Universidad de San Carlos de Guatemala

Facultad de Agronomía
Área Tecnológica
Sub-área de Protección de Plantas
Laboratorio de Introducción a la Fitopatología
Primer Semestre 2020
Jornada: Lunes / Matutina
Aux. Karla López

Reporte de práctica 10: Métodos de extracción y morfología de nematodos

fitoparásitos

Wiliam Henry Estuardo Ixpatá Ixtecoc – 201543758

MÉTODOS COMÚNMENTE EMPLEADOS PARA LA EXTRACCIÓN DE NEMATODOS
FITOPARÁSITOS
1. Obtención de hembras de Meloidogyne spp. y patrón perineal.
 Obtención de hembras de Meloidogyne spp. y patrón perineal.

recomendado para extraer hembras de nódulos en raíces

Las muestras de raíces deben estar limpias de fragmentos, suelo y materia orgánica

Posteriormente, con ayuda de estereoscopio, se hace observación cuidadosa.

Dilacerar los tejidos en una caja de petri o en vidrio de reloj.

Luego obtener los nematodos del interior de la raíz

Luego disectar el nódulo bajo el microscopio estereoscopio con el auxilio de agujas de

disección evitando dañar a las hembras

Se puede colectar también la masa de huevos que queda adherida a la hembra en la

parte posterior.

y como complemento al proceso anterior, se puede realizar corte de la región perineal

de las hembras extraídas y estudio de caracteres morfológicos para determinar el
taxón a que pertenece
 2. Embudo de baermann.

El primer paso es armar el

modelo comenzando por colocar
Este metodo Adecuado para
el embudo en el soporte con
nematodos endoparásitos
todos los componentes y luego
migradores.
llenar el embudo parcialmente
con agua.

. Luego agregar agua hasta

Posteriormente con las muestras
completar el volumen del
recolectadas: se debe cortar las
embudo (llenar hasta cubrir el
raíces en pedazos de 0.5 cm y
sustrato). Evacuar o sacar el agua
colocarlo en el papel filtro
del embudo presionando la pinza
resistente.
mohr con los dedos.

Después de 48 a 72 horas, abrir la

Reponer el agua siempre que su
pinza mohr, colectar la
nivel este por debajo de la tela
suspensión en frascos de 50 ml o
(permite mantener húmedo el
más, colocar en las cajas de
sustrato). Se recomienda que la
conteo, determinar los géneros y
operación se haga por las orillas
especies, contando tambien los
para no romper el papel.
especímenes.

En el caso que se trate de suelo,

de la muestra del campo
homogenizada, tomar al azar 25 a
50 gramos y proceder con el
proceso anteriormente indicado.
 3. Método tamizado, también llamado de gravedad o de cobb.

Este metodo es apropiado para extracción de ectoparásitos y endoparásitos

Colocar 200-300 g de suelo desterronado y tamizado en un balde plástico, adicionar agua, calcular 8 a
10 veces el volumen del suelo.

Mezclar bien hasta deshacer las partículas de suelo y dejar en reposo por 30 segundos

Acoplar secuencialmente los tamices malla 35 (0.45 mm) y 325 (0.049 mm). Derramar en ellos el
líquido sobrenadante del balde. En los tamices de malla 35 (0.45 mm) y 100 (0.15 mm) quedarán los
detritos y partículas grandes de suelo. Algunos nematodos grandes pueden quedar retenidos en el
tamiz malla 100 (0.15 mm). La mayoría de nematodos quedarán en los tamices malla 200 (0.075 mm) y
325 (0.049 mm). Para juveniles o nematodos pequeños utilizar malla 400.

Con ayuda de una pizeta y agua recoger todo el material retenido en el tamiz de malla 200 en un
becker de 50 ml. Los nematodos grandes quedarán retenidos en ese tamiz, junto con detritos
orgánicos. Separar esos nematodos observando en el estereoscopio, identificar y contar
 4. Método tamizado y embudo.

Este metodo es es complemento del metodo de

tamizado, y se debe usar el embudo conforme a la
descripción para ese método

La suspensión turbia obtenida en el método de

tamizado es derramada en elo embudo para que
quede limpia

Luego dejar que el agua drene a través del papel

filtro.

Posteriormente se debe cubrir y colocar agua limpia

y tomar la suspensión 24 y 72 horas después.

Firnalemte observar al estereoscopio para

identificar y contar los nematodos.
 5. Método centrifugado.

La cantidad de suelo a procesar (200 cc) se coloca en un recipiente plástico, adicionar agua de chorro,
se debe calcular 8 a10 veces el volumen del suelo.

Revolver el suelo en el agua, agitar con la mano y dejar reposar por 30 segundos.

Luego decantar la suspensión sobre un tamiz de malla 20 o similar que será ubicado encima de otro
tamiz de malla 325-400.

Poteriormetne lavar los residuos de suelo del tamiz malla 325 o 400 y con esta suspensión llenar los
tubos de la centrífuga. No llenar los tubos para evitar derrame de líquido.

