Bioprospección de bacterias solubilizadoras de fosfato a partir de muestras de suelo de

bosque en Mixco, Guatemala.

Stephanie Godoy1, Rodrigo Mejicanos2, Oscar de la Parra3

Manipulación de Células para Aplicación Industrial, Departamento de Bioquímica, Facultad de Ciencias y

Humanidades, Universidad del Valle de Guatemala.

1
god18314@uvg.edu.gt, 2mej18088@uvg.edu.gt, 3dela17284@uvg.edu.gt

Resumen
El aislamiento y la identificación de microorganismos juegan un papel importante en la caracterización de suelos
como en los análisis fisicoquímicos realizados a biofertilizantes, biorremediadores o agentes de control. Es por
esto que el objetivo de este trabajo fue aislar, identificar y caracterizar microorganismos de muestras de suelo
con potencial de fijación de fosfato. Se prepararon muestras de suelo en buffer de fosfatos y posteriormente se
inocularon en distintos medios de cultivo, para evaluar los potenciales de fijación de fosfato y posteriormente
caracterizar la morfología de la colonias en Bacilos Gram positivos y negativos mediante tinciones de Gram. Al
analizar los resultados se puede evidenciar que se cumple con el objetivo principal ya que al momento de la
identificación y caracterización de las colonias aisladas estas presentan una forma circular filamentosa color
crema con elevación plana característica a bacterias Gram positivas y únicamente una colonia tiene forma
irregular de color transparente con elevación plana brillante de margen filamentoso las cuales son características
principales de una morfología de cocos y esta misma colonia es la única que pudo fijar fosfatos, esto se evidencia
por los halos de inhibición creados en el medio NBRIP .

