Prólogo

El presente EBOOK titulado

“Aspectos Generales de
microscopia óptica” en su volumen
01 es un material educativo que
tiene como propósito el poder
reforzar los conocimientos de los
estudiantes participantes del
Programa “CITOLOGIA PARA
PRINCIPIANTES” impartido bajo
modalidad a distancia. Es creado
por la Msc. Daiglys García CEO de
CITORUSHTC |Citotecnólogo Venezolana el día 17 de octubre de 2022,
con mi propio método de aprendizaje constructivista. Es importante
destacar que el presente material didáctico se realizó utilizando como
soporte la “Neurociencia Educativa” que sin lugar a dudas forma parte de
todo el ecosistema instruccional creado para fomentar un aprendizaje
idóneo en los estudiantes participantes del presente curso virtual.

Msc. Daiglys Carolina García Carreño

CEO|FUNDADORA CITORUSHTC
Lima, Perú 2022.

www.citorushtc.com
1. Fundamentos

Cuando la luz interacciona con un

determinado objeto cambia la relacion entre
las fases de las ondas que recibe,
produciéndose interacciones complejas.
Esto es lo que hace que dos puntos muy
juntos nos parezcan uno solo o que, a
través de un microscopio, lo que parecía
un único punto se separe en más.

Cuando un objeto se aleja de un observador, el ángulo visual bajo

el cual se ve disminuye con la distancia y el objeto parece más pequeño.
Por lo contrario, al acercarse crece el ángulo visual y el objeto aparenta
ser mayor. Existe un límite o distancia mínima de visión distinta, que
corresponde a la deformación máxima del cristalino del ojo. Esta distancia
es distinta según la rigidez del cristalino y se modifica de forma fisiológica
con la edad.

Si entre el ojo y el objeto a observar se dispone de un sistema óptico

capaz de aumentar el ángulo visual, aquel se verá con mayor claridad y
sin fatiga, permitiendo observar detalles perceptibles a simple vista. Si el
sistema óptico consiste en una lente convergente se denomina
microscopio simple o lupa; cuando el sistema está formado por una lente
objetivo y otra ocular tenemos el microscopio compuesto, denominado
simplemente microscopio.

Para definir un microscopio tendremos que conocer su capacidad de

amplificación, es decir su poder de resolución. El poder de resolución es
la capacidad del instrumento para dar imágenes distintas de dos puntos
situados muy cerca uno del otro en el objetivo. Depende de la longitud
de onda (inversamente proporcional. A menor longitud de onda mayor
poder de resolución), y de la apertura numérica del objetivo
(directamente proporcional).
El límite de resolución es la distancia mínima que debe existir entre dos
puntos, para que puedan ser discriminados como tales.

Límite de resolución: d¡

𝒅= 𝟎. 𝟓 𝝀 (𝒍𝒐𝒏𝒈𝒊𝒕𝒖𝒅 𝒅𝒆 𝒐𝒏𝒅𝒂)

𝑵 𝒔𝒆𝒏 𝜶 (𝒂𝒑𝒆𝒓𝒕𝒖𝒓𝒂 𝒏𝒖𝒎é𝒓𝒊𝒄𝒂)

λ = longitud de onda de la luz empleada.

α = mitad del ángulo de la lente objetivo.

N = índice de refracción del medio que hay entre la muestra y la superficie

frontal de la lente objetivo.

N sen α = apertura numérica.

Si el medio que hay entre la muestra y el objetivo es el aire , el

índice de refracción es 1. Aquí muchos rayos se pierden y no penetran en
el objetivo.

Si se pone aceite aumenta la apertura numérica, ya que la mayoría

de los rayos, debido a la refracción, van a penetrar en el objetivo. El índice
de refracción con aceite es de 1,4 y 1, 5.

2. Partes del microscopio

Los componentes básicos de un microscopio son:

Mandos de control del movimiento de la platina.

Tubo portaoculares binocular.

Divisor del rayo de alta transmisión.

Prisma ocular.

Oculares.
Revólver.

Objetivo.

Platina.

Diafragma de apertura.

Condensador.

Diafragma de campo.

Lente de campo.

Espejo de reflexión.

Base.

Lámpara halógena.

Lente colectora.

Difusor.

Mandos de enfoque macro y micro.

Fuente de radiación

Parte mecánica

Pie

Encargado de dar estabilidad al aparato. Es una pieza mecánica de gran

peso que sujeta el microscopio.

Columna

Sujeta al pie. De ella salen:

El tubo: que se desplaza a lo largo de la columna mediante un movimiento

rápido (tornillo macrométrico), a través de un mecanismo de cremallera
o mediante un movimiento lento mediante un tornillo micrométrico. Hará
que se acerque o se aleje la lente a la muestra. Nos permitirá enfocar.

Elementos auxiliares: como la platina, que se utiliza para sujetar el

objetivo a analizar. Es una placa que tiene un orificio central de apertura
regulable mediante un diafragma. A partir de esta apertura se ilumina la
preparación.

También existe un dispositivo para conocer las coordinadas del punto que
estamos observando en un determinado momento, y así poder buscarlo
cuando se desee.

