Aislamiento y caracterización de antioxidantes y compuestos

antibacterianos del jengibre de mango (Curcuma amada Roxb.)

rizoma

Resumen

El extracto clorofórmico del rizoma de mango jengibre (Curcuma amada Roxb.) Se sometió
a purificación guiada por actividad antioxidante mediante cromatografía en columna de
gel de sílice repetida para obtener un compuesto antioxidante puro. La estructura se
dedujo analizando los datos espectrales de RMN de cromatografía líquida-espectrometría
de masas (LC-MS) y heteronuclear de dos dimensiones heteronucleares de transferencia
de coherencia cuántica múltiple (2D-HMQCT), y se denominó "Amadannulen", un
compuesto novedoso. Exhibió actividad de eliminación de radicales DPPH, actividad de
eliminación de radicales de superóxido, actividad inhibidora de la peroxidación de lípidos y
actividad quelante de metales. Amadannulen también mostró actividad antibacteriana
contra bacterias Gram-positivas y Gram-negativas probadas. También exhibió actividad
bactericida contra M. luteus, B. cereus y B. subtilis. © 2007 Elsevier B.V. Todos los
derechos reservados.

Palabras llave: Curcuma amada; Jengibre de mango; Rizoma; Actividad antioxidante;

Actividad antibacterial; Amadannulen

1. Introducción

Se sabe que las frutas, verduras y especias contienen componentes que promueven la
salud, como vitaminas, minerales, antioxidantes y prebióticos [1]. Existe un interés
renovado en los compuestos bioactivos de frutas, verduras y especias. En particular, las
especias se utilizan en los alimentos porque imparten sabores deseables y pueden cumplir
más de una función a la que se añaden [2]. Se está llevando a cabo una amplia
investigación sobre la medicina tradicional, frente a diferentes especies de plantas y sus
principios terapéuticos en todo el mundo. La evidencia experimental sugiere que los
radicales libres y las especies reactivas de oxígeno (ROS) han estado implicados en más de
100 enfermedades, incluyendo malaria, síndrome de inmunodeficiencia adquirida,
enfermedades cardíacas, ictus, arteriosclerosis, diabetes, cáncer y úlcera gástrica [3-5].
Los antioxidantes pueden proteger al cuerpo humano de los radicales libres y los efectos
de las ROS y retrasar el progreso de muchas enfermedades crónicas, así como la rancidez
oxidativa de los lípidos en los alimentos [6-8]. Sin embargo, se sospecha que BHA y BHT,
los antioxidantes más utilizados en la actualidad, son responsables del daño hepático y la
carcinogénesis [9,10]. Por lo tanto, se desea la exploración y utilización de antioxidantes y
compuestos antibacterianos más efectivos de fuentes naturales. Como las plantas
producen una gran cantidad de antioxidantes para controlar el estrés oxidativo,
representan una fuente natural de actividad antioxidante y antibacteriana, que se puede
observar en frutas, verduras, raíces, hojas y semillas [11]. En comparación con la plétora
de sustancias sintéticas, los productos naturales ofrecen la posibilidad de descubrir un
mayor número de compuestos, con estructuras estéricamente más complejas [12,13].

El género Curcuma (familia Zingiberaceae) comprende más de 80 especies de hierbas

rizomatosas. El género se origina en la región indo-malaya y se distribuye ampliamente
desde los trópicos de Asia hasta África y Australia [14]. El jengibre de mango (Curcuma
amada Roxb.) Es una especia única, que morfológicamente se asemeja al jengibre
(Zingiber officinale) pero le da sabor a mango (Mangifera indica). El sabor del mango se
atribuye principalmente al car-3-eno y al cis-ocimeno [15,16]. El rizoma de mango y
jengibre se utiliza con fines terapéuticos y en la fabricación de encurtidos, como fuente de
sabor a mango crudo. El Ayurveda, el sistema de medicina más antiguo de la India, ha
destacado la importancia de este rizoma como aperitivo, alexterico, antipirético,
afrodisíaco y laxante. También se utiliza en casos de bilis, prurito, enfermedades de la piel,
bronquitis, asma, hipo e inflamación debida a lesiones [17-19].

