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OBTENCIÓN DE UNA MATRIZ DE COLÁGENO DE ORIGEN PORCINO

Conference Paper · December 2018

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4 authors:

Reyniel Gómez González Carlos Figueroa Hernández

Universidad Tecnológica de la Habana, José Antonio Echeverría Universidad Tecnológica de la Habana, José Antonio Echeverría
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José María Ameneiros Juan Prohias

Universidad Tecnológica de la Habana, José Antonio Echeverría Hermanos Ameijeiras Hospital
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 OBTENCIÓN DE UNA MATRIZ DE COLÁGENO DE ORIGEN PORCINO

Reyniel Gómez González1, Carlos Figueroa Hernández2, José María Ameneiros Martínez3

1
Profesor de la Universidad Tecnológica de La Habana. Cuba, 2Profesor de la Universidad tecnológica de La
Habana. Cuba, 3Profesor de la Universidad tecnológica de La Habana. Cuba
1
reyniel@dcrhmail.cujae.edu.cu, 2carlosrfh@tesla.cujae.edu.cu, 3amen@quimica.cujae.edu.cu

RESUMEN

Se obtiene un andamio a partir de colágeno natural para su aplicación futura en la ingeniería de tejidos,
específicamente para la restauración de las células cardíacas (cardiomiocitos). La investigación engloba un
estudio sobre los procedimientos de extracción de colágenos. En la base de estos procedimientos se desarrolló
una tecnología para la obtención de colágenos a partir de tendones de origen porcino, la que tiene en cuenta la
separación de grasas y otros tejidos; disolución de la muestra en ácido acético 0,5 M; centrifugado de la
solución de colágeno, recuperación por precipitación, dializado y liofilizado a -80 ºC. Se realizaron las pruebas
de caracterización mecánica y físico-química del colágeno las que permitieron establecer patrones
comparativos que muestran que el material obtenido es colágeno tipo I.

PALABRAS CLAVES: colágeno, matriz de colágeno, patrones de caracterización de la matriz colágeno.

ABSTRACT

A scaffold is obtained from natural collagen for future application in tissue engineering, specifically for the
restoration of cardiac cells (cardiomyocytes). The research includes a study on the extraction procedures of
collagens. At the base of these procedures, a technology was developed to obtain collagens from tendons of
porcine origin, which takes into account the separation of fats and other tissues; dissolution of the sample in
0.5 M acetic acid; centrifugation of the collagen solution, recovery by precipitation, dialyzed and freeze-dried
at -80 ° C. The mechanical and physical-chemical characterization tests of the collagen were carried out, which
allowed us to establish comparative patterns that show that the material obtained is type I collagen.

KEY WORDS: Collagen, collagen matrix, characterization patterns of the collagen

INTRODUCCIÓN

En la actualidad se han logrado grandes avances en la ingeniería de tejidos partiendo del campo de los
biomateriales. Esta rama de la ciencia consiste en la obtención de andamios o matrices y la combinación de las
mismas con células y moléculas con el fin de la regeneración de tejidos [1].

El colágeno constituye una de las principales proteínas que en su composición puede servir como regeneradora
de cartílagos, tendones, ligamentos y para fortalecer las articulaciones del cuerpo. La matriz de colágeno,
además de servir como soporte para las células; también actúa como una estación repetidora para varias
moléculas de señalización permitiendo el crecimiento y proliferación celular ayudando al proceso de
regeneración celular [2].

La necesidad de buscar nuevos métodos para dar soluciones en la reconstrucción de tejidos ha puesto a los
científicos del mundo a buscar nuevas técnicas para solucionar las problemáticas de la ingeniería de tejidos.
Esta investigación pretende obtener un andamio con el objetivo de usarlo en la regeneración del tejido del
miocardio que es dañado por el infarto. Se prevé que con la utilización de esta técnica se recomponga el tejido
hasta en un 80%. Primeramente, se analizan los distintos procedimientos existentes, se estudia la necesidad de
obtener una matriz de colágeno Tipo I y su caracterización para ser utilizado como biomaterial y se traza como

1
objetivo principal el desarrollo de un procedimiento para obtener una matriz de colágeno Tipo I a partir de los
tendones de origen porcino, así como realizar su caracterización morfológica y físico-química.

