo que contenga
anticoagulante.
2. Homogenizar la muestra y centrifugar a 2500 rpm por 5 minutos.
3. Con ayuda de la pipeta Pasteur separar el plasma (sobrenadante) y transferirlo a
un tubo de 13 x 100 limpio y seco.
4. Marcar tres tubos de ensayo de 18 x 150 limpios y secos, de la siguiente manera:
M (muestra), P (patrón) y B (blanco).
5. Preparar las siguientes mezclas como se indica en la tabla:
61
A) Para triacilgliceroles

Blanco Patrón Muestra

Reactivo de trabajo 3.0 ml 3.0 ml 3.0 ml

Patrón ------ 30 microlitros -------

Plasma ------- ------ 30 microlitros

B) Para colesterol

TUBO BLANCO PATRON MUESTRA

Reactivo 1 ---- 30 µl ----

Reactivo 2 3 ml 3 ml 3 ml

Plasma ---- ---- 30 µl

6. Mezclar e incubar 10 minutos a temperatura ambiente.

7. Leer la absorbancia del patrón y de la muestra a 505 nm, frente al blanco de
reactivo. Anotar los resultados. El color es estable como mínimo 30 minutos.

RESULTADOS.

Tabla 1. Absorbancia del patrón y muestras de plasmas tratados y concentración

de triacilgliceroles y colesterol en sangre.

Condiciones del sujeto de Determinación de Determinación de

prueba Triacilgliceroles Colesterol

EQUIPO Horas [COLESTE

Edad y [ TAG] EN
de
Antecedentes familiares
ROL] EN
sexo Absorbancia SANGRE Absorbancia
ayuno SANGRE
(mg/dl)
(mg/dl)

PATRON --- ------- ------ --- ---

62
 3

FORMULA PARA LA DETERMINACIÓN DE TRIACILGLICEROLES EN SANGRE

Triglicéridos = Absorbancia de la muestra x 200

Absorbancia del patrón

Valores de referencia: Hombres: 40-160 mg/dl

Mujeres: 35-165 mg/dl

FORMULA PARA LA DETERMINACIÓN DE COLESTEROL EN SANGRE

Colesterol Total (mg/dl) = Extinción de la muestra x 200

Extinción del patrón

Valores de referencia:

Riesgo bajo: < 200 mg/dl (< 5.18 mmol/l)

Riesgo normal: 200-239 mg/dl (5.18-6.19 mmol/l)

Riesgo alto: ≥ 240 mg/dl ( > 6.22 mmol/l).

Mayor información sobre los niveles recomendables de Colesterol considerando el riesgo

cardiovascular, se pueden consultar en la NORMA Oficial Mexicana NOM-037-SSA2-
2002, Para la prevención, tratamiento y control de las dislipidemias

63
ANÁLISIS DE RESULTADOS.

 Realizar el análisis de los resultados obtenidos para cada individuo analizado.

CONCLUSIONES.

 Concluir en base al análisis de datos realizado y a los objetivos propuestos.

CUESTIONARIO

1. Mencionar 2 padecimientos que cursen con hipercolesterolemia y 2 con

hipocolesterolemia. (Describa brevemente la fisiopatología)
2. Indique dos fármacos para tratar la hipercolesteronemia, mencione la interacción
con el metabolismo.
3. Anote la clasificación de las dislipidemias según la OMS indicando el lípido
alterado.
4. Escriba la diferencia entre dislipidemias primarias y secundarias y anote cinco
causas de las secundarias.

BIBLIOGRAFÍA

1. Koolman J & KH Roehm. 2005. Color Atlas of Biochemistry. Ed. Thieme Verlag
Second edition, 162-173 pp.
2. Champe P, Harvey R & D Ferrier. 2007. Bioquímica. Ed. Lippincott, Williams &
Wilkins. 4ª. Edición. 219-236 pp
3. Lehninger A, Nelson D & M Cox. 2001. Principios de Bioquímica. Ediciones
Omega, S.A.1ª ed. 816-820 pp
4.- NORMA Oficial Mexicana NOM-037-SSA2-2002, Para la prevención, tratamiento y
control de las dislipidemias

64
 PRÁCTICA No. 8

DETERMINACIÓN DE HDL, LDL y no-HDL-C

Objetivos:

Enseñar al alumno en la técnica de determinación de HDL .

Calcular las concentraciones de LDL y colesterol no-HDL a través de un método indirecto.

Conocer el fundamento, las indicaciones y aplicaciones clínicas de la determinación de

HDL, LDL y colesterol no-HDL.

Introducción

Los lípidos, de naturaleza insoluble, pueden circular en el torrente sanguíneo en

forma de estructuras complejas, llamadas lipoproteínas, esferas formadas por un núcleo
central que contiene triglicéridos y ésteres de colesterol, rodeados por fosfolípidos y
ciertas proteínas especiales llamadas apoproteínas.

Las lipoproteínas se pueden clasificar según su composición lipídica, densidad (que

depende de la proporción entre proteínas y lípidos) y motilidad electroforética. Así se
distinguen 4 tipos fundamentales: 1) Quilomicrones (QM), 2) VLDL (very low density
lipoproteins o lipoproteinas de muy baja densidad) que poseen motilidad electroforética
pre beta, 3) LDL (low density lipoprotein o de baja densidad) con motilidad beta, 4) HDL
(high density lipoprotein o de alta densidad) con motilidad alfa. A su vez las LDL se
dividen en LDL 1 o IDL (densidad intermedia) y LDL 2, que constituyen el mayor
componente de las LDL del plasma. Las HDL se pueden subdividir en HDL 2, de mayor
tamaño y rica en lípidos, y HDL3, de mayor densidad por su alto contenido proteico.

Las apoproteinas presentes en las lipoproteinas le confieren gran parte de sus

características y funciones, ya que constituyen la porción de la molécula que es
reconocida por ciertos receptores específicos. Se conocen apoproteinas A, B, C, y E.

Las grasas de la dieta son absorbidas por la célula intestinal, donde se unen a las
apoproteínas B-48, C-II y E, formando los quilomicrones (QM), partículas ricas en
triglicéridos, que atraviesan la membrana basal del enterocito y pasan a la circulación
linfática. Desde allí pasan a la circulación general y en el endotelio vascular del tejido
adiposo y muscular, por acción de la enzima lipoproteínlipasa (LPL), activada por la apo C
II, se liberan ácidos grasos y triglicéridos. Estos pasan a la célula adiposa o muscular,
siendo reesterificados a triglicéridos, u oxidados respectivamente. Los QM permanecen
en circulación máximo 12 a 14 horas. Al perder un porcentaje de sus triglicéridos, pasan a
llamarse quilomicrón remanente que son captados por el hígado gracias a receptores
65
específicos que reconocen las apo E y B-48. Esta es la llamada vía exógena, mediante la
cual los triglicéridos de la dieta pasan al tejido adiposo y el colesterol es derivado al
hígado, donde un porcentaje será excretado a la bilis, en forma de ácidos biliares o libre.