Según el sistema de medicina Unani, es diurético, madurante, emoliente, expectorante,

antipirético y aperitivo. También es útil contra la inflamación de la boca, el oído y el gleet,
úlceras en los órganos sexuales masculinos, sarna, lumbago y estomatitis [18-20]. Se ha
informado que el extracto de mango y jengibre inhibe la enzima tripsina [21]. Se ha
informado que induce actividad hipertrigliceridémica en ratas hiperlipidémicas inducidas
por Triton [22,23]. El extracto de alcohol etílico de mango jengibre se compone de
compuestos químicos con grupos funcionales hidroxilo, éster, carbonilo y olefina. Se
encontró que eran responsables de la actividad antiinflamatoria del extracto en la
administración aguda y crónica en ratas albinas [24]. A pesar de las propiedades
medicinales y los usos terapéuticos del jengibre de mango, no hay informes sobre
moléculas bioactivas. El presente estudio propuso investigar el potencial antioxidante del
rizoma de mango jengibre y el aislamiento y caracterización del compuesto antioxidante.

2. Material y métodos

2.1. Material vegetal

Se adquirieron rizomas frescos y saludables de mango y jengibre (C. amada Roxb.) En el

mercado local, Mysore, India, durante diciembre de 2004. Los rizomas se lavaron,
cortaron y secaron en un horno de aire caliente a 50 ◦C durante 72 horas y se pulverizaron
hasta 60 mallas en una amoladora de ápice (Apex Constructions, Londres).

2.2. Quimicos

Todos los productos químicos utilizados para la cromatografía en columna eran de Merck
Limited, Mumbai, India. El metanol de grado HPLC se adquirió de Ranbaxy Fine Chemicals
Limited, Mumbai, India. El gel de sílice (malla 60-120) se adquirió en Qualigens Fine
Chemicals, Mumbai, India; El gel de sílice (100-200) se adquirió de Loba Chemie Pvt. Ltd.,
Mumbai, India. El gel de sílice se adquirió en Glaxo Laboratories, Mumbai, India. El 1,1-
difenil-2-picril-hidrazilo (DPPH), el dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADH), BHA y
ácido tricloroacético (TCA) se adquirieron de Sigma (Sigma-Aldrich GmbH, Sternheim,
Alemania). El ferricianuro de potasio, el ácido 3- (2-piridil) - 5,6-bis (4-fenil sulfónico)
-1,2,4-triazina (ferrozina) y el cloruro férrico se adquirieron en M / s Sisco Research
Laboratories, Mumbai, India. , tetrazolio azul nitro (NBT), metosulfato de fenazina (PMS),
ácido tiobarbitúrico (TBA) y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) se adquirieron de M /
s Sigma Chemicals Co. (St. Louis, MO). El agar nutritivo y el caldo nutritivo fueron de
HiMedia Laboratories Limited, Mumbai, India. Todos los demás reactivos fueron de grado
analítico y los demás productos químicos utilizados en este estudio fueron de la más alta
pureza.

2.3. Cepas bacterianas y preparación de inóculo

La actividad antibacteriana se probó contra Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli,

Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Proteus mirabilis,
Yersinia enterocolitica, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Enterococcus fecalis,
Bacillus subtilistocygenes. Las cepas bacterianas anteriores aisladas de muestras clínicas
se obtuvieron del Departamento de Microbiología, Mysore Medical College, Mysore,
India. Sus características culturales y morfológicas se confirmaron y también se
sometieron a pruebas bioquímicas estándar antes de la experimentación [25, 26]. Los
organismos de prueba se mantuvieron en agar nutritivo inclinado.

2.4. Aislamiento de compuestos bioactivos de cloroformo.

extraer

2.4.1. Preparación de extractos

Aproximadamente 100 g de polvo de mango y jengibre seco se desgrasaron usando n-

hexano, seguido de cloroformo a temperatura ambiente (27 ◦C) y a presión atmosférica,
durante 48 h agitando a una velocidad de 100 rpm / min. Los extractos se filtraron y
concentraron usando un evaporador rotatorio (Buchi Rotavapor R-124). Los extractos
concentrados se liofilizaron y se almacenaron en frigorífico. La prometedora actividad
antioxidante del extracto de cloroformo nos impulsó a aislar y purificar su compuesto
antioxidante.

2.4.2. Fraccionamiento del extracto de cloroformo

Se empaquetó gel de sílice activado (malla 60-120) en una columna de vidrio (450 mm x
40 mm) usando disolvente n-hexano y se cargaron 15 g de extracto de cloroformo crudo
en la parte superior del gel de sílice. La columna se eluyó por etapas con 500 ml de
hexano, 2000 ml de hexano: cloroformo (75:25 a 0: 100, v / v), 2000 ml de cloroformo:
acetato de etilo (75:25 a 0: 100, v / v), 2000 ml de acetato de etilo: acetona (75:25 a 0:
100, v / v) y 1500 ml de acetona: metanol (75:25 a 0: 100, v / v). Se recogieron
aproximadamente 82 fracciones que medían 100 ml cada una y se concentraron usando
un evaporador rotatorio.

