"Año de la universalización de la salud"

FACULTAD DE CIENCIAS FORESTAL Y AMBIENTALES

ESCUELA DE INGENIERIA FORESTAL

PRACTICA DE LABORATORIO N°06

CURSO: Bioquímica

DOCENTE: Dra. Julissa K. Bautista Valencia

ALUMNA: Cachique Paredes Karlita Makeyli

CICLO: III

2020
PUCALLPA-PERÚ
 PRÁCTICA N°07

DOSAJE DE GLUCOSA: MÉTODO ENZIMÁTICO (GOD-PAD)

I. COMPETENCIA
1.1. Determina la concentración de glucosa en estado basal y postprandial en una muestra
biológica mediante el método colorimétrico.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

Reactivo de diagnóstico para la determinación cuantitativa in vitro de Glucosa en suero o
plasma en sistemas fotométricos.

La medición de la concentración de glucosa en suero o plasma se utiliza principalmente en el

diagnóstico y vigilancia del tratamiento de diabetes mellitus. Otras aplicaciones son la
detección de la hipoglicemia neonatal, la exclusión del carcinoma celular de los islotes
pancreáticos, así como la evaluación del metabolismo de los hidratos de carbono en varias
enfermedades.

MÉTODO

Test fotométrico enzimático “GOD–PAP”.

PRINCIPIO

Determinación de la glucosa después de la oxidación enzimática por la glucosa oxidasa. El

indicador colorimétrico es la quinoneimina, la cual se genera de la 4–aminoantipirina y el
fenol por el peróxido de hidrógeno bajo la acción catalítica de la peroxidasa (reacción de
Trinder)

GOD

Glucosa + 02 Ácido Glucónico + H2 O2

POD

H202 + 4- Aminoanipirina + fenol Quinoneimina + 4 H2O

REACTIVOS

Componentes y Concentraciones en el Test

Reactivo:

Tampón fosfato pH 7,5 250 mmol/L

Fenol 5 mmol/L

4–Aminoantipirina 0,5 mmol/L

Glucosa oxidasa (GOD) > 10 kU/L

Peroxidasa (POD) > 1 kU/L

Ázida de Sódio 0,95 g/L

Estándar: 100 mg/dL (5,55 mmol/L) de Glucosa

 INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD DEL REACTIVO

El reactivo es estable hasta el final del mes indicado de expiración, si es almacenado a 2 – 8

°C, es protegido de la luz y se evita la contaminación.

¡No congelar los reactivos!

Nota: Se debe mencionar, que el ensayo no es influenciado por los cambios de color del
reactivo que ocurren ocasionalmente mientras la absorbancia del reactivo sea < 0.3 a 546 nm.
El estándar es estable hasta el final del mes de expiración indicado, si se almacena a 2 – 25
°C.

ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES

1. Los reactivos contienen Azida de sodio (0,95 g/L) como preservante. ¡No ingerir! Evitar el
contacto con la piel y las membranas mucosas.
2. Tomar las precauciones necesarias para el uso de reactivos de laboratorio.

MANIPULACIÓN DE DESECHOS

Por favor remítase a los requerimientos legales locales.

PREPARACIÓN DEL REACTIVO

El reactivo y el estándar están listos para usar.

MATERIALES REQUERIDOS PERO NO SUMINISTRADOS

1. Solución de NaCl 9 g/L.

2. Equipo General de laboratorio.

 III. PREPARACIÓN
1. Suero o plasma venoso
2. La muestra debe recolectarse en ayuno excepto por el agua, durante ocho horas cuando
menos antes de la prueba.
3. La muestra debe recolectarse en tubo colector de tapón rojo para suero el cual no
contiene anticoagulante, o de color lila el cual contiene EDTA anticoagulante para
obtener plasma
4. La muestra debe centrifugarse a 3 500 rpm durante 5 minutos para separar el suero y
plasma
5. La glucosa en suero o plasma es estable al menos 3 días a 2-8 °C
Nota:

 Los anticoagulantes de uso corriente como la EDTA, oxalato, heparina o fluoruro no

afectan los resultados
 La hemolisis hasta 0,3 g/dL de hemoglobina no interfiere
 La muestra es inaceptable si:
 a) Si el suero se obtiene turbio
 Si la identificación es inadecuada.
 Si el tubo de recolección no es el adecuado
 Cuando se haya extendido el tiempo máximo de análisis permisible
 No se ha observado interferencias por hemoglobina (4/L); bilirrubina (20mg/L);
creatinina (100mg/L), galactosa (1g/L).