En el hígado se sintetizan las VLDL, moléculas ricas en triglicéridos y apo E, C-II y B-100.
Su síntesis es regulada por algunas hormonas y por la dieta, ya que aumenta con la
ingesta de hidratos de carbono y es inhibida por la captación de quilomicrones
remanentes por parte de los receptores hepáticos. Desde el hígado pasan a la circulación,
donde liberan ácidos grasos y fosfolípidos por acción de la LPL. En este proceso pierde
gran parte de sus apoproteínas, siendo transformada primero a una lipoproteína de
densidad intermedia, IDL (que contiene apo E y B-100) y finalmente a una partícula rica
en colesterol, con escaso contenido en triglicéridos llamada LDL, que contiene en su
superficie solamente apo B-100. Tanto IDL como LDL tienen motilidad beta en la
electroforesis. Las LDL son captadas por receptores específicos que reconocen la apo B-
100, siendo liberado colesterol libre que inhibe a la hidroximetilglutaril coenzimo A
reductasa (HMG CoA reductasa), enzima limitante en la síntesis endógena de colesterol;
este proceso ocurre en diversos tejidos, pero el hígado es el órgano que contiene la
mayor cantidad de receptores para LDL. Algunas células captan colesterol en forma
inespecífica, es decir sin mediar receptores, proceso que ocurre principalmente en
condiciones patológicas caracterizadas por un aumento en la concentración plasmática de
colesterol.

En la medida en que las células se recambian y mueren, se libera colesterol no

esterificado al plasma, el cual se une inicialmente a las HDL, partículas sintetizadas por el
hígado e intestino, que contienen apo A I y A II. Este colesterol no esterificado se une
luego a un ácido graso, en una reacción de esterificación catalizada por la enzima
plasmática lecitina-colesterol acil transferasa (LCAT) que ocurre en la superficie de las
HDL, siendo los ésteres transferidos a las VLDL y eventualmente a las LDL. Esto
establece un círculo en el cual las LDL entregan colesterol a los tejidos extrahepáticos y
este mismo colesterol es devuelto a las LDL a través de las HDL. El riñón e hígado son
los órganos que catabolizan las HDL.1

Las enfermedades cardiovasculares, son la principal causa de mortalidad en occidente.

Unas de las moléculas involucradas en la fase temprana del desarrollo de la
ateroesclerosis, son las lipoproteínas de baja densidad (LDL), las mayores moléculas
transportadoras de colesterol en la sangre. El incremento en las lipoproteínas de baja
densidad, esta asociado a un aumento en el riesgo de muerte debido a enfermedad
cardiovascular 2.

Anteriormente el colesterol se reportaba solamente como colesterol total. Actualmente es

más significativo medir el colesterol total y las fracciones de colesterol. Las dos fracciones
comúnmente medidas son, colesterol de HDL llamado colesterol “bueno” y colesterol de
LDL referido algunas veces como colesterol “malo”. Aunque el mecanismo aún no se
66
conoce a la perfección, en apariencia las HDL desempeñan un papel importante para
transportar el colesterol lejos de los tejidos (transporte inverso del colesterol). De este
modo la HDL proporciona cierto grado de protección contra las enfermedades de la arteria
coronaria. Las LDL transportan el colesterol a los tejidos para ser depositado como grasa.

Tambien, recientemente se ha sugerido el uso del colesterol no-HDL (no-HDL-c) como

una mejor herramienta para predecir la muerte por enfermedad cardiovascular 3. El no-
HDL-c, se define como la diferencia entre el valor de colesterol total y el de las HDL, de
esta manera no solo incluye el colesterol de las LDL, sino que comprende las fracciones
de lipoproteínas de densidad intermedia (IDL), y las lipoproteínas de muy baja densidad
(VLDL). La importancia del análisis del no-HDL-c como predictor y blanco para el
tratamiento de enfermedad cardiovascular, radica en que se incluye lipoproteínas como
los remanentes de VLDL, las cuales por ser moléculas pequeñas y densas, son altamente
aterogenicas 4,5,8.

El uso potencial del no-HDL-c, para predecir el riesgo de muerte por enfermedad
cardiovascular, ha sido demostrado por diferentes estudios, sin embargo son pocos los
trabajos donde se ha evaluado, como predictor del riesgo al desarrollo de enfermedad
cardiovascular. Por otra parte, el no-HDL-c, ha demostrado ser un predictor de mortalidad
en hombres y mujeres, tan bueno como el colesterol de las LDL5,6,8

Material y reactivos.

1. 1 Camisa y tubo con anticoagulante para vacutainer

2. 1 Ligadura
3. 1 frasco con torundas con alcohol.
4. 1 Aguja para vacutainer.
5. 2 Cubetas para el espectrofotómetro.
6. 1 Micropipeta de 100 microlitros
7. 4 Tubos de ensayo.
8. 1 Espectrofotómetro.
9. 1 Pipeta Pasteur
10. 1 Pipeta de 2 ml
11. 1 Gradilla
12. 1 Búlbo de latex.
13. 1 Propipeta
14. 1 Centrífuga
15. 1 Balanza de dos platillos.
16. 1 Kit para determinación de HDL que contiene:
• R1 (Reactivo 1):
• R 2 (Reactivo 2):
• HDL/LDL Cal: Calibrador. Suero humano liofilizado
17. 1 Escobillón
67
18. 1 Pizeta
19. 1 paq Sanitas

Fundamento

Determinación directa del HDL (colesterol de lipoproteínas de alta densidad) sin

necesidad de pre-tratamiento o centrifugado de la muestra.

El método se basa en las propiedades de un detergente que solubiliza sólo la fracción

HDL, de forma que se libera reaccionando con la colesterol esterasa, la colesterol oxidasa
y los cromógenos.

Las lipoproteínas LDL, VLDL y quilomicrones son inhibidas debido a la adsorción del
detergente en sus superficies haciéndolas resistentes a la enzima.

1° Eliminación de lipoproteínas no-HDL

Ésteres de colesterol Colesterol esterasa Colesterol+ Ácidos grasos

→

Colesterol+O2 Colesterol oxidasa 4−Colestenona+ H 2 O2

→

H 2 O 2 Catalasa 2 H 2 O+O2
→

2° Medición de HDL

2 H 2 O+ HDAOS +4− AA Peroxidasa Quinonimina+ 4 H 2 O

→

HDAOS = N-(2-hidroxi- 3- sulfopropil)-3,5-dimetoxianilina

4-AA = 4-Aminoantipirina

La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de HDL presente en la

muestra ensayada.

Desarrollo experimental.

68
 1.- Obtener sangre por punción venosa del sujeto de prueba sometido a un ayuno de
12-14 horas utilizando el equipo de vacutainer con un tubo que contenga
anticoagulante (libre de citrato).
2.- Centrifugar 5 minutos a 2500 rpm, para lograr la separación del plasma.
3.- Con ayuda de la pipeta Pasteur separar el plasma (sobrenadante) y transferirlo a
un tubo de 13 x 100 limpio y seco.
4.-Marcar tres tubos de ensayo de 18 x 150 limpios y secos, de la siguiente manera: M
(muestra), P (patrón) y B (blanco).
5.- Preparar las siguientes mezclas como se indica en la tabla:

6. Pipetear en una cubeta:

Blanco Patrón Muestra

R1 (mL) 2 2 2
Patrón (µL) --- 20 ---
Muestra (µL) --- --- 20

7. Mezclar e incubar 5 min a 37ºC

8. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada.

9. Leer la absorbancia (A1) del Patrón y la muestra a 600 nm .

10. Añadir:

Blanco Patrón Muestra

R2 (µL) 670 670 670

11. Mezclar e incubar 5 minutos a 37ºC.

12. Leer la absorbancia (A2) frente al Blanco de reactivo.

13. Cálculos:

Determinación De HDL:

∆A= A2 – A1 .

Valores de referencia para HDL:

69
 Hombres Mujeres
Riesgo menor > 50 mg/dL > 60 mg/dL
Riesgo normal 35 - 50 mg/dL 45-60 mg/dL
Riesgo elevado < 35 mg/dL <45 mg/dL
Determinación De LDL :

Fórmula de Friedewald 7.

