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Ciencias de las plantas 170 (2006) 732–738

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Producción eficiente de plantas transgénicas de papa (S. tuberosum L. ssp.

andigena) mediante transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens
a b
Anjan K. Banerjee , Salomé Prat , David J. Hannapel un, *

a
Departamento de Horticultura y Fisiología Vegetal Interdepartamental, Universidad Estatal de Iowa, Ames, IA 50011­1100, Estados Unidos
b
Departamento de Genética Molecular Vegetal, Centro Nacional de Biotecnología, Consejo Superior de Investigaciones Científicas,
Campus de Cantoblanco Universidad de Madrid, Madrid, España

Recibido el 27 de septiembre de 2005; recibido en forma revisada el 4 de noviembre de 2005; aceptado el 4 de noviembre de 2005
Disponible en línea el 18 de enero de 2006.

Abstracto

La papa es un cultivo objetivo importante para aplicaciones biotecnológicas y es un sistema modelo valioso para estudiar procesos de señalización. La transformación
eficiente es fundamental para análisis genéticos rápidos. Se ha establecido la producción de brotes de papa transgénicos dentro de las 4 semanas posteriores al momento
de la inoculación inicial de explantes de hojas por Agrobacterium tumefaciens con la subespecie andigena de Solanum tuberosum. Las plantas vigorosas, la herida precisa
y uniforme de la nervadura central del explante de hoja y la composición del medio de regeneración desempeñan papeles clave en el desarrollo de este eficiente protocolo
de regeneración de brotes. Para producir callos a partir de explantes de hojas en 7 días, el medio basal se complementó con concentraciones optimizadas de
bencilaminopurina y ácido naftalenoacético. La incubación en medio basal suplementado con una combinación de ribósido de zeatina, ácido naftaleno acético y ácido
giberélico indujo la formación de brotes a partir de callos después de 28 días de incubación. En este protocolo mejorado, se eliminó el precultivo de explantes comúnmente
utilizado con medio nutritivo y el medio de inoculación de Agrobacterium no se complementó con ninguna fitohormona. La inducción de raíces a partir de supuestos brotes
transformados se logró en un medio basal libre de hormonas suplementado con kanamicina. Se observó una formación de raíces normal y saludable en 5 días y el 91% de
los brotes seleccionados enraizaron con kanamicina. Mediante el uso de análisis RT­PCR con cebadores específicos de genes, todos los brotes enraizados de 20
seleccionados de cinco líneas diferentes exhibieron expresión del transgén StBEL5 de longitud completa impulsado por el promotor CaMV 35S. El protocolo aquí descrito
es simple, eficiente y produce brotes transgénicos en tan solo 4 semanas después de la inoculación con Agrobacterium.

# 2005 Elsevier Ireland Ltd. Todos los derechos reservados.

Palabras clave: Papa; Transformación; agrobacteria; tubérculos

1. Introducción Los tipos nativos presentan rendimientos muy pobres. Aumentar el

La papa es el cuarto cultivo más importante del mundo con una
producción anual cercana a los 300 millones de toneladas. El tubérculo,
la parte más importante de la planta, es una excelente fuente de
carbohidratos complejos, proteínas y vitaminas. Debido a su alta calidad
nutricional y facilidad de producción, la papa es un cultivo candidato
principal para mejoras mediante el mejoramiento genético y la
biotecnología. Por ejemplo, el tubérculo de papa (género Solanum) es
uno de los cultivos de subsistencia más importantes en la región andina
de América del Sur. Los agricultores indígenas han cultivado
tradicionalmente variedades nativas por sus cualidades de adaptación y
características culinarias [1]. Sin embargo, la mayoría de estos se adaptaron producción de brotes [11].
* Autor correspondiente. Tel.: +1 515 294 9130; fax: +1 515 294 0730.
Dirección de correo electrónico: djh@iastate.edu (DJ Hannapel).
rendimiento de los tubérculos en esta región mediante enfoques genéticos
contribuiría significativamente a disminuir la pobreza y mejorar la calidad
de vida. El esclarecimiento de genes específicos que regulan el
crecimiento de los tubérculos ahora permite mejorar el rendimiento de los
tubérculos mediante aplicaciones biotecnológicas [2,3].
Se encuentran disponibles protocolos de transformación mediada por
Agrobacterium para la introducción de genes extraños en cultivares
comunes de papa [4­11]. Sin embargo, existen muy pocos informes sobre
la transformación de cultivares andinos. Actualmente, sólo hay un informe
sobre la transformación mediada por Agrobacterium de cultivares de
papa sudamericanos y este protocolo requiere 7 semanas para la
En especies de papa silvestre como Solanum tuberosum ssp.
andigena, se requieren fotoperíodos de días cortos (SD) para la formación
de tubérculos y esta subespecie no tuberiza cuando se cultiva en días
largos (LD) o SD suplementados con un descanso nocturno.