Palabras clave:
Introducción
De acuerdo con la Organización de las Naciones
Unidas para la Alimentación y la Agricultura [FAO]
(2022) la región de Mesoamérica tiene hasta un 26%
de la tierra afectada por la degradación del suelo.
Esto se da como consecuencia del desgaste por el
agua, el uso excesivo de agroquímicos y la pérdida
de bosques, lo cual impacta directamente en la
capacidad de producción y en la salud de los
ecosistemas. Además, los sistemas químicos, físicos
y biológicos se ven alterados, lo que conlleva a la
infertilidad de los suelos.
Ante esta situación, se ha optado por utilizar
prácticas sostenibles. La agricultura sostenible se
caracteriza por utilizar estrategias amigables con el
ambiente para mantener y mejorar la fertilidad de
este recurso. Los microorganismos del suelo se han
utilizado en este sentido, puesto que llevan a cabo
ciclos biogeoquímicos y distintas funciones que
pueden beneficiar a las plantas (Mitter, Obregón,
Dunfield y Germida, 2021). La búsqueda de recursos
biológicos, como los microorganismos, para una
aplicación social y económica, se conoce como
bioprospección (Beatti et al., 2010).
En el ambiente los microorganismos se encuentran
en poblaciones mixtas, conformados por variedad de
colonias las cuales interactúan entre sí. Una de las
técnicas para la evaluación y estudio de colonias
individuales es mediante el aislamiento de colonias,
esto permite la obtención de cultivos puros a partir
de la inoculación consecutiva en medios de cultivo.
Los microorganismos requieren de condiciones
fisicoquímicas específicas, tales como la
temperatura, pH, concentración de oxígeno, sales,
minerales y nutrientes elementales (C, N, P, S) los
cuales son suministrados en los medios de cultivo.
Los medios de cultivo son empleados para
caracterizar, aislar y determinar actividades
metabólicas por parte de los microorganismos y
pueden ser sólidos, liquidos y semisolidos. Existen
diferentes tipos de medios, los cuales se pueden
clasificar según su función: medios selectivos,
nutritivos, diferenciales, de enriquecimiento, etc.
(Bonilla et al., 2016).
El agar nutritivo es utilizado para el aislamiento y
recuento de microorganismos con escasos
requerimientos nutricionales. Por otro lado, el agar
MacConkey, un medio selectivo, es utilizado para el
aislamiento de bacterias Gram negativo y
diferenciar, entre estas, cuáles pueden fermentar
lactosa (MacFaddin, 1985). Por último, el medio
NBRIP, diferencial, es empleado para identificar
bacterias y hongos solubilizadores de fosfatos y se
caracteriza por la formación de halos de hidrolisis
color amarillo de la colonia que indica la capacidad
solubilizadora (Nautiyal, 1999).
Hoy en día ha aumentado la necesidad de aislar
bacterias solubilizadoras de fosfatos. Esto en
respuesta a la baja disponibilidad de este elemento
para las plantas, lo que limita su desarrollo y
crecimiento. Asimismo, se busca reducir el uso de
fertilizantes de fósforo, ya que estos conllevan a la
contaminación del agua, la eutrofización y su
aplicación no necesariamente aporta mayores
niveles de fósforo utilizables para las plantas (Alori,
Glick y Babalola, 2017).
Por otro lado, una de las características más
importantes de las bacterias es su morfología, la cual
es definida por el tamaño, la forma, la estructura y el
arreglo. Existen bacterias en forma redondeada que
son conocidos como cocos y en forma cilíndrica,
denominados bacilos. Un frotis es la extensión de
una muestra o cultivo puro sobre un portaobjetos a
manera de separar lo más posible los
microorganismos, esto permite una mejor
visualización de la morfología y agrupamiento
celular. La muestra es extendida y posteriormente
fijada al portaobjeto por acción de calor para evitar
que sea arrastrada por las soluciones de colorantes y
lavados sucesivos durante el proceso de tinción
Gram (Bonilla et al., 2016).
Las bacterias se pueden clasificar en dos grandes
grupos, Gram positivo y Gram negativo. Dicha
clasificación se basa en su capacidad de retención
del cristal violeta tras el proceso de fijación, adición
de este compuesto, complejo yodo/lugol,
decoloración con alcohol/acetona y contra
coloración con safranina del frotis.
