* Cánulas y electrodos

Se realizó material, se soldaron electrodos, y cánulas de 1.5mm.

* Cx estereotáxica

Se elaboró una cirugía estereotáxica a siete ratas macho de la cepa Wistar (>250g),

se calculó la dosis de la anestesia:

{0.2 ml1.8Pentobarbital
2ml de Solución total
ml NaCl
=2.0 ml
( peso ) (3 )
1000
(5) ÷3.15=¿

Nota: se restó 0.2 ml, para anestesiar al animal

Se colocó el instrumento quirúrgico (cánulas, electrodos, peras, aguja e hilo) en el

riñón con solución Benzal, posteriormente se colocó las cánulas en la torre del

estereotáxico con 5mm de separación, a la rata se mareo para aplicarle la dosis de anestesia

intraperitoneal, se esperó que el anestésico hiciera efecto (10min), posteriormente se le

pellizco la cola de la rata para observar si tenía aun respuesta, posteriormente se rapó a la

rata (en la parte superior de la cabeza), se le colocó lidocaína en oídos (0.1ml en cada oído),
se montó a la rata colocándole los lápices en cada oído para que quedará alineada. Se aplicó

Isodine en el área rapada (aplicándolo con gasa), se inyecto 0.6ml de lidocaína con

epinefrina en la parte media del cráneo (subcutáneo). Posteriormente se realizó una incisión

sagital de 1cm iniciando al nivel de los ojos hasta llegar al borde de las orejas,

posteriormente se procedió a retirar el periostio. Luego se colocó las cuatro peras en el área

expuesta y se aplicó torundas de algodón para evitar un sangrado. Posteriormente se limpió

la zona descubierta con agua oxigenada, enseguida se secó el agua oxigenada con un hisopo

de algodón, posteriormente se cauterizo los capilares expuestos que estuvieran sangrando.

Una vez que el área estuviera seca y limpia se movió la torre del estereotáxico colocando

las cánulas a la altura del Área de Bregma de manera equidistante a la línea media,

posteriormente se bajó 2mm y se marcó (cánulas), se volvió a bajar 2mm y se marcó

(electrodos) y por último se marcó la tierra que es arriba de ojo derecho.

Posteriormente se taladro las áreas marcadas, colocando los electrodos, cánulas y

tierra, se colocó una torunda de algodón para evitar que hubiera sangrado, una vez que

estuviese seco y limpio se le colocó una capa de acrílico (se preparó colocando la recina

acrílica en la placa de vidrio y posteriormente se agregó el monómero con la ayuda de una

pipeta y se aplicó con ayuda de la espátula), en la zona donde se encuentraban los

electrodos, cánulas y tierra, una vez que se secó, se procedió a acomodar los conectores de

la siguiente forma (girándolas al contrario de las manecillas del reloj):

T
CI CD CD ED T
EI ED CI EI
 Una vez que se acomodaron, se cortó un poco de los cables para

posteriormente se soldó con el conector (macho y la hembra), y enseguida se

verificó que tuviera corriente con ayuda del multímetro. Una vez que se verificó se

cubrió con el acrílico, evitando tapar las cánulas, posteriormente se retiró el algodón

y las peras para realizarle la saturación dejandó descubierto el conector y las

cánulas, después se retiró a la hembra y se le colocó Micridacyn (para evitar

infecciones), por último, se le inyecto 0.6ml de Penicilina en el musculo de la pierna

trasera.
* Instilación

Después de una semana en que la rata estuvo en reposo en un ciclo de luz

oscuridad, se procedió a realizar el EEG control

Para realizar la instilación primero se checo que la manguera no tuviera

fugas ni burbujas de aire y, también la aguja de institución Hamilton se verifico que

no tuviera burbujas de aire (aplicando presión con una jeringa previamente llenada

de agua destilada), se volvió a llenar de agua sacando el embolo y colocándolo esta

vez en la parte posterior de la Hamilton verificandó que tuviera un flujo constate,

posteriormente se colocó la manguera con la aguja de la instilación en la aguja de la

Hamilton luego se pusó en la Bomba de instilación (kd Scientific), en un vaso de

precipitado con agua destilada, se introdujo la aguja de instilación (evitando que

toque el fondo). Se verificó que no existiera burbujas de aire en la Hamilton (se

realizó con ayuda del embolo succionando el agua, luego se sacudió el embolo y se

volvió a colocar en su lugar), se regresó el embolo dos líneas antes del final de la

graduación,

Se introdujo la jeringa de instilación en el GABA/2-AG (5mM/6µM/2h).

Se agarró a la rata (colocándola mirando hacia enfrente), se le saco el

mandril de la cánula derecha para así introducir la aguja de instilación y prender la

bomba.

* Trazos EEG
 Posteriormente de que termino la instilación, se colocó a la rata en una caja

de vidrio llena de aserrín para conectarló al Amplificador (Grass) para así obtener

los EEG, para la inducción del SAG se registró por 2 h (horas), y los seguimientos

por media hora.