0168­9452/$ – ver portada # 2005 Elsevier Ireland Ltd. Todos los derechos reservados. doi:10.1016/
j.plantsci.2005.11.007
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La formación del tubérculo representa un proceso de desarrollo específico que
se ha estudiado intensamente durante muchos años. Muchos factores como la
luz, el fotoperiodo, las giberelinas (GA), las citoquininas y la nutrición afectan la
tuberización en la papa. Debido a sus procesos dinámicos de crecimiento, la
papa es un cultivo objetivo importante para el estudio de la señalización, el
fotoperiodo, el metabolismo del almidón y las relaciones fuente­sumidero [12­18].
Recientemente, se han logrado avances significativos en nuestra comprensión
de los controles moleculares involucrados en la regulación de la tuberización
[2,3,17,19,20]. Todo este trabajo se implementó utilizando la subespecie
andigena sensible a fotoperíodos. Andigena no solo es un cultivo agronómico
importante [21], sino que debido a su sensibilidad al fotoperíodo, también
representa un modelo útil para estudiar los mecanismos de señalización
relacionados con el fotoperíodo.
La optimización de la producción transgénica de esta subespecie sería invaluable
para los científicos en genética y desarrollo, ahorrando tiempo y trabajo. Este
informe se centra en un protocolo de transformación mejorado para la subespecie
andigena de S. tuberosum que es reproducible y reduce el tiempo necesario
para producir brotes transformados de forma estable. El transgén utilizado en
este estudio es el ADNc completo, StBEL5, de patata. Como marcador de
transformación, la sobreexpresión de este factor de transcripción conduce a una
mayor formación de tubérculos [2]. Las técnicas descritas para esta aplicación a
la subespecie andigena podrían optimizarse potencialmente para cualquier
especie o cultivar de papa.
2. Materiales y métodos
2.1. Materiales vegetales
Los tubérculos de patata (S. tuberosum L. ssp. andigena línea 7540) fueron
proporcionados por Salomé Prat (CSIC, Madrid, España) y se propagaron en
medio de cultivo que contenía mezclas de sales basales de Murashige y Skoog
[22] suplementados con sacarosa al 2% y solidificados con Gelrita al 0,2%
(Sigma). Se extirparon las puntas de los brotes y se subcultivaron en medio
fresco cada 4 semanas.
Los cultivos se incubaron en una cámara de crecimiento con un fotoperíodo de
1
16 h ( luz fluorescente blanca fría de 35 mmol m2 s) a 27 °C durante un período
de 4 semanas.
2.2. Vector de transformación y cepa de Agrobacterium.
La construcción se generó mediante la introducción del ADNc de longitud
completa de StBEL5 (n.º de acceso AF406697) en el vector binario pCB201 [23]
y conducido por el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor con un
terminador nos. StBEL5 se utilizó como gen marcador debido a nuestros estudios
en curso sobre su papel en la formación de tubérculos y el fenotipo obvio que
muestran las líneas de sobreexpresión [2]. El vector se transformó en la cepa
GV2260 de Agrobacterium tumefaciens. En cada experimento, los cultivos de
bacterias utilizados para la infección de explantes se iniciaron a partir de placas
frescas cultivadas a 28 8 C durante 2 días. Se cultivaron cultivos nocturnos de
Agrobacterium que contenían la construcción transgénica hasta una lectura de
DO600 de 1,0 a 1,2 a 28 8 C, en una incubadora con agitador a 250 rpm. Se