2.4.3. Cromatografía de capa fina (TLC)

Se cargó una alícuota de todas las fracciones concentradas en las placas de TLC de gel de
sílice activada (20 cm x 20 cm). Las placas se revelaron usando disolventes de hexano:
cloroformo (80:20), cloroformo: acetato de etilo (90:10) y acetato de etilo: metanol
(90:10). Las manchas se localizaron exponiendo la placa a vapores de yodo. Se reunieron
las fracciones que tenían el mismo número de manchas con valores de Rf similares en la
placa de TLC. Las fracciones agrupadas se numeraron (Fr.1-Fr.5). Todas las cinco fracciones
combinadas se probaron para determinar la actividad antioxidante.

2.4.4. Mayor purificación de la fracción bioactiva

Dado que la fracción cinco (Fr.5) obtenida de la cromatografía en columna del primer paso
(Fig. 1) mostró una alta actividad antioxidante, se seleccionó para una purificación
adicional. Aproximadamente 2,1 g de la fracción bioactiva cinco (Fr.5) se purificaron
adicionalmente usando una columna de gel de sílice (malla 60-120) (450 mm x 20 mm). La
columna se eluyó paso a paso con 100 ml de hexano, 200 ml de hexano: cloroformo
(90:10 a 0: 100, v / v), 500 ml de cloroformo: acetato de etilo (90:10 a 0: 100, v / v), 1000
ml de acetato de etilo: acetona (90:10 a 0: 100, v / v) y 1000 ml de acetona: metanol
(90:10 a 0: 100, v / v). Se recogieron veintiocho fracciones de 100 ml cada una y se
concentraron en un rotavapor. Se cargó una alícuota de todas las fracciones en la placa de
TLC. Las fracciones que tenían el mismo número de manchas con valores de Rf similares se
agruparon y numeraron (Fr.1-Fr.4). Estas cuatro fracciones se probaron para determinar la
actividad antioxidante. La fracción cuatro (Fr.4) obtenida de la cromatografía de segundo
paso (Fig. 1) mostró una alta actividad antioxidante, por lo que se seleccionó para una
purificación adicional. Aproximadamente 520 mg de la fracción bioactiva cuatro (Fr.4) se
purificaron adicionalmente en una columna de gel de sílice (malla 100-200) (600 mm x 15
mm). La columna se eluyó por etapas con 100 ml de hexano: cloroformo (90:10 a 0: 100,
v / v), 100 ml de cloroformo: acetato de etilo (95:05 a 0: 100, v / v), 500 ml de acetato de
etilo: acetona (90:05 a 0: 100, v / v) y 500 ml de acetona: metanol (95:05 a 0: 100, v / v).
Se recogieron y concentraron aproximadamente 23 fracciones de 50 ml cada una. Las
fracciones que tenían el mismo número de manchas con valores de Rf similares en la placa
de TLC se agruparon y numeraron (Fr.1-Fr.3). Entre estos, la fracción número dos (Fr.2)
obtenida de la cromatografía de tercer paso (Fig. 1) mostró una única mancha en el perfil
de TLC. Este compuesto puro se sometió a diversas técnicas espectroscópicas para
elucidar la estructura.
FIG 1. Representación esquemática de la extracción y aislamiento del compuesto antioxidante del extracto clorofórmico
de mango jengibre mediante cromatografía en columna. Rendimientos de extracto de hexano y cloroformo (g / 100 g de
polvo seco).

2.4.5. Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

La fracción purificada se probó para determinar su pureza usando HPLC, usando

cromatógrafo de líquidos LC 10AT (Shimadzu, Singapur) equipado con columna C 18 (300
mm × 4,6 mm 5 Thermo Hypersil) y acetonitrilo: agua (60:40) como fase móvil con un
caudal de 1 ml / min. Se utilizó una matriz de diodos (Shimadzu, Singapur) como detector.
2.5. Identificación de compuesto bioactivo

2.5.1. Espectrofotometría UV-vis

El espectro UV-vis del compuesto bioactivo aislado se registró en un instrumento

Shimadzu UV-160A (Shimadzu, Singapur) a temperatura ambiente. Se utilizó
aproximadamente 1 mg de compuesto aislado disuelto en 20 ml de cloroformo para
registrar el espectro. La región de 200 a 800 nm se utilizó para la exploración.