Por tanto, se buscó aislar, identificar y caracterizar
bacterias del suelo capaces de solubilizar fosfatos,
mediante el uso de medios selectivos y diferenciales,
descripción de morfología y tinción Gram.
Materiales y Métodos
Preparación de muestras de suelo
Se pesó 1 g de suelo proveniente de un parque en la
zona 7 de Mixco, Guatemala y se colocó en un tubo
Falcon con 99 mL de buffer de fosfatos. Se incubó
por 10 minutos con agitación a 150 rpm. Seguido, se
prepararon diluciones seriadas.
Se agregaron 900 µL de buffer de fosfatos y 100 µL
de la muestra de suelo preparada a un tubo
Eppendorf de 1.5 mL. Esta fue la dilución 10 -1. Se
prepararon soluciones hasta 10-8, teniendo como
base 900 µL de buffer de fosfatos y resuspendieron
100 µL de la dilución anterior.
Inoculación en medios de cultivo
Se inocularon 200 µL de las tres últimas diluciones
(10-6 ,10-7, 10-8) en placas de agar nutritivo y agar
MacConkey, para un total de 6 placas inoculadas. Se
esparció el inóculo en las placas con agar con un
esparcidor estéril, comenzando con la disolución
más diluida. Las placas se incubaron durante dos
semanas a 32℃.
Descripción de colonias y tinción Gram
Luego de las dos semanas, se describieron los
diferentes tipos coloniales, siendo estos 7; 6
correspondientes al agar nutritivo y 1 al agar
MacConkey. Se anotó la forma, elevación, apariencia
de la superficie, el margen y el color. Luego, se
realizó un frotis de cada colonia, colocando una gota
de agua destilada en un portaobjetos, inoculando la
colonia con un asa bacteriológica y fijando con calor.
Para la tinción Gram se inició colocando cristal
violeta en los frotis durante 1 minuto, seguido por
un lavado con agua destilada. Luego, se colocó lugol,
se dejó 1 minuto y se lavó con agua destilada. Se
agregaron 5-6 gotas de acetona y se lavó con agua
destilada. Por último, se agregó safranina y se dejó
durante 40 segundos y se lavó con agua destilada. Se
secaron las láminas.
Resiembra en medio NBRIP y agar nutritivo
Cada una de las 7 colonias se sembraron en placas
con agar nutritivo y en placas con agar NBRIP,
utilizando una aguja bacteriológica. Se dejaron
incubar durante dos semanas a 32℃. Transcurrido
este tiempo se revisó la capacidad de las colonias
para solubilizar fosfatos en el medio NBRIP.
Resultados
Se caracterizaron las bacterias de suelo a partir de
observaciones macroscópicas, microscópicas (1000x)
y tinción Gram.
Cuadro 1. Características macro y microscópicas de
las colonias bacterianas.
Número Descripción Morfología Tinción
de Gram
colonia
1 Cr, Ca, Pa, Bacilos + La búsqueda de bacterias solubilizadoras de fosfato
Oa, Oo vegetativos,
bacilos con
endosporas
2 Fa, Ca, Pa, Bacilos con + plantas, la salud del suelo y permite desarrollar
Oa, Fo endosporas
3 Re, Ca, Pa, Bacilos con + uso de agroquímicos. Por esta razón se buscó aislar,
Oa, Fo endosporas
4 Re, Ca, Pa, Bacilos con +
Oa, Eo endosporas
5 Cr, Ba, Ea, Bacilo +
Be, Do
6 Cr, Te, Ea, Bacilos +
Oa, Eo
7 Ir, Te, Pa, Cocos +,-
Be, Oo
Forma: Circular = Cr, Filamentosa = Fa, Rizoide = Re, Irregular =
Ir
Color: Crema = Ca, Blanca = Ba, Transparente = Te.
Elevación: Plana = Pa, Elevada = Ea
Apariencia de la superficie: Opaca = Oa, Brillante = Be.
Margen: Ondulado = Oo, Filamentoso = Fo, Dentado = Do,
Entero = Eo.
La descripción de las colonias se hizo en base a la
figura # de anexos. Las abreviaturas de las
características corresponden al orden en que están
descritas en la leyenda del cuadro 1. En general,
todas las características fueron distintas; sin
embargo, predominó el color crema para las Gram
positivo y una característica distintiva de la Gram
negativa es que fue pegajosa; observado al
momento de hacer el frotis. La mayoría de colonias
fueron bacilos Gram negativo y una sola colonia
presentó cocos Gram positivo y negativo.
En la figura 1 - 7 se muestran las colonias aisladas
con su respectiva tinción Gram. Todas las muestras
fueron observadas con el objetivo de inmersión
(1000x).
Discusión
es una de las estrategias emergentes en la
agricultura, ya que hace disponible el fósforo para
las plantas. Esto mejora el crecimiento de las
productos en base a estas bacterias, reduciendo el
identificar y caracterizar bacterias del suelo capaces