transfirieron de tres a 5 ml de este cultivo a 15 ml de medio YEP nuevo sin
antibióticos y se cultivaron hasta que la lectura de DO600 alcanzó 0,5. Luego el
cultivo se cultivó en
733
250 rpm durante otras 2 h o hasta que la OD600 alcanzó 0,8–1,0. El cultivo
bacteriano recolectado se mantuvo en hielo hasta la infección de los explantes
de hojas.
2.3. Transformación y regeneración vegetal.
Para la transformación se seleccionaron plantas sanas de cuatro semanas
de edad con hojas de gran tamaño. Se cortó una hoja de la planta y se eliminó
el pecíolo y 1 mm de la base de la hoja.
La nervadura central de la lámina de la hoja fue herida varias veces dejando un
espacio de aproximadamente un mm entre los cortes. Luego, la hoja herida se
colocó con el lado adaxial (superior) hacia abajo en el medio de infección líquido
(IM) para evitar la desecación. Se manipularon varias hojas juntas para minimizar
el estrés de los explantes. Se prepararon aproximadamente 20 hojas y se
colocaron con el lado adaxial hacia abajo en una placa de Petri (100 mm x 20
mm) que contenía 20 ml de líquido IM sin fitohormonas. Se prepararon alrededor
de 80 a 100 hojas para cada experimento y se agregaron 100 ml del cultivo de
Agrobacterium enfriado con hielo a cada placa de Petri. La placa que contenía
las hojas se agitó durante un período de 15 min a temperatura ambiente en un
agitador de plataforma a 35 rpm y luego se selló y se incubó en la oscuridad
durante 48 h a temperatura ambiente para el cocultivo. Después del período de
incubación en oscuridad, las hojas se colocaron con el lado adaxial hacia abajo
en un medio de inducción de callos (MGC) y se incubaron en una cámara de
crecimiento con un fotoperíodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad bajo una luz
fluorescente blanca fría de 35 mE m2 s a 27 1 8 C durante 8 días. A diferencia
1
de los métodos anteriores, no se realizó ningún lavado ni secado de los explantes
de hojas inmediatamente antes de transferirlos al medio MGC. Después de 8
días de incubación, los explantes se transfirieron a medio MGS y se incubaron
como anteriormente. Las primeras yemas aparecieron a partir del callo entre 25
y 28 días (14 a 17 días en medio MGS) después de la infección inicial por
Agrobacterium (Fig. 1). Cuando los brotes alcanzaron una longitud de 2 a 3 cm,
se cortaron y se transfirieron a un medio de enraizamiento (RM) y se incubaron
bajo las mismas condiciones de temperatura y luz que se describieron
anteriormente. El protocolo de transformación se repitió en cuatro experimentos
separados durante un período de 6 meses.
2.3.1. Composición de los medios
El medio de cultivo utilizado en nuestro estudio se solidificó con 2 gl de
gelrita y el pH se ajustó a 5,8.
2.3.1.1. Medio de infección (IM). Sales de MS sin fitohormonas y vitaminas
suplementadas con 20 g l1 de sacarosa.
2.3.1.2. Medio de inducción de callos (MGC). MS sales y vitaminas, 16 g l1
glucosa, 5 mg l1 NAA, 0,1 mg l1 BAP, 250 mg l1 cefotaxima (claforan, Aventis,
EE. UU.), 50 mg l1 kanamicina (Sigma, EE. UU.).
2.3.1.3. Medio de inducción de disparos (MGS). Sales y vitaminas de MS, 16 g
l1 de glucosa, 2,2 mg l1 de zeatina­ribosido, 0,02 mg l1 NAA, 0,15 mg l1 GA3,
250 mg l1 de cefotaxima, 50 mg de kanamicina.
1
yo
2.3.1.4. Medio de enraizamiento (RM). MS sales y vitaminas, 20 g l1 sacarosa,
250 mg l1 cefotaxima, 75 mg l1 kanamicina.
