INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS N i \ LABORATORIO DE GENETICA MICROBIANA 6Qv) LO } | Ov \ Secci6n 2 Ni Reporte de Practica 3 “Transferencia de marcadores de resistencia a antibidticos por conjugacién entre bacterias de diferente género” Elaborado por Equipo 7: ¢ Martinez Torres Ricardo e Mendoza Gallegos Natalia Verénica Profesores: e Verénica Pérez Enriquez e Francisco Espafiol Espafiol * Octavio G6mez Guzman e Sergio Mora Ramirez Fecha de entrega: 27/04/23WU INTRODUCCION ‘Aunque las bacterias se reproducen por un proceso asexual (fisién binaria), poseen mecanismos para lograr la vajiabilidad genética que necesitan para adaptarse a un entorno cambria 0 que-seeomete Eajo mucho etié. En general exison dos formas de‘sSeera informacién genética de una bacteria, las mutaciones y la transferencia de fragmentos de , [ADN de unas bacterias a otras con posterior recomibinacion de los fragmentos adquiridos en)“ el cromosoma o en los plasmidos de las bacterias receptora (W. Dale & F. Park, 2010). En la practica trabajada se realizé por la transferencia de plasmidos y en su caso de genes cromosémicos arrastrados por plésmidos desde las bacterias donadoras a las receptoras, dominado esto conjugacién (Conjugacién Bacteriana, 2020), La conjugacién bacteriana es la transferencia de material genético entre bacterias por contacto directo célula a célulafibne que haber contacto fisico entre la bacteria donadora de 0 ADN y la receptora, esto se da mediante puentes de unién y conexién entre las agai) N de un pili sexual fa cual es codificada por Tra y TraQ. RL, 1999). El material transferido puede ser un plésmido, un transposén, ut’ ‘una-porcion del cromosoma—~ movilizada por un plasmido, esta informacién genética puede brindar(al celular receptor, mejoras en su funcionalidad, adaptacién, ademas de transmit la clave para ser eliminada 2 ‘Se sabe que ciertas poblaciones de células con plasmidos conmutativos pueden llevar los A (y () Nv genes de resistencia (W. Dale & F. Park, 2010) La caracteristica transmitida por plasmidos que mas se ha estudiado es la resistencia a los farmacos. Muchas bacterias pueden volverse resistentes a los antibidticos por plasmid, aunque la resistencia a algunos férmacos como el acido nalidixico y la rifampicina suéle producirse por mutacién del gen que codifica la proteina diana y no por la adquisicién de un plasmido. Las bacterias pueden voiverse resistentes a varios antibidticos distintos, bien por la adquisicién de varios plasmidos independientes, bien por la adquisicién de un rics plasmido con muchos determinantes de resistencia (W. Dale & F. Park, 2010). La conjugacién entre bacterias Gram negativas suele ocurrir a través de pili sexuales codificados por el plésmido. Entre éstos el mejor estudiado es el plasmido F de Escherichia coli. Las bacterias que lo poseen (F*) sintetizan 2 0 3 pili con los que contactan con bacterias, receptoras y se acercan a ellas. Entonces el plasmido F se rompe por un lugar fijo (el origen ¢ gre la donadora. En ambos citoplasmas se van sintetizando las cadenas complementarias, de forma que al final del proceso ambas bacterias poseen un plasmido F completo. Por tanto, la conjugacién convierte a la bacteria receptora (F') a su vez en donadora (F*), lo que acelera el proceso de extension del plasmido, y puede ocurrir entre bacterias de la misma o de diferentes especies relacionadas. Por eso cuando los genes que proporcionan resistencia a los antibiéticos estan en plasmidos conjugativos se extienden muy répidamente a través de diversas especies patégenas (W. Dale & F. Park, 2010). aOBJETIVO GENERAL. + Desarrollar la técnica de transferencia de resistencia a antibidticos por conjugacién de material plasmidico en bacterias Gram (-) de diferente género. * Observar a través de medios selectivos y diferenciales el crecimiento de transconjugantes. wo OBJETIVOS PARTICULARES. * Comprender el proceso y las etapas de la conjugacién. * Identificar las diferencias fenotipicas de las transconjugantes en los medios de cultivo selectivo y diferencial * Entender la importancia de la