de solubilizar fosfatos, mediante el uso de medios
selectivos y diferenciales, descripción de morfología
y tinción Gram.
Al analizar los resultados se puede observar que las
colonias de la 1 a la 4 tienen una morfología de
bacilos con endosporas mientras que las colonias 5,6
y 7 no presentan endosporas, al realizar las tinciones
de Gram se puede evidenciar que las primeras seis
colonias son Gram positivas mientras que la séptima
colonia es una combinación de dos bacterias, tal
como lo evidencia el cuadro 1 del apartado de
resultados.
Así mismo al analizar la morfología de las colonias
obtenidas se determinó que las colonias 1, 5 y 6
tienen una forma circular mientras que las colonias
3 y 4 son de forma filamentosa y la colonia 2 es
rizoide , a su vez se puede evidenciar que las
colonias 1,2,3,4 son de color crema mientras que la
5 y 6 son de color blanca y transparente
respectivamente y la mayoria de colonias presentan
una elevación plana opaca con margen filamentoso
caracterizticas esenciales de las bacterias Gram
positivas. Al observar la colonia 7 se evidencia que
ésta es irregular color transparente con elevación
plana brillante de margen filamentoso las cuales son
características principales de una morfología de
cocos tal como se evidencia en el cuadro 1 del
apartado de resultados.
Por otro lado, se logró evidenciar que la colonia
número 7 poseía la capacidad de solubilizar
fosfatos, esto debido a la formación de halo de
solubilización color amarillo formado alrededor de la
colonia inoculada en el media NBRIP. Estos halos
son producto de la transformación de los fosfatos
insolubles a formas solubles por la acción de
distintos mecanismos bacterianos. Alguno de estos
mecanismos son: la acción de ácidos orgánicos
producidos por las bacterias, la quelación de los
elementos responsables de la insolubilidad de los
fosfatos presentes en el medio y la disolución de
fosfatos mediada por enzimas, provocada por la
liberación extracelular de fosfatasas (Franco et al.,
2015).
Conclusiones
1. A partir de muestras de suelo fue posible
aislar siete cepas bacterianas de las cuales
seis se caracterizaron morfológicamente por
ser bacilos gram positivos.
2. A partir del aislamiento de distintas colonias
de muestra de suelo fue posible identificar
una colonia fijadora de fosfatos haciendo
uso del medio NBRIP.
Referencias
Alori, E., Glick, B., & Babalola, O. (2017). Microbial
Phosphorus Solubilization and Its Potential for Use in
Sustainable Agriculture. Frontiers In Microbiology, 8.
doi: 10.3389/fmicb.2017.00971
Beatti, A., Hay, M., Magnusson, B., de nys, R.,
Smeathers, J., & Vincent, J. (2010). Ecology and
bioprospecting. Austral Ecology, 36(3), 341-356. doi:
10.1111/j.1442-9993.2010.02170.x
Bonilla, M., Pajares, S., Vigueras J., Sigala, J & Le, S.
(2016). Manual de prácticas de microbiología básica.
Universidad autónoma metropolitana. ISBN: 978-
607-28-0975-8.
MacFaddin, A. (1985). Media for isolation -
cultivation, identification and maintenance of
medical bacteria. vol 1.
Mitter, E., Tosi, M., Obregón, D., Dunfield, K., &
Germida, J. (2021). Rethinking Crop Nutrition in
Times of Modern Microbiology: Innovative
Biofertilizer Technologies. Frontiers In Sustainable
Food Systems, 5. doi: 10.3389/fsufs.2021.606815
FAO. (2022). Soil and water conservation in Latin
America and the Caribbean. Extraído de
https://www.fao.org/americas/priorities/suelo-
agua/en/
Franco, G., Marulanda, S., de la Fe, Y., Diaz, A.,
Baldani, V & Hernández, A. (2015). Bacterias
solubilizadoras de fosfato y su potencialidad de uso
en la promoción del crecimiento de cultivos de
importancia económica. Centro nacional de
investigaciones científicas, Cuba. ISSN: 0253-5688

Anexos
Imagen 1. Bacilos muestra 1

Imagen 5. Muestra 5

Imagen 2. Bacilos muestra 2

Imagen 6. Bacilos muestra 6

Imagen 3. Bacilos muestra 3

Imagen 7. Cocos muestra 7

Imagen 4. Bacilos muestra 4
 Imagen 8. Resiembra en agar nutritivo

Imagen 9. Resiembra medio NBRIP

Se evidenció la capacidad de las colonias de la

muestra número 7 para solubilizar fosfatos en el
medio NBRIP. Esto debido a la formación de halo de
solubilización color amarrilo alrededor de la colonia
y el aspecto cristalizado del medio.