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Fig. 1. Diagrama de flujo del protocolo de transformación de S. tuberosum ssp. andígena. IM, medio de infección; MGC, medios de inducción de callos; MGS, medio de inducción de disparos.
Consulte la Sección 2 para conocer la composición de los medios.
2.3.2. Aislamiento de ARN y análisis por RT­PCR
Se aisló ARN total de 20 plantas de papa supuestamente
transformadas de cinco líneas de transformación independientes
utilizando el kit RNeasy Plant Mini (Qiagen). Cada muestra de ARN se
trató con Ambion Turbo DNase para eliminar la contaminación del ADN.
Se utilizó un microgramo de ARN total como plantilla para la
transcripción inversa (RT). Los ADNc se sintetizaron utilizando un
cebador específico de gen (GSP1) y un cebador inverso específico de
vector binario, NT142. Las reacciones se realizaron utilizando el sistema
de RT­PCR de un solo paso Superscript­III (Invitrogen) con ADN
polimerasa Platinum taq en un termociclador MJ Research PTC­200.
La mezcla de reacción RT se sometió a las siguientes condiciones: 50
8C durante 30 min, 94 8C durante 2 min, 94 8C durante 15 s, 60 8C
durante 30 s, 68 8C durante 1 min, 40 ciclos seguidos de 1 ciclo de
incubación a 68 8C durante 5 min. Se usó un ml de producto de RT
como plantilla para la segunda PCR con un cebador específico de gen
anidado (GSP2) y el cebador específico de vector inverso, NT142.
La PCR se realizó en las siguientes condiciones: 94 8C por 3 min, 94
8C por 30 s, 60 8C por 30 s, 72 8C por 1 min, 35 ciclos y seguido de 1
ciclo a 72 8C por 10 min. Los cebadores para análisis de RT­PCR se
diseñaron a partir de 30 ­UTR de StBEL5 y se sintetizaron en las
Instalaciones de Secuenciación y Síntesis de ADN de la Universidad
Estatal de Iowa. Secuencia de los cebadores directos, GSP1: (50
ATCATAGGAGAAAAGAAGTGGAGA30 ), GSP2 (50 TTT­
CTTTTGGGTTGGCTTGGAGT30 ) y el cebador inverso, NT142 (50
GCGGGACTCTAATCATAAAAAC30 ). NT142 es
secuencia del terminador nos que está en el vector binario y se
transcribe como una porción del ARN transgénico de StBEL5.
Los productos de la PCR se sometieron a electroforesis en un gel de
agarosa al 1,5% y se fotodocumentaron bajo luz ultravioleta.
2.3.3. Actividad de tuberización de las líneas de papa transgénica.
Se colocaron esquejes de yemas axilares de plantas transgénicas
y de control (S. tuberosum ssp. andigena línea 7540) en cajas Magenta
que contenían 80 ml de medio inductivo semisólido de Murashige­
Skoog suplementado con 60 g l1 de sacarosa (p/v) y se incubaron en
la oscuridad . a temperatura ambiente [24]. Se examinó la formación
de tubérculos en las plantas y se obtuvo el número de tubérculos por
planta después de 4 semanas de incubación. También se transfirieron
varias líneas transgénicas al invernadero y a las cámaras de crecimiento
para examinar su fenotipo y actividad de tuberización.
3. Resultados y discusión
3.1. Transformación y producción de callos.
Un protocolo de transformación simple y rápido para la papa andina,
S. tuberosum ssp. andigena, no ha sido reportada anteriormente.
Andigena es sensible al fotoperiodo y produce tubérculos sólo en
condiciones de días cortos. Estas especies fotoperiódicas son
fundamentales para comprender la señalización mediada por la luz.
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AK Banerjee et al. / Ciencias de las plantas 170 (2006) 732–738 735