conjugacién en los procesos evolutivos y en la adquisicién de resistencia a antibiéticos y sus consecuencias para el humano. '* Dimensionar y comprender las implicaciones de este proceso en el Ambito médico, biolégico, farmacolégico y de! medio ambiente. * Calcular las frecuencias de reversion y recombinacién para los marcadores seleccionados. ZA RESULTADOS |. \-< Soh" |.) Acontinuacién, se exponen las.colonias obtenidas en la cuenta viable de oétulas donadoras 4°\% —_yreceptoras al sembrar 20 jiL en medio MacConkey por la técnica de Miles-Misra,Tabla 1 Némero de colonias obtenidas en cada dilucién para cuenta viable de oslulas donadoras y receptoras (revisar la parte inferior de esta tabla y las consecutivas para el significado de las notaciones empleadas). Equipo cee Placa pond glaetrdtaek Lemetsteoree de eee (Klebsiella 1153-2) para cada dilucién | Cee 107] 10%] 10* | 407 | 107 | 10° | 10°], 107 | Pareto [1 [iclicsfac fic| ic | | sa) 22 | Pee pepe |e [16 a0 a7 | 6 Bae\|eeAtcoma| 1. (aicelamaalacmasra| (cn |, ios 16.2 lee 2 )ic |e] ic | sé | ic } cpa] 2 | 9 t 468 1 Ic Ic 22 4 Ic 1 61 Ic Ic leet iC ic | 16 [ef 10 389 ie [a | 1c | 26 | | te | ic | ic ye] 22 a 388 7 [gle IGE (isreq|nis.) 1G |n00) | 26 s)o7, | 2 [1 | ic | 74 | 14 | ic | o7 | 44 [6 | 72] 60 a oo | ze pe] es] ie] as] 4] so L ! (IC}= Incontable, (SD)= Sin desarrollo Para el cdlculo del titulo de donadoras y receptoras se sigue el siguiente procedimiento, tomando como ejemplo los datos del equipo 7: A ee Suma de colonias de todas las placas “mero de colonias para titulo = v5 establecido de acuerdo a placas con desarrollo Para el ntimero establecido de acuerdo a placas con desarrollo se considera 1.22; ya que en la primera dilucién donde se pudieron contar las colonias sélo fue posible el conteo una caja (1), Seguido de dos diluciones en las que fue posible contar dos cajas para cada una de estas (22). De esta forma, el calculo seria el siguiente ener titulo = 0453447422416 178 _ 44 gy jimero de colonias para titulo = cr Top = 145: Namero de colonias para titulo = 145.90 Se sabe que sélo existen colonias enteras (no expresadas con cifras decimales) pero se reportan en este formato para obtener los |. Posteriormente, se emplea la siguiente formula para obtener las UFC/mL: 7 1 a eee ee, (sean dela wmldad) Greate ermLa dilucién de la unidad es aquella primera dilucién donde se pudo llevar el conteo de colonias, siendo este caso 10°. En lo que respecta a la alicuota, tal como ya se mencioné se ‘sembraron 20 iL lo que expresado en millitros es 0.02 mL. Ogg 059 8) = 10-5) \0.02 mL, Entonces, aplicando el mismo procedimiento para todas las cuentas viables los titulos quedan de la siguiente manera: Tabla 1 Titulo de células donadoras y receptoras. Equipo | Cepa Cepa donadora Cepa receptora donadora (K,pneumoniae) (Escherichia coli J53-2) (Klebsiella pneumoniae) | Colonias | Titulo | Colonias | Titulo consideradas | (UFC/mL) | consideradas | (UFC/mL) 7 370 1D ID) 14590 | 7.29x10" 8 ATCC 127.22 6.36X10° | 24.09 1.20X10° 700603 | 9 468 1954 | S77XI® | 48 2A5X10° 10 389 24 | 12x10 | 7029 | 3.81xi0" i 389 7181 | S59XI0" | 124.17 | 6.05x10® 2 601 7, Baxi | 70.65 | 353X107 (ID)= Indeterminable Para el titulo de revertantes es un ejercicio bastante similar; donde en este caso el numero de colonias es directo ya que sélo se sembré una placa. Lo tinico restante es considerar la alicuota sembrada (100 yL) - ty 4 UFC/mL = Nimero de colonias Ge) Ga) Para el caso de las revertantes para Rif en el equipo 7: (cs) (orn) ‘Tomando como ejemplo los datos del equipo 9 para obtener la frecuencia de reversion del marcador Rif® los calculos se realizan de la siguiente forma: UFC) = ml Titulo de revertantes Titulo de donadoras e . ‘on = 80. UFC/mL recuencia de reversiOn = sare95 UFC TRL Frecuencia de reversion =Tabla 2 Titulos de revertantes y frecuencias de reversion para ambos marcadores de sensibilidad Cepa de oes Reyertantes para | Frecuencia | Frecuencia Kp Equipo Cef® (E.coli J53-2) de | dereversion (Klebsiella | reversion | para Cef® uae) » para Rif (E.coli) Colonies | Titulo) | Colonies | tule (Kp) (UFCImL) | - (UFCimL) A - 370 2 20 Ic ID ID ID b 8 | ATCC 1D i Ic 107) 1D’ 'D 700603 | O | O) 9 468 [=A Se ID "| 4.09xi0* 1D 10 | 389 4 40 Ic ID 3.33X10* ID "1 389 SD 0 ic 0 D 1D Oo} oO aS 12 | 60% 8D sh Dalat 1D b+) 0 (IC}= incontabie, (SD)= Sin desarrollo, (ID)= Indeterminable. Finalmente, para la obtener el titulo de transconjugantes es similar a revertantes donde sélo se ajusta de acuerdo a la alicuota (nuevamente, 100 jL). Véase el ejemplo del equipo 8: 1 1 2g = a ts) =) = De forma similar, para obtener la frecuencia de recombinacion se hace la division del titulo de transconjugantes entre el titulo de las donadoras, pero considerando una dilucién 1:10 en este tiltimo por la proporcién de células donadoras-receptoras en la mezcla de conjugacién’ Titulo de transconjugantes _ 1.12X10* Frecuencia de recombinactén = FG donadoras (10) = 636X107 Nota: Para la frecuencia de recombinantes en el titulo de transconjugantes es menor que el titulo de donadoras. Tabla 3 Titulos de transconjugantes para las diferentes cruzas y frecuencia de recombinacién para cada una de ellas. [ Cruza realizada ‘Transcojugantes Frecuencia de | Equipo | (E.coli J83-2x | Colonias | Titulo recombinacién Klebsiella (UFCimL) pneumoaniae) 7 | EcolxXKp370 | 1288 | 1.26X10° iD [8 | EcoiXKpaAtcc | 1124 | 1.12x10" 176X107 | egos [9 | Ecoixkp 46s | 1334 | 1.33x10" 136X107 [40 | EcofxKp389 | SD 1D iDlex | Eccolix Kp 389 oe exe | e 3.87X10° | | E.coli X K.p 601 4402 4.40X10* | 4X104 | Bi J DISCUSION pay ise |e ae Ena cuenta viable y titulos de células donadoras y receptoras hay pocas cosas que comentar mas alla de que deben existir ciertas consideraciones al usar la técnica de Miles-Misra; ya que tal como se observé, es una técnica que, si bien puede parecer esencialmente sencilla, puede a su vez limitar los resultados obtenidos mas adelante. Como ejemplo se toma los tesultados obtenidos por el equipo 7, donde todas las placas sembradas para la cepa de K. pneumoniae 370 presentaron un corrimiento de la alicuota colocada a lo largo de toda la placa, siendo imposible obtener colonias aisiadas. La imposibilidad de obtener un titulo eventualmente impide obtener la frecuencia de reversion para el marcador correspondiente, asi como la frecuencia de recombinacién. Ciertamente se puede afirmar que la técnica de Miles-Misra tuvo un impacto en la mayoria de los conteos realizados por lo que se deberia evaluar si es el método mas adecuado para cuantificar células donadoras y receptoras ya que retomando lo mencionado, si se observé una tendencia de dificultad en los equipos para obtener colonias aisladas. En el caso de las revertantes para el marcador de sensibilidad a la ceftazidima en E.coli J53- 2 es destacable mencionar que en toda la seccién no se pudo obtener propiamente un titulo debido a que fue constante en la mayoria de los equipos un desarrollo bacteriano en forma de césped en a placa (colonias incontables). Relacionando la frecuencia de las mutaciones espontaneas con la cantidad de revertantes necesarias para un crecimiento masivo en | placa, se descarta que efectivamente todo el crecimiento observado se trate de revertantés para este marcador. Esto sugiere la posibilidad de que no se trate de una mala técnica de ‘siembra 0 de un crecimiento masivo de revertantes, sino mas bien del estado de los medios de cultivo en los que se sembré ya que no estaria una inhibicién del desarrollo para esta cepa. La concentracién del antibiético empleada al momento de preparar el medio de cultivo pudo ser menor a la concentracién minima inhibitoria. De la misma forma, la actividad de la ceftazidima pudo jugar un papel importante recordando que ciertos farmacos pueden perder su efectividad a medida que pasa el tiempo. Es entonces que no se puede establecer un panorama claro de las posibles revertantes de E.coli que terminaron desarrollandose en el medio MacConkey con los dos antibisticos y que pusaan ser interpretadas erréneamente como transconjugantes. york Para las cepas de K, pneumoniae es clar6 que la frecuencia do nula en muct sensibilidad a la rifampicina es baja/ 468 y 389 