MATERIALES Y MÉTODOS

Obtención del colágeno a partir de tendones de origen porcino

Para la obtención del colágeno a partir de los tendones de origen porcino se propone una secuencia por etapas.
Estas tuvieron en cuenta las investigaciones [3], [4], [5] y [6]

1. Selección del tendón del cerdo

Selección de los tendones del cerdo. Los tendones del cerdo se extrajeron de las extremidades del mismo. Con
posterioridad, se corta en pedazos pequeños de 3 y 4 mm3 respectivamente. Esto permite una mayor disolución
de los mismos en el ácido acético, de esta forma, el disolvente tiene la capacidad de fluir más fácil por los
intersticios extracelulares que conforman el tejido y reducir el tiempo de disolución, lo cual garantiza el
resultado gelatinoso esperado, permite menor consumo de electricidad, menos depreciación del equipo
refrigerante y del agitador mecánico, también se reduce el tiempo de trabajo. Figura 1.

Figura 1: Tendones de cerdo

2. Ajuste de tamaño de los tendones con volumen 3- 4 mm3

3. Lavado con agua

Permite que exista poca grasa en los tendones y alguna que otra impureza del medio por los que ha transitado
durante su extracción. Además, como el fin de este producto es biológico, se necesita de una adecuada higiene
y materiales esterilizados para la manipulación de la materia prima.

4. Separación de grasas y otros tejidos

En la extracción de los tejidos no se puede garantizar el 100% de la fibra del tendón, ya que siempre quedan
algunas cantidades de grasas y otros tejidos.

5. Eliminación de la grasa con alcohol

Por esta razón, se realizó una segunda extracción de las grasas y tejidos utilizando bisturíes estériles
incluyendo una disolución en alcohol al 90%.

6. Disolución del colágeno

Se utiliza el ácido acético 0,5 M (pH=2.5) a razón del 20% de masa y el resto de disolvente con agitación
constante durante 48h a 4 ºC. Figura 2.

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 Figura 2: Disolución en ácido acético

7. Filtrado

Esta solución se filtra mediante la utilización del método de decantación y la utilización de gasas con orificios
de 4-5 mm de diámetro. El tejido retenido en la gasa nuevamente se debe solubilizar en ácido acético para
obtener más masa gelatinosa. Figura 3.

Figura 3: Colágeno disuelto filtrado

8. Centrifugado

La centrifugación se realizó a 10 000 RPM en una centrífuga Modelo DW-K 501C. Esto tuvo como objetivo
extraer el disolvente de la masa gelatinosa obtenida del proceso de decantación y filtrado. La fuerza centrífuga
actúa sobre la masa gelatinosa, generando una diferencia de concentración con el disolvente lo que hace la
separación entre ambos. El proceso de centrifugado se realizó durante 3 horas. Figura 4.

3
 Figura 4: Proceso de centrifugado

9. Precipitado de las proteínas

Para la obtención del precipitado se añaden 2 gramos de cristales de cloruro de sodio. Se agita mecánicamente
durante 5 min.

10. Centrifugado

Se centrifuga y se elimina el líquido por decantación y filtrado.

11. Dializado para eliminar el cloruro de sodio (NaCl)

La diálisis se realizó con 2 litros de agua destilada para eliminar el cloruro de sodio. Se introduce la solución
gelatinosa dentro de un papel de filtro y se realiza el proceso de diálisis durante 1 hora; por diferencia de
concentración los iones de la sal pasan al agua destilada. Figura 5.

Figura 5: Colágeno dializado

12. Liofilizado

La etapa de liofilizado es una de las más importante en toda la metodología por lo que hay que prestarle mayor
atención. Esta etapa es la que va a garantizar la estructura porosa del andamio. En la Figura 6 se pueden
apreciar los parámetros tecnológicos del liofilizado.

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 Figura 6: Proceso de liofilizado

Etapa 13. Caracterización de la matriz de colágeno

Caracterización morfológica. Para iniciar la caracterización morfológica de la matriz de colágeno se hace la

observación al microscopio óptico con 200X de magnificación.