2.5.2. Espectrometría de infrarrojos

El espectro IR del compuesto bioactivo aislado se registró en un espectrómetro Perkin-

Elmer FT-IR (Spectrum 2000) a temperatura ambiente. Se utilizó una región de 400 a 4000
cm − 1 para el escaneo.

2.5.3. Cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC – MS)

El espectro de masas del compuesto bioactivo aislado se registró en el instrumento HP

1100 MSD series (Palo Alto, CA) mediante la técnica de ionización por electropulverización
(ESI) con un caudal de 0,2 mL / min en una columna C-18 (300 mm × 4,6 mm 5 Thermo
Hypersil). La fase móvil fue acetonitrilo: agua (60:40) con un tiempo de ejecución total de
25 min. Se utilizó una matriz de diodos (Shimadzu, Singapur) como detector. Se utilizó
aproximadamente 1 mg de compuesto aislado disuelto en 10 mL de metanol para
registrar el espectro. La temperatura de la columna se mantuvo a temperatura ambiente.

2.5.4. Espectroscopía de transferencia de coherencia cuántica múltiple heteronuclear

bidimensional (2D-HMQCT) Espectros de RMN

Los espectros de RMN se registraron en un instrumento de RMN Bruker (Rheinstetten,

Alemania) DRX 500 que funcionaba a 500 MHz para 1H y 125 MHz para 13C a temperatura
ambiente. Para el escaneo se empleó una región de 0 a 20 ppm para 1H y de 0 a 200 ppm
para 13C. Las señales se refirieron al patrón interno de tetrametilsilano. Se utilizaron
aproximadamente 45 mg de compuesto bioactivo aislado disuelto en CdCl 3 para registrar
los espectros.

2.6. Actividad antioxidante

2.6.1. Actividad captadora de radicales libres DPPH

La actividad de captación de radicales 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo se determinó de

acuerdo con el método descrito anteriormente [27-29]. Las muestras de prueba (10-100 l)
se mezclaron con 0,8 ml de tampón Tris-HCl (pH 7,4) al que se añadió 1 ml de DPPH (500
M en etanol). La mezcla se agitó vigorosamente y se dejó reposar durante 30 min. La
absorbancia de la solución resultante se midió a 517 nm en un espectrofotómetro UV-vis
(UV-160A, Shimadzu Co., Japón). La actividad de eliminación de radicales se midió como
una disminución en la absorbancia de DPPH. Una menor absorbancia de la mezcla de
reacción indicó una mayor actividad de eliminación de radicales libres. El potencial de
eliminación de radicales se expresó como valor de CE50, que representa la concentración
de la muestra a la que se eliminó el 50% de los radicales DPPH.

La capacidad de eliminación de superóxidos se evaluó de acuerdo con el método de

Nishikimi, et al. [30] con ligeras modificaciones. La mezcla de reacción contenía NBT (0,1
mM) y NADH (0,1 mM) con o sin muestra para analizar en un volumen total de 1 ml de
tampón Tris-HCl (0,02 M, pH 8,3). La reacción se inició añadiendo PMS (10 M) a la mezcla y
se registró el cambio en la absorbancia a 560 nm cada 30 s durante 2 min. El porcentaje de
inhibición se calculó frente a un control sin muestra de prueba. El potencial de eliminación
de radicales se expresó como valor de CE50, que representa la concentración de la
muestra a la que se eliminó el 50% de los radicales.

2.6.3. Actividad inhibidora de la peroxidación lipídica

La actividad inhibidora de la peroxidación lipídica se determinó de acuerdo con el método

descrito anteriormente [31]. En resumen, se sonicó lecitina de huevo (3 mg / ml de
tampón fosfato, pH 7,4) en dr. Hielscher GmbH, UP 50H ultraschallprozessor (DrHielscher
GmbH, Teltow, Berlín, Alemania). Las muestras de prueba (100 l) se añadieron a 1 ml de
mezcla de liposomas, el control estaba sin muestra de prueba. Se indujo la peroxidación
lipídica añadiendo 10 l de FeCl3 (400 mM) y 10 l de ácido l-ascórbico (400 mM). Después
de la incubación durante 1 ha 37 ◦C, la reacción se detuvo agregando 2 ml de HCl 0.25 N
que contenía TCA al 15% y TBA al 0.375% y la mezcla de reacción se hirvió durante 15 min,
luego se enfrió, centrifugó y se midió la absorbancia del sobrenadante. a 532 nm. La
actividad inhibidora se expresó como valor EC50, que es la concentración de la muestra
inhibida al 50% de la peroxidación lipídica.