Centrifugar a 2-3 mil rpm durante 3 minutos.

terminado el proceso de centrifugación desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en

aproximadamente 10 ml de una solución azucarada 45% (1 libra de azúcar/litro de agua), de nuevo y
asegurarse que todos los tubos tengan el mismo peso.

Centrifugar por 1 minuto a 1700 rpm

Luego verter con cuidado el sobrenadante (solución de azúcar con los nematodos) en el tamiz malla
325 ó 400 y eliminar el azúcar con agua del chorro. Lavar los nematodos con ayuda de una pizeta. El
tamiz es colocado en forma inclinada y el agua es aplicada dentro y detrás del tamiz.

Con el auxilio de una pizeta con agua se recuperan los nematodos en un beaker (+ 20 cc). Como el
volumen requerido es bajo, los nematodos deben llevarse en un punto del tamiz el cual debe colocarse
en forma inclinada.

Observar con la ayuda de un estereoscopio si la muestra tiene nematodos.

Posteriormente determinar los géneros presentes en la muestra.

En el caso que el sustrato sea vegetal (tallo, raíz) se recomienda cortar en trozos de 1/2 cm y licuar a una velocidad
baja y por poco tiempo (+1 min). La cantidad a procesar depende de la disponibilidad de raíces (10-30 g).
6. Método de incubación.

Utilizado para analizar

material vegetativo (tallos,
ramas, flores, frutos y
semillas) y se desea saber si
tiene nematodos asociados

Colocar el material
recolectado en cajas de
petri, en beaker u otro
recipiente con agua.

Dejar reposar por un iempo

de 24 horas.

Luego observar si existen

nematodos en el agua
donde fue colocado el
sustrato.
 7. MÉTODOS PARA OBTENCIÓN DE QUISTES
Utilizado para la extracción de quistes de suelo o de raíces y para ello se pueden utilizar varios
procedimientos tles como: Flotador de Fenwick y el Descrito por Tihohod.
a) Obtención de quistes de suelo

Las cantidades a procesar pueden

variar de 200-500 g. Colocar el
La muestra obtenida en el campo
suelo secado y tamizado, en
debe de ser secada en la sombra y
beaker de 1000 ml de capacidad o
pasar la muestra por un tamiz
colocarlo directamente en el
malla 5 (4 mm).
embudo. Adicionar agua y agitar
vigorosamente.

También puede verter el

sobrenadante en un embudo
Los quistes presentes flotan con
forrado con papel de filtro y
los detritos orgánicos y son
después drenar el agua. En el papel
colectados en tamices malla 20
filtro se colocan los quistes y
(0.850 mm), y 60 (0.250 mm) y
detritos orgánicos y pueden ser
colectar quistes en agua.
llevados al estereoscopio para
observación y separación

b) Método de obtención de quistes de suelo en flotación de acetona

luego verter el
Realizar el proceso
sobrenadante en un
indicado en los incisos 1 al
embudo forrado con papel
3 del proceso anterior
de filtro y después drenar
(insciso a).
el agua

Posteriormente adicionar
luego secar la muestra. 25 ml de acetona un
Esto puede realizarse bajo erlenmeyer de 50 ml,
una bombilla encendida. adicionar la muestra seca
y agitar.

Llenar el erlenmeyer con

acetona y recolectar los
cistos con ayuda de un
pincel.
 c) Método de obtención de quistes en raíces

Retirar cuidadosamente el suelo

adherido en las raíces. Para eso, Dejar que la tierra se desprenda
tomar las raíces y colocarlas en libremente de las raices.
un balde con agua.

Tomar las raíces y colocarlas en

tamiz malla 20 (0.850 mm) y
luego en malla 60 (0.250 mm),
Los quistes serán retenidos en el
direccionar la descarga del
tamiz malla 60 (0.250 mm.
chorro para esas raíces, esto
hará que los quistes se
desprendan de ellas.

Posteriormente se debe colectar

los quistes y llevar al
estereoscopio o microscopio
para observación y conteo.
 CUESTIONARIO

1. ¿Por qué se utiliza azúcar (45%) en la extracción de nematodos en el método de

centrifugado?

Se utiliza el azúcar para que después del proceso de centrifugado se suspenda el suelo y los
nematodos, esto hará que los nematodos floten en la solución del azúcar, y las partículas de
suelo queden en el fondo del tubo.

2. ¿Qué ventajas y desventajas observó entre los métodos utilizados para extraer
nematodos?

El método de tamizado o método de cobb es una alternativa muy recurrida principalmente

cuando no se dispone de centrífuga, este método tiene la ventaja de ser un método rápido y
además se puede extraer la mayoría de nematodos que tengan movimiento lento y, la
desventaja que tiene es que las muestras salen sucias dificultando a veces la observación. A
comparación del método de centrifugado este tiene las ventajas de ser rápido y permite el
procesamiento de varias muestras, la suspensión es limpia y se pueden extraer nematodos de
partes vegetativas o de suelo.

Otra de las ventajas que poseen algunos métodos es que son sencillos y no requiere de
equipo sofisticado, pero también puede tener la desventaja que las muestras salen sucias
dificultando a veces la observación.