tabla 1

Frecuencia de transformación de explantes de hojas y eficiencia de la producción de yemas en el medio de selección iniciala

Número de explantes Número de explantes Promedio transformación de Número de explantes Promedio brote de brote

por experimento que desarrollaron callos (%) explantes de hojas (%) brote desarrollado eficiencia de regeneración (%)

97 77 86,2 4,3 53 58,0 7,5

100 84 49
89 76 40
90 87 46

a .
Contiene sales basales de MS y vitaminas más kanamicina a 50 mg l1

Tabla 2

Eficiencia de transformación y análisis de supuestos brotes transgénicos en medio que contiene kanamicina.

Número de explantes Número de brotes Número de Número de Promedio enraizamiento Transformación Promedio transformación
por experimento desarrollado en brotes transferidos brotes enraizados de disparar en eficienciaa por eficiencia (%)
medio MGS a RM en RM RM (%) experimento (%)

97 46 42 40 91,2 5,3 41.2 35,6 4,8

100 37 37 34 34.0
89 40 37 33 37.1
90 31 31 27 30.0

a
La eficiencia de transformación se calculó como el número de brotes que desarrollaron raíces en RM (MS + kanamicina a 75 mg l1 ) dividido por el número de explantes.
por experimento.

y se utilizan ampliamente como sistemas modelo [2,3,17,19,20,25]. A
Un protocolo de transformación rápido y eficiente para esta línea permitiría
Facilitar la investigación en biología de la papa. En el método descrito
aquí, las yemas de los brotes se producen tan pronto como 4 semanas después
Infección por Agrobacterium en comparación con las 10 semanas anteriores
informes de transformación de papa [26]. Nuestro método produjo un
eficiencia general de transformación de explante del 86% (Tabla 1) con
una eficiencia final del 35% (Tabla 2). El transgén utilizado aquí fue
el gen de longitud completa de la papa, StBEL5, impulsado por el CaMV 35S
promotor [2]. Sobreexpresión de este factor de transcripción.
mejora la formación de tubérculos en plantas transgénicas y este rasgo
se utilizó como marcador para líneas transformadas de manera estable [2].
Plantas madre vigorosas y sanas de S. tuberosum ssp. andigena
línea 7540 se mantuvieron en medio basal MS suplementado
con 20 g l1 de sacarosa. Puntas de brote más una yema axilar
(aproximadamente 2­3 cm de longitud) se utilizaron para explantes y
subcultivados a intervalos de 4 semanas. Dentro de las 4 semanas posteriores a la incubación,
el brote apical o axilar había desarrollado de 8 a 10 hojas.
La intensidad de la luz y las temperaturas óptimas fueron cruciales para
producción de plantas madre que produjeron explantes de alta calidad
material para la transformación. La selección de explantes de hojas grandes.
(0,5–1,0 cm2 ) de una planta madre sana es fundamental para generar
una alta frecuencia de regeneración y transformación de brotes. En
Este protocolo, el cultivo de tres a cinco puntas de brotes en Magenta.
cajas que contenían 90 ml de medio nutritivo dieron como resultado más
crecimiento vigoroso de las plantas madre que el cultivo en tubos de ensayo
(150 mm 25 mm) con 10 a 15 ml de medio, como suele ocurrir
utilizado [10,11,27]. El crecimiento mejorado en las cajas Magenta es
probablemente debido a la mayor disponibilidad de espacio aéreo y
nutrientes. Nuestros resultados indicaron que la incubación de brotes
explantes en un fotoperiodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad a una temperatura
1
de 27 1,0 8C con una intensidad luminosa de 35 mE m2 s
produjo plantas madre sanas y vigorosas con hoja superior
vigor del explante que aquellos incubados a intensidades más bajas y
temperaturas (datos no mostrados).
La cepa de Agrobacterium tumefaciens utilizada para la transformación
juega un papel importante en la determinación de la eficiencia de
infección [28]. Aunque la cepa huésped de Agrobacterium
LBA4404 se ha utilizado comúnmente para la transformación de
papa [5,6,8,11,26] trabajos anteriores [29] mostraron que la
La cepa huésped de Agrobacterium GV2260 contribuyó a una mejora
Eficiencia de transformación en comparación con LBA4404. Residencia en
estos resultados, utilizamos la cepa huésped GV2260 exclusivamente en
estos experimentos. Además, el protocolo actual (Fig. 1)
elimina el tedioso procedimiento de lavado [4,10] y la preincubación y/o
incubación en oscuridad de los explantes comúnmente utilizados
en transformaciones de papa [11,30]. Además, el medio de infección
utilizado en el presente protocolo carece de fitohormona.