TIPO DE MUESTRA

Suero, plasma heparinizado

Separar del contenido celular a más tardar 1 hora después de la toma de la muestra.

Estabilidad después de la adición de un inhibidor glicolítico (NaF, KF):

1 día a 20 – 25 °C

7 días a 4 – 8 °C
¡Desechar las muestras contaminadas!

II. REACTIVOS
REACTIVO 1 (tampón) TRIS Ph 7.4 92 mmol/L
Fenol 0.3 mmol/L
REACTIVO 2 (Vial de Glucosa oxidasa 1 5000 U/l
enzima) Peroxidasa 1 000U/L
4- aminofenazona 2.6 mmol/L
Estándar Sol. glucosa 100mg/L
Control Normal Spin react.

Preparación:

Cada reactivo deberá ser etiquetado: colocar las iniciales de la persona que lo preparó.
Contenido, concentración número de loe, fecha de preparación, fecha y caducidad y
requerimiento de almacenamiento.

 No usar reactivos fuera de la fecha indicada

 No pipetee los reactivos con la boca y evite el contacto con piel y ojos.

III. PROCEDIMENTO DEL ENSAYO

Hay disponibles a petición aplicaciones para sistemas automáticos.

Longitud de onda 500 nm, Hg 546 nm

Paso Óptico 1 cm

Temperatura 20–25 °C / 37 °C

Medición Contra Blanco de Reactivo

 Nota: El estándar contenido en este kit es de base acuosa y esto no está indicado para uso en
la automatización. Por lo tanto recomendamos el uso de un calibrador de matriz biológica
como TOPKAL U en equipos automatizados.

Blanco Muestra /Estándar

Muestra / Estándar - 10 μL

Agua destilada 10 μL -

Reactivo 1000 μL 1000 μL

Mezclar, incubar 10 min. a 20 – 25 ºC o 5 min. a 37 ºC.

Leer la absorbancia contra el Blanco de reactivo dentro de 60 min.

IV. EQUIPOS
Espectrofotómetro o analizador para lecturas de 490 – 550 nm

Centrifuga

V. MATERIALES
 05 tubos de ensayo de 13 x 100 mm
 1 micropipeta de 1.0 ml
 1 micropipeta de 10 ml
 Puntas para micropipeta
 Gradilla

VI. PROCEDIMIENTO
Condiciones e ensayo

Longitud de onda: 505 nm (490-550)

Temperatura: 30 a 37°C

Cubeta: 1cm pasó de luz

 Ajuste a cero con blanco de reactivo.

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

1. Pipetear en tubos de ensayo:

Blanco Estándar Muestra Muestra

control
Estándar --- 10ul --- ---
Muestra --- --- 10ul ---
Muestra --- --- --- 10ul
control
Reactivo 1.0ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml

2. Mezclar e incubar 10 min. a 37°C o 30 min. a temperatura ambiente

3. Leer la absorbancia (A) a 550nm
4. Coloración estable 30 minutos a temperatura ambiente

VII. RESULTADOS
CÁLCULO

Con estándar o calibrador.

A Muestra
Glucosa [mg/dL] = x Conc. Estd/Cal (mg/dL)
A Estd/Cal

mg/dL x 0. 0555 =mmol

Concentración el estándar: 100mg/Dl

FACTOR DE CONVERSIÓN
Glucosa [mg/dL] x 0,05551 – Glucosa [mmol/L]

Linealidad del Método

El método es lineal hasta valores de 500 mg/dL

Si la concentración de glucosa es superior, diluir la muestra a 1:2 con solución salina 0.9% y
multiplicar el resultado por 2.