La fórmula de Friedewald nos permite averiguar la fracción LDL (LDL) si conocemos el

colesterol total (CT), la fracción HDL y los triglicéridos (TAG). Su cálculo se realiza del
siguiente modo:

LDL = CT - (HDL + TG/5) en mg/dl

Existe, no obstante, una limitación a la utilización de esta fórmula y es cuando los

triglicéridos superan los 400 mg/dl situación que como conocemos no es excepcional.
También, aunque es mucho menos frecuente, cuando existe una disbetalipoproteinemia,
ya que las beta- VLDL contienen más colesterol que las VLDL normales ó si el paciente
es homocigoto para la apo E.

Determinación de Colesterol No- HDL- c 8 :

No-HDL-c = Colesterol Total – HDL

Niveles recomendables de Colesterol considerando el riesgo cardiovascular, según,

la NORMA Oficial Mexicana NOM-037-SSA2-2002, Para la prevención, tratamiento y
control de las dislipidemias9:

Resultados:

70
 Tabla 1. Absorbancia del patrón y plasmas de las muestras obtenidas y concentración
de HDL en sangre.

EQUIPO ABSORBANCIA [HDL] EN SANGRE (mg/dl)

PATRÓN -----

6
ANÁLISIS DE RESULTADOS.

Para el análisis de los resultados elaborar una tabla similar a la Tabla 2, que contenga
los datos indicados en cada columna (hacer el cálculo correspondiente):

Tabla 2. Absorbancia del patrón y plasmas de las muestras obtenidas y concentración

de HDL en sangre.

Condiciones del sujeto Determinaciones realizadas en la muestra

de prueba analizada

Equipo [Colest
Horas Edad [No-
Antecedentes [HDL], [TAG]. erol [LDL]
de y HDL-c]
ayuno sexo
familiares (mg/dl) (mg/dl) Total]. (mg/dl).
(mg/dl).
(mg/dl)

1
2
3
4
5
6

71
  Realizar el análisis de los resultados obtenidos para cada individuo analizado
(discutir Tabla No. 2).

CONCLUSIONES.

 Concluir en base al análisis de datos realizado y a los objetivos propuestos.

CUESTIONARIO

1.- ¿Cual es la finalidad de la determinación de No-HDL-C ?

2.- ¿Cual es la función de las lipoproteínas?

3.- Describa el metabolismo de las lipoproteínas

4.- Escriba las recomendaciones a un paciente con riesgo de muerte por enfermedad
cardiovascular .

BIBLIOGRAFÍA.

1.- Pía de la Maza M, Bunout D. PATOGÉNESIS Y MANEJO DE LAS DISLIPIDEMIAS.

National Institutes of Health Publication 2001; 01;3305.
2. - National Cholesterol Education Program. Second report of the Expert Panel on
Detection, Evaluation, and Treatament of High Blood Cholesterol in Adults (adult
Treatment Panel II). Circulation. 1994;89:1329-1445.
3.- Frost PH, Havel, RJ. Rationale for use of non-high density lipoprotein cholesterol rather
than low-density lipoprotein cholesterol as a tool for lipoprotein cholesterol screeinig and
assessment of risk and therapy. Am J Cardiol. 1998;81:26B-31B.
4.- Krauss RM. Atherogenicity of triglyceride-rich lipoproteins. Am J Cardiol. 1998;81:13B-
17B.
5.- Cui,Y., Blumenthal, S, Flaws, JA, Whiteman, M, Langenberg, P, Bachorik, PS, Bush,
T. Non-High Density Cholesterl level as a predictor of cardiovascular disease mortality.
Arch Inter Med. 2001;161:1413-1419
6.- Rywik, S, Manolio, T, Pajak, A, Piotrowski, W, Davis, C, Broda, G, and Kawalec, E.
Association of lipids and lipoprotein level with total mortality and mortality caused by
cardiovascular and cancer diseases (Poland and United Status Collaborative Study on
Cardiovascular Epidemiology). Am J Cardio. 1999;84:540-548.
7.- Friedewald WT, Levi, RI, Fredrickson DS. Estimation of the concentration of low-
density lipoprotein cholesterol in plasma, without use of the preparative ultracentrifuge.
Clin Chem. 1972;18:499-502.
8.- Contreras F., Lares M., Castro J.,Magaldi L., Velasco M., Determinación del colesterol
no-HDL,en pacientes diabéticos e hipertensos. Archivos Venezolanos de Farmacología y
Terapéutica, 2008; 27;1.
9.- NORMA Oficial Mexicana NOM-037-SSA2-2002, Para la prevención, tratamiento y
control de las dislipidemias.

72
 PRÁCTICA No. 9

DETERMINACIÓN DE TRANSAMINASAS SÉRICAS

OBJETIVOS.

 Aprender el papel de las transaminasas AST y ALT en el metabolismo de los

compuestos nitrogenados.

 Realizar las determinaciones de las transaminasas séricas.

 Conocer la interpretación clínica de las transaminasas.

Los aminoácidos son biomoléculas que a través de su oxidación hace una

contribución significativa de energía para el metabolismo. La fracción de energía obtenida
a partir de los aminoácidos, ya sea a partir de la dieta o de los tejidos varía enormemente
dependiendo el tipo de organismo y las condiciones metabólicas. Por ejemplo, los
carnívoros obtienen una gran cantidad de energía de los aminoácidos después de una
comida abundante en carne (hasta el 90%) mientras que los herbívoros solo obtienen una
pequeña cantidad por esta ruta.

En los animales, los aminoácidos sufren degradación oxidativa en 3 diferentes

condiciones metabólicas que son:

 Durante la síntesis o degradación normal de proteínas.

 Cuando una dieta rica en proteínas es ingerida

 Durante la inanición o en la diabetes mal controlada.

Bajo cualquiera de estas condiciones los aminoácidos pierden sus grupos aminos para
formar α-cetoácidos, que son los “esqueletos de carbono de los aminoácidos. Los α-
cetoácidos sufren oxidación para formar CO2 y H2O o pueden proveer 3 o 4 átomos de
carbono que pueden ser convertidas por gluconeogénesis en glucosa, que es el principal
combustible para el cerebro, músculos y otros tejidos.

Al igual que los carbohidratos y los lípidos, el proceso de degradación de los

aminoácidos converge en la vía de catabolismo central que es el ciclo de Krebs aportando
los esqueletos de carbono para obtener energía.

73
 Una característica importante de los
aminoácidos es que cada uno de ellos tiene
un grupo amino. Por lo tanto un punto
importante antes de que el esqueleto de
carbono de los aminoácidos entre a la vía de
degradación es que el grupo amino sea
separado del esqueleto de carbono y sea
dirigido a las vías del metabolismo de los
grupos amino (Ver figura).

El nitrógeno es abundante en la naturaleza, pero es fácilmente utilizado en la

mayoría de los procesos biológicos. Debido a que solo pocos microorganismos pueden
convertir el nitrógeno a su forma útil en biología que es NH3, los grupos amino son
cuidadosamente regulados en los sistemas biológicos (Ver la siguiente figura).

Los aminoácidos
obtenidos de la dieta son la
principal fuente de grupos amino.
Estos aminoácidos son
metabolizados en el hígado o los
músculos en donde se les retira
el grupo amino para dirigirlos a la
vía de degradación en forma de
urea o para reutilizarlos
formando nuevos aminoácidos.
Los enzimas que se encargan de
transferir los grupos amino de los
aminoácidos son las
transaminasas.