Parte óptica

Formada por un conjunto de lentes, los microscopios utilizan un

sistema de dos lentes convergentes fijadas al extremo de un tubo: una
próxima al ojo (ocular) y otra próxima al objetivo a analizar (objetivo).

Oculares

Son lentes que amplían la imagen de una manera constante, es decir, la

ampliación conseguida aumentará cuanta más distancia exista entre el
objetivo y el ocular. Los oculares suelen ser de 10 aumentos.

Objetivos

Son las lentes que se sitúan próximas a la preparación. Los

objetivos más utilizados suelen ser de 10x, 20x, 40x e incluso 100x. así,
si observamos un microorganismo con un microscopio que tiene un ocular
10x y un objetivo de 100x, estaríamos observándolo 1.000 veces
aumentado. Hay dos tipos de objetivos:

Secos: el objetivo y la preparación están separados por aire.

De inmersión: el objetivo y la preparación están separados por un líquido

de mayor índice de refracción que el aire (aceite de cedro, agua, glicerina,
etc).

El aumento que produce se indica por: 10x, 45x, 60x, 100x, etc.
Los objetivos se adaptan al tubo del microscopio mediante una pieza
adicional llamada revólver, que suele llevar tres o más objetivos
intercambiables.

Los distintos aumentos que podemos encontrar en los objetivos

están codificados por un anillo de color:

1x negro................................................................ 20x verde.

2x castaño………………………………………..40x, 50x azul claro.

4x, 5x rojo………………………………………. 60x azul

10x amarillo………………………………………100x.

Los objetivos de inmersión de aceite llevan una marca de

identificación que es un anillo negro. Los objetivos de fluorescencia, cuyo
líquido de inmersión es glicerina van marcados con un anillo anaranjado.

Condensador

Es el encargado de concentrar un haz luminoso en cada punto del

portaobjetos. Suelen llevar acoplado una serie de filtros y el diafragma,
para controlar la luz que incide sobre la preparación. Puede subirse y
bajarse, según el objetivo que se esté utilizando. Si se trabaja a grandes
aumentos conviene colocarlos lo más arriba posible y si se trabaja a
aumentos menores colocarlos más abajo.

3. Tipos de microscopios

De campo claro

Es el que hemos descrito hasta ahora. La apreciación de las distintas

partes de que consta el objeto observado se debe a la opacidad del
mismo. En ocasiones las muestras son transparentes que la disminución
de intensidad es casi inapreciable y además uniforme en toda la
preparación, siendo imposible verlo. Esto se soluciona con las tinciones
de los componentes mediante técnicas diferentes de coloración.

Cuando la tinción no es aconsejable, es posible utilizar métodos

para producir contraste, así surgen el microscopio de campo oscuro,
fluorescencia, polarización, contraste de fases, etc.
De campo oscuro

Igual anterior pero sustituyendo el condensador por otro

especialmente fabricado para hacer que la luz, en lugar de incidir
perpendicularmente sobre la preparación, lo haga de forma oblicua. Así
se consigue que solo la luz difractada penetre en el objetivo y, por tanto,
se observan los cambios de índice de refracción.

Si en toda la preparación no hay ninguna partícula con índice de

refracción diferente, todo se verá oscuro, pero si existen partículas como
bacterias aparecerán muy brillantes sobre fondo oscuro. Mediante este
tipo de microscopio no se obtienen datos morfológicos, sino que ayuda a
detectar la presencia de una determinada partícula, observar su
movilidad, etc.

De contraste de fases

En este tipo de microscopio se utiliza un condensador y objetivos

especiales. Una fracción de la luz que incide sobre el objeto lo hace
perpendicularmente sobre él, y otra parte sufre procesos de difracción.
Mediante un diafragma anular, situado delante del condensador, se
consigue que la luz trasmitida directamente y la que sufre procesos de
refracción penetren por separado a distinta fase, en el objetivo,
produciéndose interferencias, lo que hace que las distintas partes de la
preparación se observen con distinta intensidad, haciéndose
perfectamente visibles. Se resaltan detalles de la muestra a través de las
diferencias de fase en la luz que las atraviesa.

Se utilizan en el estudio de las estructuras interna de los

microorganismos.

De luz ultravioleta

La capacidad de resolución de un microscopio depende de la

longitud de onda de la radiación, consiguiéndose mejores resoluciones
cuanto menor sea I, lo que ocurre al utilizar fuentes de radiación UV. Pero
esta radiación es invisible para el ojo humano, por lo que debemos revelar
la imagen obtenida haciéndola incidir sobre unos detectores que luego la
transmitirán, por ejemplo, una placa fotográfica. Una de sus aplicaciones
es en la microscopia de fluorescencia.
De fluorescencia

El fenómeno de fluorescencia ocurre cuando las moléculas que

absorben a una longitud de onda emiten a una longitud de onda mayor.
La fluorescencia es proporcional a la intensidad de la radiación incidente.
Así, el microscopio de fluorescencia incorpora una lámpara de alta
intensidad y un filtro para UV. La luz incide sobre la preparación y si
existen sustancias fluorescentes, estas emitirán luz en el visible. Este tipo
de microscopio incorpora un filtro de excitación y un filtrode emisión.