Valor referencial

mg/dL

Suero o plasma 70 -110

Neonato nacido a término 30 -60

Cuestionario
1. ¿Qué es la gluconeogénesis?
La gluconeogénesis es un proceso metabólico que se presenta en casi todos los seres
vivos, incluyendo plantas, animales y diversos tipos de microorganismos. Consiste en
la síntesis o formación de glucosa a partir de compuestos que contienen carbono que no
son carbohidratos, como los aminoácidos, glucogénicos, el glicerol y el lactato.
Se trata de una de las vías del metabolismo de los carbohidratos que del tipo anabólico.
Sintetiza o forma moléculas de glucosa presentes principalmente en el hígado y, en
menor proporción en la corteza de los riñones de los seres humanos y animales.

Ilustración 1: Via metabólica de la

glucogénesis. Nombres en azul indican los
sustratos de la via, flechas en rojo las reacciones
únicas de esta vía, flechas cortadas indican
reacciones de la glucolisis, que van en contra de
esta via, flechas en negrita indican la dirección
de la via.
Este proceso anabólico se produce
siguiendo el sentido inverso de la vía
catabólica de la glucosa, teniendo enzimas
específicas diferentes en los puntos
irreversibles de la glucólisis. La
gluconeogénesis es importante para
aumentar los niveles de glucosa en la
sangre y en tejidos en casos de
hipoglicemia. Asimismo, amortigua el
descenso de la concentración de los carbohidratos en los ayunos prolongados o en otras
situaciones aversas.
Fuente: https://www.lifeder.com/gluconeogenesis/#:~:text=%20Precursores%20gluconeog
%C3%A9nicos%20%201%20Lactato.%20El%20lactato,gluconeogenico%20de
%20importancia%20originado%20del%20metabolismo...%20More%20
2. Explica las causas de la enfermedad de Diabetes mellitus

La diabetes mellitus es una enfermedad crónica del sistema endocrino, es decir,

relacionada con la actividad de las hormonas. Concretamente se debe a un déficit en la
 producción de insulina en el páncreas que impide la correcta metabolización de la
glucosa, haciendo que se acumule en la sangre.

CAUSAS: Según la Organización Mundial de la Salud y la Asociación Americana de

Diabetes (ADA) podemos categorizar la diabetes mellitus en distintos tipos en función
de cuáles sean sus causas. También existen otras categorías menos utilizadas, como es
el caso de la diabetes neonatal o de la diabetes del adulto de inicio juvenil (MODY). Si
bien por lo general los casos de diabetes se diagnostican como uno de los tipos que
mencionaremos, también es frecuente que en una persona se combine más de una de
estas formas de diabetes.

1. Insulinodependiente (Tipo 1 o DMID)

La diabetes mellitus de tipo 1 también es conocida como insulinodependiente (DMID),
juvenil e infantojuvenil. Como sus nombres indican, la diabetes tipo 1 normalmente se
inicia antes de la edad adulta y requiere insulina externa. Se caracteriza por subidas y
bajadas bruscas de los niveles de glucosa. Este tipo de diabetes tiene su causa en la
ausencia de células productoras de insulina en los islotes de Langerhans del páncreas;
dicha alteración requiere una predisposición genética pero también problemas externos,
como malos hábitos alimenticios. La diabetes tipo 1 explica alrededor de un 10% de los
casos totales de esta enfermedad. El tratamiento de la DMID se centra en el autocontrol
de los niveles de glucosa en sangre y en el manejo efectivo de las bajadas de azúcar.
Para favorecerlos es importante aprender a detectar las señales corporales y externas
que preceden a los cambios en glucosa. Esto incluye la discriminación de síntomas
físicos de las bajadas de azúcar (hipoglucemias), como palpitaciones, sudoración o
sensación de debilidad.

2. No insulinodependiente (Tipo 2 o DMNID)

La diabetes mellitus no insulinodependiente (DMNID) se desarrolla más habitualmente a
partir de los 40 años. Se debe a la resistencia a la insulina por parte de las células y en
algunos casos también a la producción insuficiente de esta hormona, normalmente debidos a
obesidad, falta de ejercicio o consumo excesivo de carbohidratos y de grasas saturadas y
trans. Este tipo de diabetes también se caracteriza porque cuando aparece no requiere la
administración de insulina exógena como sucede en la DMID, si bien a largo plazo no es
infrecuente que se acabe necesitando. El tratamiento de la diabetes tipo 2 es muy distinto al
de la 1 ya que sus síntomas se reducen mediante cambios en el estilo de vida. En estos casos
se recomienda a las personas afectadas que hagan ejercicio físico, que se alimenten
adecuadamente y que pierdan peso.