Las transaminasas o
aminotransferasas son enzimas del grupo de las transferasas que catalizan la reacción
de transferencia de los grupos amino (-NH2) de un aminoácido a un α-cetoglutarato (un α-
cetoácido) y viceversa. Las transaminasas más conocidas son la AST y la ALT.
La alaninoaminotransferasa (ALT o GTP) y la aspartatoaminotransferasa (AST o
GTO) son enzimas que se encuentran en varios órganos y tejidos del organismo. La AST
se encuentra en el hígado, miocardio, riñón, encéfalo y musculatura esquelética, mientras
que la ALT se encuentra principalmente en el hígado en donde tiene concentraciones
mucho más elevadas que en los demás tejidos.
74
La enzima AST cataliza la siguiente reacción:

Aspartato + α-Cetoglutarato Oxalacetato + Glutamato

La ALT cataliza esta otra reacción:

Alanina + α-Cetoglutarato Piruvato + Glutamato

Estas enzimas son importantes en la eliminación de los grupos amino de los

aminoácidos y de la generación de nuevos. Su medición en sangre se utiliza para
diagnosticar y rastrear muchas enfermedades relacionadas con daño tisular y en especial
para evidenciar la presencia de daño hepático. Sus valores normales se indican en los
partes médicos de laboratorio y varían según la metodología analítica adoptada. Un valor
elevado de las transaminasas, sobre todo la AST suele ser indicativo de daño hepático.
Las transaminasas requieren la coenzima piridoxal-fosfato, que se convierte en
piridoxamina en la primera fase de la reacción, cuando un aminoácido es convertido en un
α-cetoácido. La piridoxamina enlazada a la enzima reacciona con alanina, oxalacetato o
alfa-cetoglutarato, dando piruvato, ácido aspártico o ácido glutámico, respectivamente.
Cuando el azúcar en sangre es bajo, el organismo debe romper las proteínas en
aminoácidos, a expensas del tejido muscular. La preferencia de las transaminasas del
hígado por el oxalacetato o el alfa-cetoglutarato desempeña un papel fundamental en la
canalización del nitrógeno desde el metabolismo de los aminoácidos a asparagina y
glutarato, para la conversión a urea que sirve como excreción del nitrógeno. Del mismo
modo sucede en los músculos, donde el uso del piruvato en la transaminación produce
alanina, que es llevada por la corriente sanguínea al hígado. Allí, otras transaminasas
regeneran el piruvato, que proporciona un valioso precursor para la gluconeogénesis.
Este último ciclo denominado ciclo de la alanina es análogo al ciclo de Cori, que permite el
metabolismo anaerobio en los músculos.

Valor diagnóstico de las aminotransferasas en plasma.

Las aminotransferasas son enzimas intracelulares cuyos niveles en plasma son

normalmente bajos, la presencia de niveles plasmáticos elevados denota daño en las
células con alto contenido de estas enzimas; por ejemplo en un trauma físico o un
proceso patológico que cause lisis celular y ocasione liberación de las enzimas
intracelulares a la sangre.

La AST y la ALT se elevan en el plasma en casi todas las enfermedades

hepáticas, pero se encuentran particularmente elevadas en condiciones que causen
necrosis celular extensa, tales como hepatitis viral grave, daño tóxico y colapso

75
circulatorio prolongado. La ALT es más específica que la AST; las determinaciones
seriadas de la enzima son útiles para determinar el curso del daño hepático.

Es importante nunca interpretar un resultado de transaminasas aisladamente,

pues la variación de estas enzimas es grande. En la mayoría de las enfermedades
hepáticas la ALT es siempre superior a la AST excepto en la hepatitis alcohólica.

Los niveles de transaminasas son significativamente menores en las mujeres que

en los hombres e incluso también la edad altera los valores; existen factores que pueden
alterar los resultados. La realización de ejercicio físico extenuante hasta 24 horas antes
de la realización del examen puede triplicar el resultado de AST, la masa corporal elevada
pueden tener resultados entre 40-50% superiores en ambas transaminasas, una anemia
hemolítica puede aumentar principalmente la AST, la práctica de ejercicios aeróbicos de
forma rutinaria reduce hasta un 20% la ALT, la existencia de daño muscular incrementa
de modo significativo la AST y moderadamente la ALT y, finalmente, hasta el momento
del día en el que se toma la muestra de sangre influye en el resultado; si es parte de la
tarde la AST puede tener una variación del 45% en comparación con sangre retirada en la
mañana.

MATERIAL Y REACTIVOS.

1. 1 Frasco con torundas

2. 1 Equipo de vacutainer (camisa, tubo y aguja)
3. 4 Tubos de ensayo
4. 1 Pipeta Pasteur.
5. 2 Pipetas de 2 ml
6. 2 Búlbo de latex
7. 2 Propipeta.
8. 1 Micropipeta de 100 microlitros.
9. 1 Gradilla
10. 2 Cubetas para el espectrofotómetro
11. 2 Espectrofotómetro
12. 1 Balanza de 2 platillos y centrífuga.
13. 1 Baño de agua
14. 1 Pizeta
15. 1 Escobillón
16. 1 Sanitas.
17. 1 Kit paraALT
18. 1 Kit para AST.

FUNDAMENTO

76
DETERMINACIÓN DE ALT

La alanina aminotransferasa (ALT) inicialmente llamada transaminasa glutámico pirúvica

(GPT) cataliza la transferencia reversible de un grupo amino de la alanina al α-
cetoglutarato con formación de glutamato y piruvato. El piruvato producido es reducido a
lactato en presencia de lactato deshidrogenasa (LDH) y NADH:

Alanina + α-cetoglutarato ALT Glutamato + Piruvato

Piruvato + NADH + H+ LDH Lactato + NAD+

La velocidad de la disminución de la concentración de NADH en el medio, determinando

fotométricamente, es proporcional a la concentración catalítica de ALT en la muestra
ensayada.

DETERMINACIÓN DE AST

La aspartato aminotranferasa (AST) inicialmente llamada transaminasa glutamato

oxaloacética (GOT) cataliza la transferencia reversible de un grupo amino del aspartato al
α-cetoglutarato con formación de glutamato y oxalacetato. El oxalacetato producido es
reducido a malato en presencia de malato deshidrogenasa (MDH) y NADH:

Aspartato + α-cetglutarato AST Glutamato +Oxalacetato

Oxalacetato + NADH + H+ MDH Malato + NAD+

La velocidad de disminución de la concentración de NADH ene l medio, determinada

fotométricamente, es proporcional a la concentración catalítica de AST en la muestra
ensayada.

DESARROLLO EXPERIMENTAL.

1. Obtener una muestra de sangre por el método de extracción con tubos al vacio de un
sujeto de prueba que tenga un ayuno previo de 8- 10 horas.
2. Dejar que se forme el coagulo y centrifugar a 2500 rpm durante 5 min.
3. Separar el suero que se encuentra en la parte superior del tubo con la ayuda de una
pipeta Pasteur y pasarlo a un tubo limpio y seco. Es importante que el suero no este
hemolizado.
4. Preparar tubos de 13 X 100 para cada muestra y control de AST y ALT
respectivamente de la siguiente manera:
AST.- Agregar 2 ml de reactivo de trabajo para AST.
ALT.- Agregar 2 ml de reactivo de trabajo para ALT.
Incubar todos los tubos en baño maría durante 3 minutos a 37°C.
5. Adicionar a cada uno de los tubos 200 µl (0.2 ml) de suero a cada tubo
respectivamente y agitar suavemente.
77
6. Incubar los tubos en baño maría a 37 ºC durante un minuto.
7. Leer la absorbancia de las muestras a 340 nm y anote los resultados.
8. Continúe incubando los tubos a 37 °C y lea las absorbancias a 2, 3 y 4 minutos. El
cambio en las lecturas debe ser constante.
7. Determine el promedio de absorbancia por minuto ( A/min).
Nota: Si la concentración de la muestra es superior al limite de linealidad, diluir 1/10 con ClNa 9 g/L y multiplicar el
resultado final por 10.