Se realizó la adición de cualquier fitohormona al medio de infección.
demostrado ser perjudicial para el vigor de los explantes de hojas y no tenía
efecto sobre la eficiencia de la transformación y regeneración [4].
La herida del explante de hoja a lo largo de la nervadura central fue
realizado como se describe en la Sección 2. Este preciso y uniforme
La técnica fue mucho más efectiva para inducir callos y brotes.
producción que la herida irregular y aleatoria de la lámina (datos
no mostrada). Los explantes de hojas heridas mostraron signos iniciales de
crecimiento, que se manifiesta como hinchazón de los explantes, después de 2 a 5 días
de incubación (Fig. 2A). Entre todas las combinaciones de
fitohormonas probadas, una combinación de BAP a 0,1 mg l1 y
NAA a 5,0 mg l1 fue más eficaz para la inducción de
callo a lo largo del borde cortado de la nervadura central. En total, el 86% de los
Los explantes se hincharon y desarrollaron callos en la superficie cortada después de
7–8 días de incubación en medio MGC que contiene 50 mg l1 de
kanamicina y 250 mg l1 de cefotaxima (Cuadro 1). El
Los discos foliares restantes no mostraron signos de crecimiento o
exhibió necrosis. NAA utilizado en el protocolo actual fue
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736 AK Banerjee et al. / Ciencias de las plantas 170 (2006) 732–738
Fig. 2. Etapas de transformación de S. tuberosum ssp. andígena, línea 7540. (A)
Discos de hojas cultivados en medios de inducción de callos después de 5 días de incubación. (B)
Producción de brotes (flechas) a partir de callos transformados después de 8 semanas en medios
de inducción de brotes.
superior a IAA (utilizado en la referencia [11]) para la inducción de callos.
Además, De Block [4] demostró que el callo inducido por IAA era más difícil de
regenerar. El callo recién formado se convirtió en nódulos densos al final de la
segunda semana de incubación en medio MGS. Los explantes de hojas con
callo nodular verde desarrollaron las primeras yemas 4 semanas después de
la inoculación inicial de Agrobacterium (Fig. 1) cuando se cultivaron en medio
MGS y se incubaron bajo un fotoperíodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad bajo
una intensidad de luz de 35 mE m2 s . En un experimento independiente que
1
. numerosos brotes
utilizó el vector pBI101 y un promotor nativo, surgieron
transgénicos a partir de callos en sólo 23 días desde la inoculación. Todas las
líneas transgénicas de esta transformación que se analizaron fueron positivas
para la expresión de GUS (datos no mostrados).
3.2. Regeneración de disparos
La inducción rápida y temprana de yemas es un paso clave para el éxito
de la transformación. El medio MGC suplementado con NAA fue óptimo para
la producción de crecimiento de callos nodulares, ideal para la regeneración de
brotes. La transferencia de estos explantes al medio de inducción de brotes
después de 7 a 8 días fue crucial para controlar una mayor proliferación de
callos. Probamos varias combinaciones de fitohormonas en medio basal MS
para la regeneración temprana de brotes, pero nos centramos en ZR, NAA y
GA3 debido a su uso previo en cultivos de papa [26]. La producción óptima de
brotes se logró utilizando ZR, NAA, GA3 en concentraciones de 2,2 mg l1
, detectado en todas las plantas seleccionadas (Fig. 3, carriles
0,02 mg l1 y 0,15 mg l1 , respectivamente. Esta combinación dio como resultado
una producción de brotes rápida y estable junto con la supresión de un mayor
crecimiento de callos. La presencia de NAA en niveles tan bajos en el medio
MGS ayuda a mantener el crecimiento pero controla la proliferación excesiva
de callos, mientras que ZR y GA3 inducen la regeneración de las yemas y el
alargamiento de los brotes. Al utilizar dos medios diferentes (MGC y MGS)
para la inducción de callos y brotes, respectivamente, la producción de brotes
se puede optimizar fácilmente. Es posible que una mayor optimización de este
sistema pueda reducir el tiempo necesario para la producción de rodajes.
aún más.
Después de 4 semanas de incubación, un promedio del 58% de estos
explantes desarrollaron yemas (Tabla 1). Se produjeron aproximadamente
cuatro yemas por explante en este medio después de 4 semanas de incubación
desde el día de la infección por Agrobacterium.
También se observó un aumento en la frecuencia de regeneración de las
yemas de los brotes de hasta un 63% en estos explantes cuando se transfirieron
continuamente cada 10 días a medio MGS fresco (Fig. 2B, datos no mostrados).