2.6.4. Actividad quelante de metales

La quelación de iones ferrosos por la muestra de prueba se estimó mediante el método

descrito anteriormente [32,33]. Brevemente, las muestras de prueba a diferentes
concentraciones se añadieron a una solución de FeCl2 2 mM (0,05 ml). La reacción se
inició mediante la adición de ferrozina 5 mM (0,2 ml) y la mezcla se agitó vigorosamente y
se dejó reposar a temperatura ambiente durante 10 min. Una vez que la mezcla alcanzó el
equilibrio, se leyó la absorbancia de la mezcla a 562 nm frente a un blanco. Se utilizó EDTA
como control positivo. Los resultados se expresaron como valor EC50, que representa la
concentración de la muestra a la que se produjo el 50% de la quelación de metales.

2.6.5. Poder reductor total

El poder reductor se cuantificó mediante el método descrito anteriormente por Yen y

Chen [34] con modificaciones menores. La mezcla de reacción, que contiene muestras de
prueba a diferentes concentraciones (10-100 l) en tampón fosfato (0,2 M, pH 6,6), se
incubó con ferricianuro de potasio (1%, p / v) a 50 ◦C durante 20 min. La reacción se
terminó mediante la adición de una solución de TCA (10%, p / v) y la mezcla se centrifugó
a 3000 rpm durante 20 min. El sobrenadante se mezcló con agua destilada y una solución
de cloruro férrico (0,1%, p / v) y se midió la absorbancia a 700 nm. El aumento de la
absorbancia de la mezcla de reacción indicó un aumento del poder reductor.

2.7. Actividad antibacterial

2.7.1. Concentración mínima inhibitoria (MIC)

La concentración mínima inhibitoria se determinó según el método descrito por Jones et

al. [35]. Se colocaron asépticamente diferentes concentraciones (20-300 ppm) del
compuesto aislado y 100 l de la suspensión bacteriana (105 UFC / ml) en 10 ml de caldo
nutritivo por separado y se incubaron durante 24 ha 37 ◦C. El crecimiento se observó
tanto visualmente como midiendo el diámetro exterior. a 600 nm a intervalos regulares
seguido de vertido enchapado. La siembra se llevó a cabo transfiriendo la suspensión
bacteriana (105 UFC / ml) a una placa de Petri estéril y se mezcló con medio de agar
nutriente fundido (HiMedia Laboratories Limited, Mumbai, India) y se dejó solidificar. La
concentración más baja de la muestra de ensayo que no mostró crecimiento visible se
registró como la concentración inhibitoria mínima. Se mantuvieron conjuntos de tubos
por triplicado para cada concentración de muestra de prueba. Se utilizó amoxicilina (100
g / ml) como control positivo.

2.7.2. Determinación de la concentración bactericida mínima (MBC)

La concentración bactericida mínima se determinó según el método de Smith-Palmer et al.

[36]. Se inocularon tubos de ensayo que contenían caldo nutritivo con diferentes
concentraciones de compuesto aislado con 100 l de la suspensión bacteriana (105 UFC /
ml). Los tubos inoculados se incubaron durante 24 ha 37 ◦C y se observó el crecimiento
tanto visualmente como midiendo el D.O. a 600 nm. Aproximadamente 100 l de los tubos
que no mostraban crecimiento se sembraron en agar nutritivo como se describe
anteriormente. Se mantuvieron conjuntos de tubos por triplicado para cada concentración
de muestra de prueba. La concentración bactericida mínima es la concentración a la que
las bacterias no crecieron en caldo nutritivo y agar nutritivo inoculado con 100 l de
suspensión.

2.8. análisis estadístico

Los experimentos se realizaron por triplicado. Las diferencias significativas (P <0,05) se

determinaron mediante la prueba de rango múltiple de Duncan (DMRT).