* Laberinto elevado en cruz

La prueba del laberinto elevado en cruz (LEC), este dispositivo utilizado,

consistía en un laberinto compuesto de 4 brazos en forma de cruz elevados a una

altura de 50 cm. Cada brazo, media 9x50 cm y la zona central 9x9 cm. Dos brazos

cerrados (BC), uno frente al otro, rodeados con paredes de madera de 40 cm de

altura, y dos brazos abiertos (BA), es una de las pruebas más utilizadas para medir

el comportamiento similar a la ansiedad. El protocoló de experimentación en el

LEC consistió en ubicar la rata en la zona central con la cabeza orientada hacia uno

de los BA, permitiendo la libre exploración durante 5 min. La entrada a un brazo

correspondía cuando las 4 patas estaban dentro de este.

Posterior de la ejecución de los experimentos, se calcularon los siguientes

parámetros el porcentaje de tiempo de permanencia (%T) y el número de entradas

 (#E): Entradas a los BA (#EBA), entradas a los BC (%EBC), tiempo de

permanencia en los BA (%TBA), tiempo de permanencia en los BC (%TBC),

porcentaje de entradas a los BA.

La prueba se realizó al día siguiente de la instilación, este procedimiento se

graba en un cuarto oscuro con una luz roja, el LEC se iniciaba su grabación cuando

en una pizarra se anota el nombre del experimento, numero del experimento, quien

lo realizo y la fecha, posteriormente se coloca a la rata y se graba por 5 min.

Se llevó a la rata al cuarto de EEG para realizar los seguimientos (por 10

días).

Posteriormente para realizar el análisis de los datos, se observan los videos

grabados, el cual consiste en contabilizar cuantas veces entra en el BC y BA, en la

bitácora se anota el inicio (momento en que se coloca a la rata en el laberinto

elevado en cruz), se debe colocar el tiempo en segundos, primero se debe restar el

primer movimiento menos el inicio, posteriormente se resta el segundo

movimiento menos el primer movimiento y así sucesivamente hasta llegar al

tiempo final; se resta el último tiempo menos el tiempo final. Se deben sumar las

anteriores restas y esta suma debe de dar 300 segundos que equivalen a los 5min

que dura el LEC.

* Análisis de datos y análisis estadístico (SigmaPlot, Origin, GraphPad)

Después de obtener los EEG, primero se sacó del programa Poliview los

registros (son datos de 2 canales en formato txt por cada registro EEG). Una se

obtuvieron los datos, en el programa Adq4chview y seleccionar Importa ASCII (2

canales) (esto es para convertir los 2 canales y que el programa Adq los pueda leer,

la computadora se va a quedar analizando). Luego se fue a File, Leer Archivo de

Adq, seleccionar el archivo .4ch, luego ir a Análisis-Filtros Digitales seleccionar

Pasa Banda BPF, Landa: 0Hz, Landa2: 40Hz, Intervalo: 0, Inicio: 0, Final:

1800/7200 (30min y 2h) posteriormente se seleccionó file leer el archivo .4ch.

Posteriormente ir a Análisis y seleccionar Eliminar Saturaciones (Esté elimina toda

actividad que no sea electroencefalográfica, como artefactos o ruido). Una vez que

terminó de analizar, ir a File export a CSA, se seleccionó Leer Archivo de Adq4ch y

seleccionar el archivo -sat-removed.4ch, se colocó en inicio; 0-1800/7200, Sub

muestreo: se movió la barra hasta csa.freq.41.67. Se aplicó CSA. Posteriormente ir a

Analisis-Arreglo espectral compacto (CSA), se fue a File CSA (fir-csa-csa), tiempo:

0-1800/0-7200, luego seleccionar ver.

Para poder obtener el nivel de disparo, se utilizó el archivo FIR SAT

REMOVED, seleccionó en rango de 10 en 10. Se seleccionó marcas y cursores, y

luegó el cursor en tiempo real, se seleccionaron 10 espigas representativas, y se

anotó sus valores para así promediarlos y obtener el nivel de disparo. Con el cursor

en tiempo real se colocó el valor obtenido anteriormente. Se seleccionó Anilisis-

histogramas, se colocó el tiempo 0-1800 con intervalo de muestra 10, y lego se le

dio aplicar.

Estos valores se guardan, y se colocaron en una hoja de Excel para sacar su

promedio y error estándar.

Para tener los Weblets se exporto valores de potencia ASCII TXT, se

seleccionó un solo canal CH1 en inicio: 4hz, final: 20hz y exportar y se repitió lo

mismo con el CH2.

 Para poder realizar el análisis de datos, fue necesario emplear, los siguientes

programas: SigmaPlot, Origin, GraphPad. El SigmaPlot, se utilizó para obtener

promedios y error estándar, el Origin, se utilizó para graficar dichos datos, y el

GraphPad, se utilizó para obtener el análisis estadístico y obtener el error estándar y

el valor de p.

Posteriormente se utilizó la Prueba de Kruskal-Wallis, es un método no

paramétrico para probar si un grupo de datos proviene de la misma población, para

grupos pequeños. Ya que es una prueba no paramétrica, la prueba de Kruskal-Wallis

no asume normalidad en los datos, y que los datos vienen de la misma distribución.