Las yemas de los brotes recién formados alcanzaron una altura de 2 a 3 cm en
1 a 2 semanas. Luego fueron extirpados y transferidos a medios de
enraizamiento (RM) que contenían kanamicina 75 mg l1 . En general, este
protocolo produjo una eficiencia de transformación del 35% (Tabla 2).
Nuestros datos mostraron que las heridas precisas y uniformes de la
nervadura central de los explantes dieron como resultado una regeneración de
brotes más eficiente (63% versus 16%) que las heridas irregulares y aleatorias
de la lámina cuando se cultivaron en medio MGS. La eficiencia general de la
transformación también disminuyó en los explantes heridos en la superficie de
la lámina de la hoja (datos no mostrados). De manera similar a nuestros
resultados, De Block [4] también demostró que las heridas extensas de la hoja
reducían la eficiencia de transformación y regeneración. Observamos una
recuperación óptima de los brotes y un control adecuado del crecimiento celular
no transformado mediante la utilización de kanamicina a un nivel de 50 mg l1
en el medio de inducción de brotes. Un aumento de la concentración de
kanamicina a 75 mg l1 en el medio MGS retrasó la regeneración de los brotes
entre 12 y 14 días (datos no mostrados).
3.3. Selección y confirmación de expresión transgénica.
De los brotes que fueron seleccionados y transferidos al medio de
enraizamiento, más del 90% enraizaron (Cuadro 2). La inducción de raíces se
observó ya entre 4 y 5 días después de la transferencia a RM. Los brotes
enraizados comúnmente se transfirieron al suelo después de 10 días en RM.
Todas las plantas enraizadas exhibieron un fenotipo normal. Este bajo número
de fugas probablemente se deba al nivel de kanamicina que se utilizó en el
MGS. Observamos que una concentración de kanamicina de hasta 75 mg l1
en el medio de enraizamiento fue eficiente para detectar brotes no
transformados. Niveles más bajos de kanamicina (50 mg l1 ) pueden ser más
adecuados para inducir la regeneración temprana de las yemas de los brotes,
pero también permiten más escapes [8].
Para verificar la expresión de líneas transgénicas, se realizó un análisis de
RT­PCR con cebadores específicos de genes y un cebador específico de
vector en 20 brotes enraizados seleccionados al azar de cinco líneas diferentes
(Fig. 3). Se confirmó que los 20 eran positivos mediante RT­PCR utilizando
cebadores específicos de genes anidados (solo 10 de los 20 se muestran en la
Fig. 3). Estas PCR amplificaron el fragmento StBEL5 de 380 pb esperado
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Fig. 3. Productos de reacción de una PCR anidada. La primera PCR fue una RT­PCR de un
solo paso a partir de 1,0 mg de ARN total. La segunda fue una PCR convencional con un cebador
anidado. Se utilizaron cebadores específicos de gen de la región 30 no traducida de StBEL5 y el
otro de la secuencia terminadora nos del vector binario, pCB201. Los carriles 1 a 10 representan
productos de ADNc de ARN extraídos de 10 brotes que enraizaron en medios suplementados
con 75 mg l1 de kanamicina. Se probaron veinte brotes enraizados. Los 20 fueron positivos. El
carril 11 representa el producto de PCR de ARN de plantas no transformadas. El carril 12 es un
producto que utiliza la secuencia StBEL5 de longitud completa como plantilla. SM son marcadores
de tamaño.
1­10), lo que confirma que StBEL5 se integró de manera estable en el
genoma y se expresó en estos brotes seleccionados con kanamicina.
No se detectó ningún producto de PCR en las plantas de control no
transformadas (Fig. 3, carril 11). El plásmido vector binario que contiene
la secuencia StBEL5 de longitud completa se usó como control positivo
(Fig. 3, carril 12). Brotes que no formaron raíces en el medio de
enraizamiento suplementado con kanamicina 75 mg l1 se marchitaron y
murió después de 2 a 3 semanas.
Se evaluó la capacidad de formación de tubérculos de los brotes
enraizados de varias líneas seleccionadas [2]. El ensayo de tuberización
se realizó con plantas cultivadas in vitro. En trabajos anteriores, la
sobreexpresión del transgén (solo secuencia codificante) utilizado en
este estudio, StBEL5, dio como resultado plantas transformadas de
manera estable que exhibieron una mayor capacidad para la formación
de tubérculos [2]. Para el análisis in vitro, se cultivaron 10 plantas de 10
líneas transformadas en condiciones de días cortos (inductivas) y se
evaluó la formación de tubérculos. Ocho de las 10 líneas produjeron