3. Resultados y discusión
3.1. Aislamiento de compuestos bioactivos

La extracción de 100 g de mango y jengibre en polvo usando solventes hexano y

cloroformo rindió 11 y 8 g de extracto, respectivamente (Fig. 1). El extracto de cloroformo
exhibió una actividad inhibidora de la peroxidación de lípidos prometedora y una actividad
quelante de metales moderada (Tabla 1). Por lo tanto, fue seleccionado para el
aislamiento del compuesto bioactivo responsable de la actividad antioxidante. La
cromatografía en columna de gel de sílice del extracto de cloroformo bruto produjo cinco
fracciones (Fr.1 Fr.5). Entre estos, la quinta fracción (Fr.5) mostró una actividad de
eliminación de DPPH del 68%, a saber, las fracciones restantes. Fr.1, Fr.2, Fr.3 y Fr.4
mostraron una actividad de eliminación de DPPH del 18, 22, 25 y 36% (a 2 mg / ml),
respectivamente (Fig. 2). La purificación adicional de la quinta fracción (Fr.5) produjo
cuatro fracciones (Fr.1-Fr.4), en donde la cuarta fracción (Fr.4) exhibió una alta actividad
de eliminación de DPPH (64%), mientras que Fr.1, Fr. 2 años Fr.3 alimentación 22, 26 y
38%, respectivamente (a 2 mg / ml) (Fig. 3). La fracción cuatro (Fr.4) se purificó
adicionalmente mediante cromatografía en columna de gel de sílice (malla 100-200) y
produjo tres fracciones (Fr.1-Fr.3). Entre estos, la fracción dos (Fr.2) mostró una alta
actividad de eliminación de DPPH (52%), mientras que Fr.1 y Fr.3 exhibieron 38 y 36% de
actividad de eliminación de radicales de DPPH, respectivamente (a 2 mg / ml) (Figura 4).
La segunda fracción (Fr.2) mostró una única mancha en TLC. La pureza del compuesto
aislado se confirma mediante HPLC. El amadannulen mostró un solo pico a 240 nm con un
tiempo de retención de 3,3 min en el cromatograma de HPLC (Fig.5). La representación
esquemática para el aislamiento del compuesto antioxidante se da en la Fig. 1. El
compuesto aislado se sometió a un análisis espectroscópico para dilucidar la estructura.

Tabla 1 * Cada valor representa la media de tres observaciones diferentes ± S.D. Los valores medios con diferentes letras
en superíndice (a – c) difieren significativamente en P <0.05. n No detectado.

3.2. Identificación de compuesto bioactivo

La estructura del compuesto bioactivo se dilucidó después de analizar los datos obtenidos
mediante diversas técnicas espectroscópicas. El peso molecular se determinó mediante LC
– MS. El espectro de masas mostró el ion molecular de origen m/z a 377. El análisis
elemental (VARIO EL III CHNS Elementar) reveló que el compuesto consta de 74,22% de
carbono y 10,10% de hidrógeno. Se encontró que la fórmula molecular del compuesto era
C24H40O3. Los máximos de UV (Fig. 6) observados a 242 nm indicaron la presencia de un
doble enlace. La identificación de grupos funcionales específicos se llevó a cabo mediante
espectros de IR (Fig. 7). El estiramiento O – H observado a 3403 cm − 1 es la característica
del grupo OH unido por hidrógeno. El estiramiento a 2996 y 1657 cm − 1 se puede atribuir
a las vibraciones de estiramiento C – H y C O, respectivamente. Se ha observado la
vibración de flexión del alquilo C – H a 1427 cm − 1. La vibración de estiramiento C – O a
1202 cm − 1 indica la presencia de un resto éster.

Fig. 2. Actividad captadora de radicales de DPPHa de cinco fraccionesb (Fr.1-Fr.5) obtenidas del extracto
clorofórmico. aCada valor representa la media de tres observaciones diferentes a una concentración de 2 mg
/ ml. bSe obtuvieron cinco fracciones (Fr.1-Fr.5) del extracto de cloroformo mediante cromatografía en
columna de gel de sílice.

Fig. 3. Actividad de captación de radicales de DPPHa de cuatro fraccionesb (Fr.1 -Fr.4) obtenida por
purificación adicional de la fracción activa cinco (Fr.5). aCada valor representa la media de tres
observaciones diferentes a una concentración de 2 mg / ml. b La fracción activa cinco (Fr.5) de la primera
etapa cromatográfica se purificó adicionalmente y cuatro fracciones (Fr.1-Fr.4) obtenidas se analizaron para
determinar la actividad de eliminación de DPPH.