Cálculos:
U I /L =  A/ min x 1750

VALORES DE REFERENCIA
A 37ªC AST (U/L) ALT (U/L)

Hombres 38 40

Mujeres 31 32

RESULTADOS.

 Anote los valores de todos los equipos y realice una tabla con dicho valores. La
tabla debe contener: Equipo, sexo del sujeto de estudio, horas de ayuno, valores
de AST y ALT obtenidos en UI/L.

Edad
Equipo Horas de AST ALT
y Observaciones
No. ayuno (U/L) (U/L)
Sexo

ANÁLISIS DE RESULTADOS.
78
  Realizar el análisis de los resultados obtenidos.

CONCLUSIONES.

 Concluir en base al análisis de datos realizado y a los objetivos propuestos.

BIBLIOGRAFÍA.

1. Koolman J & KH Roehm. 2005. Color Atlas of Biochemistry. Ed. Thieme Verlag
Second edition, 437 pp.
2. Champe P, Harvey R & D Ferrier. 2007. Bioquímica. Ed. Lippincott, Williams &
Wilkins. 4ª. Edición. 519 pp
3. Lehninger A, Nelson D & M Cox. 2001. Principios de Bioquímica. Ediciones
Omega, S.A.1ª ed. 1264 pp

CUESTIONARIO.

1.- Indique las vías de degradación de los aminoácidos.

2.- ¿Que es la AST y ALT, que reacciones catalizan? Explique.

3.- Explique al menos 3 patologías que presenten valores elevados de las transaminasas
y cuales serian estos valores.

4.- Mencione al menos 3 factores no patológicos que puedan elevar los valores de
transaminasas en sangre.

79
 PRÁCTICA No. 10

DETERMINACIÓN DE UREA Y ÁCIDO ÚRICO

OBJETIVOS.

 Conocer la importancia de la urea y el ácido úrico en el metabolismo de los

compuestos nitrogenados.

 Determinar las concentraciones de urea y ácido úrico en el laboratorio.

 Recalcar la importancia de estos exámenes en el diagnóstico de algunas

patologías.

INTRODUCCIÓN.

El Nitrógeno (N) junto a otros elementos, como Carbono, Oxigeno e Hidrogeno

participan en la constitución de las moléculas orgánicas fundamentales de la materia viva.
Entre los compuestos constituyentes del organismo, el N forma parte de un grupo de
compuestos orgánicos de gran jerarquía biológica a los cuales están asignadas funciones
muy importantes, como lo son las proteínas y los nucleótidos. Este elemento constituye
por si solo el 3% del peso corporal.

En la atmósfera, el N molecular (N2), es muy abundante. Esta molécula es casi no

reactiva o inerte debido a su triple enlace que la estabiliza. Antes de poder ser utilizado
por los animales, el N atmosférico debe ser “fijado” mediante una cadena de reacciones.
En primer lugar el nitrógeno debe ser reducido de N 2 a NH3 (amoniaco) en un proceso
llamado amonificación, llevado a cabo por microorganismos y descargas eléctricas en la
naturaleza. Posteriormente, el NH3 es oxidado a nitritos y nitratos (NO 2- y NO4=) por
bacterias saprofitas, proceso llamado nitrificación. En el suelo, estas formas oxidadas
son “asimiladas” por los vegetales incorporando el N a estructuras biológicas, los
aminoácidos, proteínas y demás compuestos; de ésta manera este elemento pasa a
formar parte de la cadena alimentaria, en la cual el ser humano es un eslabón más.
El estudio del metabolismo de los compuestos nitrogenados dentro del organismo
comprende uno de los grandes temas de la Bioquímica. En esta ocasión nos enfocaremos
en estudiar el metabolismo de las proteínas y los aminoácidos; y el metabolismo de
nucleótidos.

80
METABOLISMO DE AMINOÁCIDOS.
Los aminoácidos introducidos por la dieta (exógenos) se mezclan con aquellos
liberados en la degradación de proteínas endógenas y con los que son sintetizados de
novo. Estos aminoácidos se encuentran circulando en sangre y distribuidos en todo el
organismo sin que exista separación alguna entre aminoácidos de diferente origen.
El destino más importante de los aminoácidos es su incorporación a cadenas
polipeptídicas durante la biosíntesis de proteínas específicas del organismo. En segundo
lugar, muchos aminoácidos son utilizados para la síntesis de compuestos nitrogenados
no proteicos de importancia funcional. Finalmente los aminoácidos en exceso, como no
pueden almacenarse, son eliminados por orina o bien se utilizan principalmente con fines
energéticos. En éste caso los aminoácidos sufren primero la pérdida del grupo amino, lo
cual deja libre el esqueleto carbonado. El grupo nitrogenado que se desprende como
amoníaco, es eliminado en el ser humano principalmente como urea.

Catabolismo de aminoácidos.
La degradación de aminoácidos si inicia generalmente con la separación de su
grupo α-amino (desaminación). Luego el resto nitrogenado seguirá un camino distinto del
que tomará la cadena carbonada. Antes de la degradación los aminoácidos se
interconvierten entre ellos, transfiriendo el grupo amino de una esqueleto carbonado a
otro (transaminación).

Reacción de Transaminación.
La reacción de transaminación comprende la transferencia de un grupo α-amino de
un aminoácido a un α-cetoácido. El aminoácido se convierte en un cetoácido y el
cetoácido aceptor del grupo amina, en el aminoácido correspondiente (Figura 1). Esta
transferencia es realizada por las enzimas aminotransferasas o también llamadas
transaminasas. Puesto que las transaminaciones son libremente reversibles, las
transaminasas pueden funcionar tanto en el catabolismo como en la biosíntesis de
aminoácidos.

Figura 1. Transaminación: ecuación general. La

constante de equilibrio de esta reacción es cercana
a 1, considerándose libremente reversible mientras
excitan los sustratos y productos correspondientes
en ambos lados de la ecuación.

81
 Las transaminasas más importantes son la AST y la ALT como se discutió en la
práctica anterior.

Desaminación Oxidativa.
Teniendo en cuenta los componentes del par obligado, todos los grupos α-amino
de los aminoácidos son finalmente transferidos al α-cetoglutarato mediante
transaminación, formando L-glutamato. A partir de este aminoácido el grupo nitrogenado
puede ser separado por un proceso denominado desaminación oxidativa, una reacción
catalizada por la L-glutamato deshidrogensas, una enzima omnipresente de los tejidos
de mamíferos que utiliza como coenzima NAD + o NADP+ como oxidante. En la reacción
directa, generalmente se utiliza NAD + y se forma α-cetoglutarato y amoníaco: NH 3
(Figura 4); este último, al pH fisiológico del medio se carga con un protón, presentándose
casi en su totalidad como ión amonio (NH4+) y es eliminado en forma de urea.

BIOSÍNTESIS DE UREA.
El metabolismo de los aminoácidos concluye con su catabolismo y formación de
sustancias factibles de ser excretadas como lo es la urea. En forma práctica, la biosíntesis
de este metabolito final encierra cuatro etapas, incluyendo las reacciones recién tratadas:
1. Transaminación
2. Desaminación oxidativa
3. Transporte de amoníaco
4. Ciclo de la urea.

Ciclo de la urea.
Un hombre que consume 300g de carbohidratos, 100g de grasa y 100g de
proteínas diariamente, excreta alrededor de 16,5g de nitrógeno al día: 95% por la orina y
5% por las heces. Para los sujetos que consumen una dieta occidental, la urea sintetizada
en el hígado, liberada hacia la circulación y eliminada por los riñones, constituye de 80 a
90% del nitrógeno excretado.