Algunas sustancias fluorescentes frecuentemente empleadas en

microscopia son:

Auramina: coloración utilizada para teñir el bacilo tuberculoso. Al iluminar

con radiación UV, este compuesto presenta fluorescencia, detectando así
el bacilo.

Naranja de acridina. Actualmente se combinan sustancias fluorescentes

(fluoresceína, rodamina) con anticuerpos marcados para poder poner de
manifiesto determinados antígenos.

También se emplean antígenos marcados (detectaremos anticuerpos).

Polarizante

Detrás del condensador se coloca un polarizador para que la luz que incide
sobre la muestra esté polarizada en un plano determinado.

4. Mantenimiento correcto del mismo

Empleo del microscopio

1. Enfoque
2. Sentarse a la altura adecuada.
3. Para empezar, escogeremos el objetivo de menos aumento.
4. Se coloca la muestra en la platina centrándola. Si posee escasa
estructura intentaremos el enfoque en el borde del cubreobjetos.
 5. Encendemos la fuente de luz, graduando la intensidad de esta con
el condensador y el diafragma.
6. Bajaremos el tubo lentamente hasta la preparación, con cuidado de
no tocarla.
7. Acercamos el ojo al ocular y accionaremos el macrométrico muy
lentamente comenzando a subir el tubo hasta la aparición de una
imagen; si no apareciera nada volveríamos a repetir los dos últimos
pasos.
8. Ahora accionamos el micrométrico para el verdadero enfoque.
9. Se acciona el revólver para pasar de un objetivo a otro. Siempre de
menor a mayor enfoque.
10. Moviendo la platina se recorre toda la preparación.

Enfoque con objetivo de inmersión

1. Escoger la altura adecuada.

2. Escoger el objetivo; para empezar escogeremos un poco de
aumento.
3. Colocaremos la muestra en la platina y la centraremos. Si posee
escasa estructura, intentaremos el enfoque en el borde del
cubreobjetos.
4. Encender la fuente de luz, graduando la intensidad con el
condensador y el diafragma.
5. Colocar sobre la preparación una gota de aceite de inmersión
(cedro).
6. Situamos el objetivo de inmersión en contacto con la gota de aceite.
7. Situamos el ojo ocular y accionamos el macrométrico muy
lentamente, comenzando a subir el tubo hasta que aparezca una
imagen. Siempre el objetivo debe estar en contacto con la gota de
aceite.
8. Al aparecer la imagen, accionaremos el micrométrico para su
correcto enfoque.
9. Moviendo la platina observamos toda la preparación.
Limpieza de las partes ópticas

Si el campo observado aparece turbio o presenta manchitas puede

ser por lo siguiente:

 El portaobjetos de la preparación puede estar sucio.

 El objetivo puede estar lleno de aceite, para ello lo limpiaremos
cuidadosamente con un papel especial. No es muy recomendable el
uso seguido de disolventes como el xilol, ya que puede destruir el
cemento que fija la lente a la montura. De todas formas, se emplea
cuando el objetivo de inmersión está muy sucio.
 Los oculares pueden estar sucios.
 La lente superior del condensador puede estar sucia. Si la turbiedad
o las manchas se mueven al hacer girar el ocular, el problema reside
en este. Puede limpiarse soplando sobre ellas y puliéndola muy
suavemente con papel especial para lentes. Sin embargo, a menudo
quedan manchas de suciedad y deben eliminarse con un chorro de
aire seco.

Artefactos técnicos que impiden o dificultan el diagnóstico

Se denominan artefactos de la técnica a las alteraciones del

extendido ocasionadas durante el procesado y que ofrecen imágenes no
habituales y reproducibles. Los artefactos que se encuentran con mayor
frecuencia son:

1. Filamentos aislados de cromatina, vacuolización nuclear y restos

citoplasmáticos. Proceden de aplastamiento y dislaceración de
elementos celulares durante el procesado.
2. Alternancia de zonas bien conservadas con otras células pálidas o
pseudoeonofílicas. Muestran modificaciones irreales en la relación
N/C y variaciones en el volumen y la coloración de los núcleos.
Generalmente se debe a un excesivo aplastamiento de la muestra.
3. Aparición de manchas de color pardo con forma reticulada. Se debe
a un fallo de fijación.
4. Esférulas azules. Suelen aparecer en muestras de citología
ginecológica asociadas a Trichomonas y como resultado de una
mala filtración de hematoxilina.
 5. Presencia de pseudonúcleos. Se observan en extendidos atróficos e
inflamatorios. Puede corresponder a moco y a material cromatínico
espesado.
6. Polvo dorado. Partículas de color amarillo, marrón o negro que
simulan alteraciones del citoplasma o del núcleo. Se trata de
inclusiones de aire por desecación del extendido antes de aplicar el
medio de montaje.
7. Gotas líquidas. Son el resultado de la mezcla de xileno y agua.

Estoy muy contenta de compartir esta información con mis citolovers.

¡Sigamos aprendiendo juntos!

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