Fig. 4. Actividad de eliminación de radicales de DPPHa de tres fraccionesb (Fr.1 Fr.3) obtenida mediante
purificación adicional de la fracción activa cuatro (Fr.4). aCada valor representa la media de tres
observaciones diferentes a una concentración de 2 mg / ml. b La fracción activa cuatro (Fr.4) del segundo
paso cromatográfico se purificó adicionalmente en una columna de gel de sílice y se analizaron tres
fracciones (Fr.1-Fr.3) obtenidas para determinar la actividad de eliminación de DPPH.

Fig. 5. Cromatograma de amadannulen aislado.

Fig. 6. Espectro UV de amadannulen aislado.

Fig. 7. Espectro FT-IR de amadannulen aislado.

Se registró un espectro de RMN de transferencia de coherencia cuántica múltiple

heteronuclear bidimensional (Fig. 8) junto con espectros de RMN de 1H y 13C
unidimensionales, que dieron una indicación clara del esqueleto de carbono del
compuesto (Tabla 2). No se detectaron picos para el resto aromático tanto en los
espectros de RMN de 1H como de 13C. Los protones –CH3 mostraron picos en la región de
0,8 a 0,9 ppm. Hay tres grupos –CH3 y los picos correspondientes de 13C se detectaron
entre 14 y 20 ppm. Los protones cíclicos –CH2 y –CH exhibieron picos en el rango de 1.2–
1.7 ppm y los correspondientes picos de 13C se han observado entre 21 y 34 ppm. Los
cuatro protones CH2 del anillo ciclopentilo mostraron un doblete a 2,1 ppm, lo que indica
claramente que ambos grupos –CH2 están unidos al carbono –CH. El grupo –CH unido al
resto –OH mostró un pico de 1H a 3.8 ppm y el pico correspondiente de 13C a 58 ppm. El
cuarteto a 4,15 ppm exhibido por el grupo etil –CH2 indica que se ha unido al grupo –CH3.
Se ha observado el pico de 13C correspondiente a 60 ppm. Además, las señales de 13C a
178 y 133 ppm confirman claramente la presencia de grupos –CO y C C. Con base en estos
datos espectrales, se dedujo la estructura probable del compuesto (Fig. 9) y se le nombró
provisionalmente como "amadannulen". El compuesto ha sido reportado por primera vez
a partir del rizoma de mango y jengibre. Se han informado tipos de compuestos bioactivos
estructuralmente similares de Euphorbia semiperfoliata [37], Mikania micrantha [38],
Neurolaena oaxacana [39], Elephantopus tomentosus [40] y corales gorgonias [41]. La
conformación del anillo de 10 miembros en este tipo de compuestos ha sido definida por
los ángulos de torsión endocíclicos en informes anteriores [42].

Fig. 8. Espectro de RMN 2D-HMQCT de amadannulen aislado.

3.3. Actividades antioxidantes del extracto de cloroformo y compuesto aislado

Se probaron varios ensayos antioxidantes como la actividad de eliminación de radicales

DPPH, la actividad de eliminación de radicales de superóxido, la actividad inhibidora de la
peroxidación de lípidos, la actividad quelante de metales y el poder reductor total de
amadannulen, extracto de cloroformo para evaluar su actividad antioxidante. Se utilizó
BHA como estándar para el ensayo de antioxidantes.

3.3.1. Actividad captadora de radicales DPPH

El modelo de eliminación del radical DPPH estable es un método ampliamente utilizado

para evaluar las actividades antioxidantes en un tiempo relativamente corto en
comparación con otros métodos. El amadannulen mostró una actividad moderada (EC50 =
178 g / ml) en comparación con BHA (EC50 = 5 g / ml) (Tabla 1). Curiosamente, no se
observó actividad en el extracto de cloroformo. Se observó un aumento lineal en la
capacidad de captación de radicales libres del amadannulen con su concentración
creciente. La captación de radicales DPPH por los antioxidantes se ha atribuido a su
capacidad de donar hidrógeno de los grupos –OH y –CH3 [43, 44].