Urea

82
 El ciclo de la urea fue descrito por Sir Hans Krebs y colaboradores. De hecho, el
ciclo de la urea fue descrito antes que el ciclo del ciclo de Krebs TCA. En los mamíferos
terrestres el ciclo de la urea es el mecanismo de elección para la excreción del nitrógeno y
se lleva a cabo exclusivamente en el higado. Los dos nitrógenos de cada molécula de
urea provienen de dos fuentes, el amoníaco libre y el grupo amino del aspartato. El ciclo
se inicia y finaliza en el aminoácido ornitina.

CICLO DE LA UREA. El ciclo de la urea

se lleva a cabo en cinco pasos
mediados por enzimas de los cualos 2
son mitocondriales y 3
estramitocondriales. El primer paso es
la transformación de NH3 en carbamoil
fosfato.

Cinco enzimas catalizan las reacciones de éste ciclo. De los seis aminoácidos que
participan, solo el N-acetilglutamato funcionan como activador enzimático; los otros
actúan como transportadores de los átomos que finalmente se convertirán en urea. En los
mamíferos, la principal función de la ornitina, citrulina y argininosuccinato es la síntesis
de la urea. Las reacciones del ciclo están bicompartimentalizadas, algunas reacciones se
llevan a cabo en la matriz mitocondrial, en tanto que otras ocurren en el citosol (Figura 8).
En forma esquemática podemos enumerar las etapas de la biosíntesis de urea de la
siguiente manera:

1. Inicio de la biosíntesis: Carbomoil fosfato sintetasa I.

La biosíntesis de urea comienza con la condenación de bióxido de carbono,

amoníaco y 2 ATP, para formar carbamoil fosfato, reacción catalizada por la carbamoil
fosfato sintetasa I (CPSI).

83
 La CPSI es la enzima limitante de la velocidad, o marcapaso, del ciclo de la urea. Esta
enzima reguladora es activa sólo en presencia del activador alostérico N-acetilglutamato,
cuya unión induce un cambio conformacional que aumenta la afinidad de la sintetasa por
el ATP.
2. Formación de citrulina.

La L-ornitina transcarbamoilasa cataliza la transferencia de la porción carbamoil

del carbamoil fosfato a un aminoácido ornitna, formando citrulina y ortofosfato. Esta
reacción se lleva a cabo en la matriz mitocondrial; la formación del sustrato ornitina y la
metabolización subsecuente del producto, citrulina, se lleva a cabo en el citosol. Por tanto
la entrada como la salida de ornitina y citrulina de la mitocondria implica la participación
de un sistema de transporte situado en la membrana interna de esta organela, formado
por un contratransportador citrulina/ornitina.
3. Formación de argininosuccinato.

La reacción de la argininosuccinato sintetasa une aspartato y citrulina a través

del grupo amino del aspartato, y suministra el segundo nitrógeno de la urea. La reacción
requiere ATP para formar un intermediario citrulina-AMP y luego, desplazando el AMP por
aspartato forma citrulina.
4. Formación de arginina y fumarato.

La escisión del argininosuccinato, catalizado por la argininosuccinasa o arginino

succinato liasa, retiene nitrógeno en el producto arginina y libera el esqueleto del
aspartato como fumarato. La adición de agua al fumarato genera malato, y la oxidación
de éste, dependiente de NAD+, forma oxalacetato. El esqueleto carbonado del
aspartato/fumarato, actúa como un transportador para el paso del nitrógeno del glutamato
a un precursor de la urea.
5. Formación de ornitina y urea.

La reacción final del ciclo de la urea, la ruptura hidrolítica de la arginina caltalizada

por la arginasa hepática, libera urea. El otro producto, ornitina, reingresa a la mitocondria
hepática para ser utilizada nuevamente en el ciclo de la urea. Cantidades menores de
arginasa también se encuentran en los tejidos renal, cerebral, mamario, testicular y en la
piel. La ornitina y la lisina son inhibidores potentes de la arginasa, y por tanto, compiten
con la arginina.

TOXICIDAD DEL AMONÍACO.

El amoníaco es tóxico y afecta principalmente al sistema nervioso central. La
encefalopatía asociada a defectos severos del ciclo de la urea se debe a aumento de
amoníaco en sangre y tejidos. Como el hígado es el principal órgano encargado de la
eliminación del amoníaco, cuando hay una falla o insuficiencia hepática grave, la
84
amonemia asciende y se produce un cuadro de intoxicación, que pude llevar al coma e
incluso la muerte.
Como se menciono anteriormente, al pH fisiológico de los fluidos del organismo, la casi
totalidad, alrededor del 99%, del amoníaco que es una molécula neutra se convierte en
ión amonio, el cual no puede atravesar la membranas celulares. Se han postulados
diferentes mecanismos que podrían contribuir a la notable toxicidad del amoníaco.

1. Acumulación de glutamina. Los niveles de esta sustancia se incrementan

notablemente en las hiperamonemias. La acumulación de glutamina en el cerebro,
especialmente en astrositos, produce efecto osmótico, aumentando la PIC (presión
intracraneana) y dando hipoxia cerebral.
2. Inhibición de la lanzadera malato-aspartato. La síntesis exagerada de glutamina
reduce los niveles de glutamato, esto inhibe la lanzadera. Se produce aumento de lactato
y disminución del pH cerebral.
3. Actividad de la glucólisis. El amoníaco estimula la fosfofructoquinasa y con ello la
actividad glucolítica. Aumenta el lactato y el valor de la relación NADH/NAD+.
4. Inhibición del ciclo de Krebs. El aumento de amoníaco en la mitocondria desvía la
reacción de la glutamato deshidrogenasa hacia la aminación de α-cetoglutarato para
formar glutamato. Este “drenaje” de uno de los intermediarios del ciclo del ácido cítrico
deprime la marcha de esta vía de oxidación, de la cual depende exclusivamente el
cerebro para proveerse de energía. El descenso de la concentración de ATP en las
neuronas ocasiona graves trastornos en su actividad, lo que conlleva en última instancia a
su muerte.

Se conocen algunos cuadros clínicos por bloqueos parciales en el ciclo de la urea.