El índice de hinchamiento (Swelling) es la capacidad de absorción de agua del colágeno. Para la determinación
de cada una de las masas se utilizó una balanza analítica modelo Sartorius.

Propiedades mecánicas. El análisis de las propiedades mecánicas se realizó mediante la determinación del
módulo elástico de la matriz de colágeno. Se tuvo en cuenta que la matriz va a estar sometida a diferentes
esfuerzos de tracción compresión. Para la determinación del módulo elástico se confecciona el gráfico de
esfuerzos contra deformación.

ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS

La metodología seleccionada responde a los requerimientos mínimos para obtener un andamio de colágeno
Tipo I garantizado por la fuente de origen, la cual está constituida por tendón porcino [7].

En el primer paso de centrifugado el nivel de impurezas obtenido no es significativo, de forma tal que no pudo
eliminarse las mismas por debajo del sobrenadante. La etapa de precipitación del colágeno utilizando NaCl
resultó un proceso efectivo y relativamente rápido, en cuestión de 30 minutos se logró prácticamente la
precipitación total del colágeno.

El dializado se realizó tomando como membrana de intercambio un papel de filtro como recipiente y dentro del
mismo el gel de colágeno y ácido acético, el recipiente es introducido dentro de agua destilada. Este
procedimiento puede sustituir al uso de membranas semipermeables.

A partir del proceso de liofilizado propuesto se obtiene una matriz porosa de colágeno Tipo I como se muestra
en la figura siguiente.

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 Figura 7: Andamio de colágeno

El índice de swelling se comportó de la manera siguiente: La masa inicial del scaffold fue de 0.0297 g y la
masa final después de la incubación fue de 0.6721 g por lo que el valor del swelling es de 21.6296.

El análisis morfológico muestra la presencia de la fibrillas típicas de los procesos de aislamiento y liofilizado
de los colágenos. A continuación se muestran las microfotografías representativas del proceso de fibrilación.
Figura 8.

Figura 8: Fibrillas de colágeno

El estudio del comportamiento mecánico de la matriz de colágeno liofilizada muestra un comportamiento

lineal en la zona de la deformación elástica hasta alcanzar una resistencia de 0,25 GPa. El gráfico que se
aparece a continuación representa la curva típica de tensión deformación para un colágeno liofilizado. Figura 9.

Figura 9: Curva tensión deformación del colágeno.

6
 CONCLUSIONES

El procedimiento utilizado para aislar el colágeno tipo I, así como la obtención de la matriz por el proceso de
liofilizado garantizó una estructura y propiedades mecánicas con posibilidades de ser aplicada en la ingeniería
de tejidos del miocardio.

REFERENCIAS

1. AUTORES, Colectivo de autores. “Ingeniería de Tejidos y Medicina Regenerativa. NIH... Transformación

de descubrimientos en Salud”. Disponible en
https://www.nibib.nih.gov/sites/default/files/Ingenier%C3%ADa%20de%20Tejidos%20y%20Medicina%20Re
generativa_0.pdf
2. L ORENTI, D.A. “Ingeniería de tejidos”. 2014, Disponible en:
https://es.slideshare.net/Fanie_Minor/ingeniera-en-tejidos-y-rganos-ppt.

3. Gaona, J.C.S., Estandarización de un proceso de extracción de colágeno a partir de los residuos de

fileteo de tilapia ( Oreochromis sp) y cachama (Piaractus brachypomus).2011.

4. Mendoza, C.R.P., Collagen Extraction in AcidBase Mediums from Bovine Hooves.Revista épsilon,
2013.

5. Pardo, H., Obtención de piel artificial de bajo costo. Uruguay Ciencia Nº13, Octubre 2011.

6. Gómez-Lizárraga K., P.-B.C., Rodríguez-Fuentes N., Obtención y caracterización de colágena tipo I a

partir de tendón bovino. Sociedad Mexicana de Ciencia y Tecnología de Superficies y Materiales, enero
2011(24): p. 137-140.

7. FIGUEROA HERNÁNDEZ Carlos. “Obtención de andamios de colágeno para la restauración del tejido del
miocardio”. Revista Cubana de Ingeniería. 2016, vol. 7, núm. 3, septiembre - diciembre, pp. 15 – 25.

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