más tubérculos que las líneas de control después de 14 días de
condiciones SD (Cuadro 3). La mayoría de las líneas transgénicas
tuberizaron en condiciones de fotoperíodo de día largo (no inductivo)
(datos no mostrados), lo que indica los efectos estimulantes de la
sobreexpresión del gen StBEL5. Una capacidad mejorada para la
formación de tubérculos es una indicación de que el transgén StBEL5
es funcional en estas líneas 7540 transformadas [2].
4. Conclusión
Existen numerosos informes de transformación mediada por
Agrobacterium con varios cultivares y especies de papa comerciales,
incluidos, por ejemplo, protocolos para 'Bintje', 'Desiree', 'Russet
Burbank' y 'Superior' [ 5,8,10,26,30 ,31]. Sin embargo, sólo existe un
informe sobre transformación de cultivares de la región andina de
América del Sur. La transformación de los cultivares andinos ha sido
difícil o infructuosa. Recientemente, se produjeron líneas transgénicas
de los cultivares andinos Diacol Caprio y Parda Pastusa mediante
transformación mediada por Agrobacterium utilizando discos foliares
[11]. Considerando que este protocolo se ha simplificado
737
Tabla 3
Tasa de tuberización con líneas transgénicas StBEL5 in vitro en condiciones de día corto
línea transgénica No. de tubérculos
después de 14 DE
FL1­8 6
FL1­3 9
FL2­8 6
FL2­15 3
FL2­17 4
FL3­7 1
FL3­9 6
FL3­18 13
FL3­23 2
FL3­26 4
Cds5­19 7
7540 2
Las líneas transgénicas se verificaron mediante RT­PCR y enraizamiento en medio de selección.
FL indica la construcción StBEL5 con la secuencia de ARN completa, incluidas las UTR (n.º de
acceso AF406697) de este experimento. Cds5­19 es una línea transgénica con la secuencia
codificante únicamente de StBEL5 [2]. La línea 7540 es Solanum tuberosum ssp. andígena. Las
evaluaciones se realizaron en 10 plantas por línea cultivadas en un medio MS suplementado con
6% de sacarosa, 8 h de luz/16 h de oscuridad.
y mejorado, todavía tiene limitaciones. En comparación con el protocolo
actual, tiene una menor eficiencia de regeneración de brotes (34%
versus 58%) y un período de tiempo más largo requerido para la
inducción de yemas de brotes (7 semanas versus 4 semanas). Además,
el protocolo actual da como resultado una eficiencia de transformación
del 35% con más del 90% de los brotes seleccionados enraizando en
RM suplementado con kanamicina. Este protocolo también simplifica el
procedimiento de incubación inicial del explante al eliminar los pasos
de lavado y preincubación, tan comúnmente utilizados en métodos de
transformación anteriores [4,10,11,30].
, mg l1 y GA3 a 0,15
La combinación de ZR a 2,2 mg l1 NAA a 0,02
mg l1 en este método dio como resultado un aumento sustancial en la
eficiencia de regeneración de los brotes en comparación con los
métodos anteriores [11,26,30]. La presencia de un bajo nivel de NAA en
los medios MGS promueve el crecimiento activo del cultivo de callos
morfogénicos. La presencia de ZR en el medio de inducción de brotes
es importante para retardar el crecimiento del callo y acelerar la
formación de yemas [10,11]. Los cultivos de células de papa son muy
sensibles a la variación somaclonal y la regulación de la proliferación
de callos puede minimizar dicha variación [10]. El medio MGS descrito
aquí fue efectivo porque controló el crecimiento de callos e indujo la
regeneración de brotes simultáneamente. El medio de inducción de
callos descrito aquí contenía solo 5,0 mg l1 de NAA y 0,1 mg l1 de BAP.
Se utilizó eficazmente una combinación de NAA, ZR y GA3 para inducir
callos a partir de explantes internodales de Solanum phureja [26], pero
este protocolo requirió de 10 a 12 semanas de incubación en medios
de inducción de brotes para la regeneración de los brotes. En resumen,
el protocolo mejorado de transformación que se describe aquí es simple,
eficiente y produce un porcentaje muy alto de brotes transformados en
solo 4 semanas.
Modificando ligeramente los niveles y combinaciones de hormonas,
este protocolo podría adaptarse fácilmente a otros cultivares y especies
de papa.
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738 AK Banerjee et al. / Ciencias de las plantas 170 (2006) 732–738
Agradecimientos
Agradecemos a la Dra. Mithu Chatterjee por sus comentarios
críticos durante la edición del manuscrito. Este trabajo fue apoyado
por el premio de la Fundación Nacional de Ciencias no. 0344850 en el
División de Biología Organística Integrativa.
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