Se caracterizan por hiperamonemia, retraso mental, vómitos y aversión a comidas ricas
en proteínas.
En las enfermedades hepáticas, en que hay pérdida de tejido funcional hepático,
pueden alcanzarse niveles elevados de NH3. Aún cantidades muy pequeñas de
NH3 son tóxicas para el sistema nerviosos central y pueden causar habla defectuosa,
visión borrosa y en los casos más graves coma y muerte.
Con la insuficiencia renal progresiva y los trastornos de la filtración glomerular
puede haber retención o defectos de excreción de las diversas sustancias del plasma
sanguíneo. Las más importantes son los productos del desdoblamiento del metabolismo
de las proteínas, como la urea, creatinina y ácido úrico. Las determinaciones de nitrógeno
de urea y creatinina son dos de los estudios más solicitados para detectar la capacidad
del riñón para excretar desechos metabólicos. La elevación de estos valores se emplea,
junto con otros, como indicador de la necesidad de diálisis en pacientes con insuficiencia
renal crónica. La interpretación de los valores del nitrógeno de urea exige el conocimiento
de la ingestión de proteína exógena y de líquidos, y las condiciones que pueden
incrementar la producción endógena de urea (por ejemplo, la actividad muscular, un
85
traumatismo, la infección, fiebre, dieta alta en proteínas, dieta muy restringida, el ayuno o
la inanición). Cualquiera de estas variables puede aumentar la concentración sanguínea o
urinaria que en sí misma no es un reflejo de la depuración renal de urea.
Pueden usarse las dos pruebas, con las debidas precauciones en la interpretación,
como indicadores aproximados de mejoría o deterioro de la función renal del individuo.
La eliminación de la urea se verifica principalmente en el riñón a través de un
proceso complejo que incluye filtración, secreción y resorción. La urea se filtra con libertad
a través de los glomérulos. Más allá del túbulo contorneado proximal, el destino de la urea
depende del estado de hidratación del paciente. Cuando éste se encuentra deshidratado,
se reduce la depuración y excreción de la urea. Durante la diuresis, la depuración y
excreción de la urea se incrementan.
Los trastornos importantes de la filtración glomerular ocasionan uremia o síndrome
urémico que resulta de la reducción severa en las funciones excretoras renales; reflejan el
estadio final hacia el que caminan todas las insuficiencias renales progresivas y presentan
una gran variedad de cambios en los exámenes de laboratorio. La uremia se caracteriza
por grados variables de azoemia grave, acidosis y, desequilibrio hidroelectrolítico, lasitud
y depresión mental que conducen al coma. Aunque la uremia puede presentarse por
anormalidades extrarenales primarias, es más común que se asocie con infección renal
crónica, con enfermedad cardiovascular hipertensiva o con arterionefroesclerosis.
Los valores de urea en sangre (azotemia) van normalmente de 20 a 30 mg/dL
como término medio, pero en ciertos casos, todavía normales se registran cifras algo
inferiores o superiores.
La urea alta o hiperazotemia, sólo puede considerarse ciertamente como tal la que
supera los 50 mg, a no ser que se conozcan para aquel individuo cifras anteriores más
bajas. Hay que tener en cuenta también, como en otros análisis, las medias usuales en
cada laboratorio, pues para bastantes, cifras comprendidas entre 30 y 50 serán
claramente patológicas. Según el grado, puede hablarse de una retención incipiente la
que llega hasta 80, moderada la comprendida entre 80 y 100, grave entre 100 y 150, y
gravísima por encima de 150.

METABOLISMO DE NUCLEÓTIDOS.
Los ácidos nucleicos que ingresan con los alimentos son degradados en el
intestino, sobres ellos actúan nucleasas (ribo y desoxiribonucleasa) pancreáticas e
intestinales, que los separan en sus nucleótidos constituyentes. Estos sufren entonces la
acción de fosfatasas intestinales que liberan el resto fosfato de los nucleótidos
convirtiéndolos en nucleósidos, los cuales pueden ser absorbidos como tales, o ser
degradados por nucleosidasas intestinales, que separan las bases nitrogenadas púricas o
pirimídicas de la pentosa ribosa o desoxirribosa.

86
 La mayoría de las bases liberadas en la luz intestinal son degradadas aquí por
acción de bacterias de la flora normal; el resto es absorbido y pasa a la circulación portal.
Aun cuando los humanos consuman una dieta rica en nucleoproteínas, las bases
púricas y pirimídicas de estas no se incorporan de manera directa a los ácidos nucleicos
de las células tisulares, sino que se biosintetizan de novo a partir de intermediarios
anfibólicos. Sin embargo, los análogos de purinas y pirimidinas inyectados (incluyendo
medicamentos potenciales contra el cáncer) pueden incorporarse al DNA, lo cual se utiliza
como terapia curativa.
El ser humano no depende de las bases nitrogenadas de la dieta para atender a las
necesidades de la síntesis de ácidos nucleicos y nucleótidos libres. Las bases son
producidas en casi todas las células con tal eficacia, que el organismo puede prescendir
totalmente del aporte exógeno.

METABOLISMO DE LAS BASES NITROGENADAS.

El metabolismo de los nucleótidos está centrado en el anfibolismo de las bases
nitrogenadas que los forman.
Como sucede con los aminoácidos, en el organismo puede hacerse una
separación virtual entre exógeno y endógeno formándose dos pools metabólicamente
independientes. Las bases procedentes de los alimentos son degradadas y sus productos
finales excretados, mientras que la síntesis de nuevos nucleótido y polinucleótidos se
realiza con purinas y pirimidinas formadas en las células.
Los ácidos nucleicos del organismo, al igual que las proteínas, están en continuo
recambio. Una parte de las bases liberada durante los procesos de degradación puede
ser reutilizada para la síntesis de nucleótidos y ácidos nucleicos, a través de la vía
llamada de “reciclaje”. El resto termina siendo catabolizado y los productos finales son
excretados.

QUÍMICA DE LOS NUCLEÓTIDOS.

Los ácidos nucleicos contienen cinco bases heterocíclicas principales, las purinas
adenina (A) y guanina (G); y las pirimidinas citosina (C), timina (T) y uracilo (U). Las
estructuras de estas bases se muestran en la figura. Todos los ácidos nucleicos contienen
A, G y C pero sólo el DNA contiene además T, mientras que el RNA contiene en su lugar
U.
El agregado de un azúcar cíclico, específicamente una D-ribosa o una 2-desoxi-D-
ribosa, por enlace covalente en posición N-9 de una purina, o en N-1 de una pirimidina,
forma un nucleósido. Ahora bien, se en el grupo oxidrilo del carbono 5´ de la pentosa se
produce una fosforilación, se obtendrá un mononucleótido, o simplemente llamado
nucleótido; dependiendo de cual es el azúcar implicado tendremos: ribonucleótido,
cuando se trata de D-ribosa, o bien desoxirribonucleótido para el caso de 2-desoxi-D-
87
 ribosa. En el cuadro 7 se hace una lista de las
principales purinas y pirimidinas, así como de sus
derivados nucleósidos y nucleótidos. Por último, la
unión entre el carbono 5 y el carbono 3 de las
pentosas de dos nucleótidos consecutivos,
utilizando un grupo fosfato como puente de
ensamble, llamado a esto enlace fosfodiéster,
formará, con la sucesión de más nucleótido, una
cadena a la que se denomina polinucleótido.
Esta estructura básica de la cadena es válida para
todos los tipos de ácidos nucleicos: ácidos
desoxirribonucleicos (DNA) y ribonucleicos (RNA).

CATABOLISMO DE PURINAS.
La degradación de DNA y RNA por nucleasas produce nucleótidos (ribo y
desoxiribonucleótidos) y estos a su vez son sometidos a hidrólisis de nucleotidasas con
acción fosfatasa dando nucleósidos libres, en el caso de las purinas, adenosina y
guanosina; esta última es degradada a guanina y ribosa-1-fosfato por la nucleósido
purínico fosforilasa.
El nucleósido adenosina, por acción de la adenosina desaminasa, se convierte en
inosina, luego una nucleósido fosforilasa divide a la inosina en hipoxantina y pentosa-1-
fosfato. La hipoxantina se oxida a xantina por la xantina oxidasa, flavoproteína que
contiene Fe y Mo (molibdeno). Por otro lado la guanina, por acción de la guanasa, se
convierte también en xantina. Tanto adenina como guanina convergen en xantina. Este
metabolito es sustrato de la xantina oxidasa, nuevamente en escena, que lo convierte en
ácido úrico, producto terminal de la degradación de purinas, el cual es excretado
principalmente por orina. La figura 15 muestra la vía de degradación de las purinas.

Ácido úrico.

En el adulto normal se
producen unos 500mg por día de ácido
úrico, 80% del cual se excreta por
orina, el resto se degrada a CO2 y
NH3 o urea.

88
 En el plasma normal, el ácido úrico alcanza una concentración de 4 a 6mg por
100ml. Los varones tienen niveles de 1mg por 100ml más que las mujeres, diferencia que
desaparece después de los 45-50 años de edad, lo cual se relaciona a diferencias
hormonales entre ambos sexos.

Consideración de la solubilidad del ácido úrico.