3. Gestacional
La diabetes mellitus gestacional se produce cuando los niveles de glucosa en sangre de una
mujer embarazada aumentan crónicamente. Esto sucede en un 3-9% de los embarazos y en un
10% de casos se mantiene después del parto. Este tipo de diabetes es muy similar al tipo 2
(DMNID) en cuanto a síntomas y también se debe a resistencia a la insulina. Es más probable
que se produzca en personas con sobrepeso e historia familiar diabetes tipo 2. La diabetes
gestacional aumenta el riesgo de que el bebé necesita una cesárea y desarrolle alteraciones,
como el síndrome de dificultad respiratoria neonatal. Se puede prevenir manteniendo una
dieta y un peso saludables y haciendo ejercicio (con una intensidad adecuada al estado de la
madre) antes del parto.

4. Otros tipos de causas

Las clasificaciones recogen también otras causas de diabetes mellitus distintas a las de los
tipos 1, 2 y gestacional. Muchos de estos tipos se deben a una alteración genética o son
secundarios a otra enfermedad.

De entre estos, alguno de los más frecuentes son los siguientes:

 MODY (diabetes del adulto de inicio juvenil): variante hereditaria que se

diagnostica antes de los 25 años y se asemeja a la diabetes tipo 2.
 LADA (diabetes autoinmune latente del adulto): similar a la diabetes tipo 1, pero
detectada en la edad adulta; frecuentemente se diagnostica erróneamente como
diabetes tipo 2.
 Debida a trastornos del páncreas.
 Debida a endocrinopatías como hipertiroidismo, acromegalia o síndrome de Cushing.
 Inducida por fármacos y sustancias como esteroides, betabloqueantes o antipsicóticos
atípicos.
 Neonatal: hiperglucemia que se produce durante las dos primeras semanas de vida y
puede ser permanente o transitoria, aumentando el riesgo de diabetes en la adultez.
 Prediabetes: se da cuando una persona tiene niveles elevados de glucosa sin llegar al
diagnóstico de diabetes; aumenta el riesgo de diabetes tipo 2.

Fuente: https://viviendolasalud.com/enfermedades/diabetes-mellitus#:~:text=La%20diabetes
%20mellitus%20es%20una%20enfermedad%20cr%C3%B3nica%20del,glucosa%2C
%20haciendo%20que%20se%20acumule%20en%20la%20sangre.
VIDEOS REFUERZO:

 Video de uso de la micropipeta

https://www.youtube.com/watch?v=IvXOT5mXtSs

DESCRIPCION DEL USO DE LA MICROPIPETA

 Video de dosaje de glucosa

https://www.youtube.com/watch?v=j62to24hx1A

EXPLICACION DE DOSAJE DE LA GLUCOSA

 dosaje de glucosa
https://www.youtube.com/watch?v=0NqqS67uIMw

DETERMINACION DE LA GLUCOSA EN SANGRE

  Estudio de tolerancia oral de glucosa

https://www.mayoclinic.org/es-es/tests-procedures/glucose-tolerance-test/about/pac-
20394296

La prueba de tolerancia a la glucosa, también conocida como «examen de tolerancia oral a la

glucosa», mide la respuesta del cuerpo al azúcar (glucosa). Esta prueba se puede usar como
prueba de detección para la diabetes de tipo 2. Sin embargo, con mayor frecuencia, se usa una
versión modificada de la prueba de tolerancia a la glucosa para diagnosticar la diabetes
gestacional (un tipo de diabetes que aparece durante el embarazo).
 Por qué se realiza
La prueba de tolerancia a la glucosa identifica anormalidades en la manera en que el
cuerpo administra la glucosa después de una comida (por lo general, antes del ayuno,
el nivel de glucosa se torna anormal).

 Riesgos
Los riesgos relacionados con la obtención de una muestra de sangre son menores.
Luego de la extracción de sangre, puedes tener hematomas o sangrado en la zona.
También puedes sentir mareos o aturdimiento. En algunos casos, es posible que
ocurra una infección después del procedimiento.