25 JUNIO

Sesión de laboratorio. Reacción en

cadena de la polimerasa
Procedimiento:

1. Se ponen a descongelar todos los reactivos en hielo,

incluida la muestra.
2. Se prepara la mezcla de reacción de la siguiente manera:
 Para 1 reacción:
 Regulador Minus —– 10X 2.5 µL
 MgCl2 50 mM —– 0.75 µL
 Oligo sentido —– 1 µL
 Oligo antisentido —– 1 µL
 dNTP’s —– 0.5 µL
 Taq Polimerasa —– 0.1 µL
 Agua de ampolleta estéril —– 18.5 µL
 ADN templado —– 1 µL
 Volumen total de reacción —– 25 µL

Esto es para una sola reacción, dependiendo del número de

reacciones a realizar. Lo que se hace es preparar una mezcla madre
de reacción en la cual se adicionan todos los reactivos excepto los
oligos y la muestra de ADN. Una vez preparada la mezcla madre, esta
se coloca en los diferentes tubos de reacción y posteriormente a cada
tubo se le adicionan los oligos y la muestra de ADN. Si en todas las
reacciones se van a utilizar los mismos oligos, estos se pueden
adicionar a la mezcla madre. El objetivo de preparar una mezcla
madre de reacción es el de disminuir el riesgo de contaminación y el
error por pipeteo. No te debes de olvidar de incluir siempre un
control negativo y un control positivo de amplificación. Esto es para
verificar que la amplificación obtenida sea exclusivamente debida a
la muestra y no a que exista algún tipo de contaminación.

3. Una vez preparados los tubos estos se colocan en el

termociclador.
4. Se programan las condiciones de reacción con base en las
características de la muestra y de las temperaturas de
 alineamiento de los oligos. Se programan en el equipo las
diferentes etapas de la reacción junto con sus
temperaturas y tiempos. Se muestra un ejemplo de las
condiciones de amplificación para una reacción en
general:
 Desnaturalización inicial: 94 °C por 4 min
 30 ciclos:
 Desnaturalización 94 °C por 1 min,
 Alineamiento: La temperatura y tiempo
dependerá de los oligos que se utilicen.
 Extensión 72 °C por 1 min
 Extensión final: 72 °C por 7 min.
Cabe mencionar que estas condiciones pueden cambiar,
dependiendo de las características de los oligos y de la muestra de
ADN.

5. Una vez terminado el proceso de amplificación, las

diferentes muestras son analizadas por electroforesis en
un gel de agarosa para verificar si hubo amplificación o
no y si el tamaño del fragmento amplificado es el
esperado.

Conclusión
En conclusión, en esta clase pudiste practicar la realización de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), técnica de utilidad en la
amplificación de fragmentos de ADN. Actualmente es una técnica
que posee gran cantidad de aplicaciones por lo que es necesario
conocerla. Durante la clase te has dado cuenta de la importancia de
las condiciones necesarias para esta técnica de acuerdo con los
reactivos utilizados en la misma además de que también se requiere
realizar una manipulación correcta de las micropipetas puesto que
se utilizan volúmenes muy pequeños para estas reacciones.
Hemos concluido la clase y como puedes notar has avanzado mucho
durante el trayecto del curso ¡Muchas felicidades! Para que puedas
alcanzar el aprendizaje esperado en esta clase te invito a repasar los
temas y conceptos revisados, además realiza el reporte
correspondiente y responde las preguntas incluidas en él, no te
olvides de enviarlo antes de la fecha límite. Te encuentro en tu
última clase.