El ácido úrico posee un pKa de alrededor de 5,75, lo que indica que a pH
plasmático normal (7,4) este ácido libera su protón del grupo OH del C8 y se convierte en
la forma iónica urato. A pH 5,75 la forma iónica se equilibra con la no ionizada, mientras
que a pH menor predomina la forma no disociada. Esto tiene importancia, ya que el ácido
úrico es menos soluble en agua que el urato, por lo que una orina acidificada aumenta la
cantidad de ácido úrico y este tiende a precipitar; en cambio, si la orina se alcaliniza se
produce un aumento de urato, con mayor posibilidad de excreción en el medio acuso de la
orina.
Consideraciones de los alimentos hiperurimiantes.
Una dieta rica en ácidos nucleicos aumenta la cantidad de purinas y en
consecuencia la producción de ácido úrico. Los alimentos que contribuyen a esto son
aquellos con alta cantidad de nucleoproteínas, tales como carnes, vísceras, tejidos
glandulares, extractos de carne (picadillos), legumbres, hongos y espinaca. Ciertos
compuestos químicos del café (cafeína), cacao (teobromina), té (teofilina), mate (mateína)
y algunas bebidas carbonatadas contienen gran cantidad de xantinas metiladas, purinas
que favorecen la formación de ácido úrico.

APLICACIÓN CLÍNICA: GOTA.

Definición. Con el término de gota se designa a la enfermedad caracterizada por niveles
elevados de ácido úrico en plasma (hiperuricemía).

Cuadro Clínico. Muchos de los síntomas, sino todos, relacionados con la hiperuricemia,
aparecen como resultado de la escasa solubilidad del ácido úrico, esto junto a su
abundancia, lleva a la formación y precipitación de cristales de urato sódico que se
depositan principalmente en las articulaciones de las extremidades, produciendo artritis
(inflamación de las articulaciones) muy dolorosas. Se afectan preferentemente las
articulaciones interfalángicas y del metatarso, siendo típico el compromiso del dedo
grueso del pie (Figura 16). También se producen precipitados de urato sódico en
cartílagos, siendo el cartílago de la oreja el más frecuentemente comprometido,
formándose nódulos indurados que se conocen con el nombre de “tofos”.

MATERIAL Y REACTIVOS.

1.- 1 Kit para determinación de urea que contiene:

89
  R1 (Reactivo 1): o-ftalaldheído 4.8 mmol/L
 R 2 (Reactivo 2): Solución borato 87 mmol/L
 Urea Cal: Patrón primario acuoso de Urea 50 mg/dL
2.- 1 Kit para la determinación de ácido úrico que contiene:

 Estándar de Ácido Úrico enzimático (8 mg/dL).

 Reactivo de enzimas para determinación de ácido úrico sérico.

3.- 1 Equipo de extracción de sangre al vacio (aguja, camisa y tubo con anticoagulante)
4.-1 Frasco con torundas con alcohol
5.- 1 Ligadura
6.- 1 Micropipeta de 50 y 1 de 200 microlitros
7.- 1 Pipetas graduadas de 2 y 5 ml.
8.- 1 Pipetas Pasteur
9.- 1 Bulbo de látex
10.- 1 Balanza de 2 platillos
11.- 1 Pizeta
12.- 1 Escobillón.
13.- 4 Tubos de ensayo de 13 x 100 y de 18 x 150 mm.
14.- 1 Baño maría.
15.- Agua destilada.
16.- Sanitas.
17.- 1 Espectrofotómetro.
18.- 2 Cubetas para espectrofotómetro.
19.- 1 Centrifuga
20.- 1 Vórtex

METODOLOGÍA

Fundamento de la determinación de la urea (Método colorimétrico de δ-

ftalaldehido).

La urea presente en la muestra reacciona con el o-ftalaldheído en medio ácido

originando un complejo coloreado que puede cuantificarse espectrofotométricamente:

H+

Urea + o-ftalaldheído -------------------- Isoindolina

La intensidad de color formado es proporcional a la concentración de urea en la muestra

ensayada.

90
Fundamento para la determinación de ácido úrico.

La uricaza actúa sobre el ácido úrico para formar peróxido de hidrógeno y alantoína. El
H2O2 es leído cuantitativamente por su reacción con el ácido 3,5 – dicloro – 2 –
hidroxibenzosulfónico (DCHB) en presencia de peroxidasa y 4 aminofenazona, para
formar un complejo quinoneimina de color rojo violeta.

DESARROLLO EXPERIMENTAL:

1. Extraer 3.0 ml de sangre por punción venosa con el equipo de extracción al vacio en un
tubo con anticoagulante al sujeto de prueba con 8 horas de ayuno previo.
2. Homogenizar la muestra.
3. Centrifugar a 2500 rpm durante 5 minutos.
4. Con ayuda de una pipeta Pasteur separar el plasma que se encontrara en la superficie
del tubo y transferirlo a un tubo de 13 x 100 limpio y seco.
5. Marcar 3 tubos de ensayo de 18 x 150 para urea y 3 tubos de ensayo para ácido úrico
y marcarlos como Blanco (B), Patrón (P) y Muestra (M).
6. Agregar a cada uno de los tubos lo siguiente:

Determinación de urea.

REACTIVO BLANCO PATRÓN MUESTRA

Reactivo 1 2.0 ml 2.0 ml 2.0m l

Patrón ---- 50 µl ----

Muestra ---- ---- 50 µl

Mezclar Mezclar Mezclar

Reactivo 2 2.0 ml 2.0 ml 2.0 ml

Mezclar bien todos los tubos e incubar a 37°C durante 15 minutos.

91
7. Leer la extinción del patrón y la muestra en el espectrofotómetro a 510 nm, frente al
blanco de reactivo (la coloración es estable por 30 minutos).
8. Anotar los resultados.

Determinación de ácido úrico.

REACTIVO BLANCO PATRÓN MUESTRA

Reactivo de trabajo 2.0 ml 2.0 ml 2.0 ml
Patrón ----- 0.05 ml -----
Muestra ----- ----- 0.05 ml

7. Mezclar bien los tubos e incubar los tubos a temperatura ambiente durante 15 minutos.
8. Leer la extinción del patrón y la muestra en el espectrofotómetro a 510 nm, frente al
blanco de reactivo (la coloración es estable por 30 minutos).
9. Anotar los resultados.

CALCULOS:

Extinción de la muestra

Urea (mg/dL) = x 50

Extinción del patrón

Valores de referencia (Normales): 15 - 45 mg/dL (2.49 – 7.49 mmol/L)

Ácido úrico en suero o plasma (mg/dl) = Am x 8

Ae
Donde:

Am: Valor de absorbancia de la muestra

Ae: Valor del estándar
8: Es la concentración del estándar

Valores de referencia: Hombres 3.4 – 7.0 mg/dl

Mujeres 2.4 – 5.7 mg/dl

92
RESULTADOS.

 Realice una tabla con los datos obtenidos como sigue:

Equipo Condiciones Edad y Absorbancia [Ác. Absorbancia [Urea]

del sujeto sexo del Ác. úrico. Úrico] Urea. (mg/mL).
de prueba. sujeto de (mg/mL).
prueba.

 Discuta los resultados obtenidos de todos los equipos.

CONCLUSIONES.

 Concluir en base al análisis de datos realizado y a los objetivos propuestos.

CUESTIONARIO.

1.- ¿Por qué es tan importante el manejo de los desechos nitrogenados en el organismo?

93
2.- Escriba la ruta biosintética del ácido úrico.

3.- Indique la fisiopatología de la gota.

4.- Explique una consecuencia de una eliminación deficiente de urea del organismo.

94