el orden de las frecuencias de reversion casos y ersién para el marcador de De hecho, en las cepas ‘tan bajo que no es tan diferente al inverso del orden de los titulos de cepas donadoras. La presencia de revertantes para este marcador al cuantificar las transconjugantes no se descarta, pero tampoco se cree que representen una parte importante de las colonias contadas. Una forma para discemnir entre revertantes para el marcador la sensibilidad a la rifampicina y transconjugantes seria mediante el uso de algiin otro marcador que posean iinicamente la que las células de E.coli no cuenten con él o viceversa. wee are de Klebsiella y‘ ) 5|¢ Por titimo, se observé que el proceso de conjugacién en general se puede considerar como exitoso para practicamente Ia totalidad de cruzas y de equipos. La obtencién de transconjugantes fue en una proporcién aceptable ya que los titulos de transconjugantes tan s6lo son diez mil veces menores aos titulos de donadores y las frecuencias de recombinacién oscilan alrededor de 1/1000 (10%). Esto quiere decir que una parte importante de Bt donadoras pudo participar en el proceso de transferencia-horizontal de los genes que codifican para las betas lactamasas de espectro extendido (BLEE); énzimas que son capaces de degradar el anillo beta lactamico en las cefalosporinas. Asimismo, se confirma que pese a que exista una ligera distancia filogenética de género y especie (ya que ambas bacterias comparten la misma clasificacion taxonémica hasta los puntos ya dichos), esto no impide que se lleve el proceso de conjugacién de forma efectiva entre dos bacterias Gram negativas. En la cruza E.coli J53-2 X Kp 370 (Equipo 7) realmente la Gnica limitante para obtener una frecuencia de recombinacién fue la carencia de un titulo de donadoras mientras que para la cruza E.coli J53-2 X K.p 389 parecen no existir transconjugantes. El caso de este equipo entonces se puede comparar con el del equipo 11 ya que realizé exactamente la misma cruza, por lo que se hubiera esperado un titulo similar. Aunque poco probable, una de las causas de la falta de transconjugantes -ms allé de posibles errores al realizar la mezcla de conjugacion © al momento de la siembra- podria tratarse de una proporcién importante de los plasmidos en las células donadoras que al momento de la cruza se encontraban en su forma de episoma por los fenémenos esponténeos de conversién F* a Hir y viceversa, por lo que no se lograron transferir las marcas plasmidicas que otorgaban la resistencia a la ceftazidima Evidentemente para hacer la afirmacién de si se trata de una cepa Hfr se requeririan mas pruebas como un perfil de elucién de todo el material genético de la célula por lo que lo mencionado tnicamente se propone como una simple hipétesis. CONCLUSIONES + La técnica de Miles-Misra no es viable ya que la gota puede presentar corrimisnte evitando el conteo de colonias correcto e impidiendo la obtencién de titulos. + Los resultados de revertantes para el marcador de sensibilidad a la ceftazidima en E.coli J53-2 indican que lo ideal seria repetir el experimento asegurando una buena “hs calidad en los medios de cultivo, asi como en los antibiéticos empleados en su Z preparacién para obtener una perspectiva clara de la proporcién de revertantes que puedan pasar erréneamente por transconjugantes al momento de cuantificar estas tiltimas, + Para discemir correctamente entre revertantes de Klebsiella pneumoniae para el mareador de la sensibilidad a la rifampicina y las transconjugants se sugiere corroborar e! crecimiento con un marcador exclusivo para K.pneumoniae ylo para E.coli. ‘El proceso de conjugacién en Gram negativas se da en medio liquido ya que necesitan el contacto fisico como de células donadoras como de receptoras, «El proceso de conjugacién para la transferencia de genes de resistencia a antibidticos beta lactamicos fue exitoso y en buena proporcién entre Escherichia coli J53-2 y Klebsiella pneumoniae ; bacterias Gram negativas que a nivel filogenético unicamente differen en género y especie, wets Ws >. 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