3.3.2. Actividad de eliminación de superóxidos

El amadannulen mostró una actividad significativa con una CE50 de 132 g / ml en

comparación con BHA (CE50 de 258 g / ml). El extracto de cloroformo no mostró actividad
captadora de radicales superóxido (Tabla 1). El anión superóxido juega un papel
importante en la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) como el peróxido de
hidrógeno, el radical hidroxilo y el oxígeno singlete, que inducen daño oxidativo en lípidos,
proteínas y ADN [45-47].
3.3.3. Actividad inhibidora de la peroxidación lipídica

La peroxidación lipídica causa desestabilización y desintegración de la membrana celular,

lo que conduce a daño hepático, aterosclerosis, daño renal, envejecimiento y
susceptibilidad al cáncer [48]. La actividad inhibidora de la peroxidación de lípidos más
alta se observó en amadannulen con EC50 de 80 g / ml en comparación con el extracto de
cloroformo y BHA con EC50 de 65 y 94 g / ml, respectivamente (Tabla 1). La actividad
inhibidora de la peroxidación lipídica se atribuyó principalmente al número de grupos
hidroxilo, solubilidad e hidrofobicidad de los compuestos [49]. La presencia de grupos
metilo en amadannulen puede ser responsable de una alta actividad inhibidora de la
peroxidación lipídica.

3.3.4. Actividad quelante de metales

El amadannulen mostró actividad quelante de metales con EC50 de 216 g / ml en

comparación con el extracto de cloroformo con EC50 de 142 g / ml. Se informó que las
estructuras que contienen dos o más de los siguientes grupos funcionales: –OH, SH, –
COOH, –PO3H2, C = O, –NR2, S– y –O– en una configuración estructura-función favorable
es responsable de la actividad quelante de metales [50,51]. El amadannulen, que tiene
grupos funcionales OH y C O, puede contribuir a la actividad quelante de metales. Los
iones ferrosos pueden estimular la peroxidación de lípidos mediante la reacción de
Fenton, y también acelera la peroxidación al descomponer los hidroperóxidos de lípidos
en peroxilo y alcoxilo [3,52]. Dado que son el oxidante más eficaz en el sistema
alimentario [53], las altas capacidades quelantes del amadannulen y el extracto de
cloroformo serían beneficiosas.

Fig. 10. Poder reductor total de amadannulena, extracto de cloroformo y BHAc. a, la concentración de la
muestra de ensayo fue de 2 mg / ml. b La concentración de la muestra de ensayo fue de 1 mg / ml.
3.3.5. Poder reductor total

La capacidad reductora de un compuesto desde el complejo Fe3 + / ferricianuro hasta la

forma ferrosa puede servir como un indicador significativo de su capacidad antioxidante
[54]. La Fig. 10 muestra la capacidad reductora del amadannulen y el extracto de
cloroformo en comparación con el BHA. Se observó un aumento lineal del poder reductor
al aumentar la concentración de amadannulen. El extracto de cloroformo mostró un
poder reductor insignificante en comparación con el BHA.

3.4. Actividad antibacterial

3.4.1. Mínimo inhibitorio

La concentración de Amadannulen exhibió actividad antibacteriana contra bacterias

Gram-positivas y Gram-negativas. Fue más eficaz contra un amplio espectro de bacterias a
saber. P. aeruginosa, S. typhi, K. pneumoniae, E. aerogenes, Y. enterocolitica, M. luteus, S.
aureus, E. fecalis, B. cereus, B. subtilis y L. monocytogenes. El aumento más sorprendente
de la actividad se observó contra B. cereus, B. subtilis y M. luteus con MIC de 70, 60 y 100
ppm, respectivamente. También inhibió el crecimiento de cinco bacterias gramnegativas a
saber. P. aeruginosa, S. typhi, K. pneumoniae, E. aerogenes e Y. enterocolitica (Tabla 3).
Amadannulen mostró más actividad que el extracto de cloroformo (datos no mostrados).
3.5. Determinación del efecto bactericida

Se encontró que el amadannulen es bactericida contra M. luteus, B. cereus y B. subtilis

(Tabla 3) con una concentración bactericida mínima de 180, 120 y 130 ppm,
respectivamente. No mostró actividad bactericida contra otras cepas bacterianas
probadas incluso a concentraciones más altas. Amadannulen fue bacteriostático para la
mayoría de las cepas. Se están realizando investigaciones para probar el modo y el sitio de
acción del amadannulen.

4. Conclusión

Amadannulen fue aislado por extracción secuencial de rizoma de mango jengibre seguido
de fraccionamiento guiado por bioactividad con cromatografía en columna de gel de sílice
y caracterizado por diferentes análisis espectrales. Amadannulen es un compuesto
novedoso que no se informó anteriormente de ninguna otra fuente. Exhibió actividades
antioxidantes multisistémicas y también actividades antimicrobianas. La actividad
antioxidante del amadannulen incluye capacidad reductora, quelante de metales,
capacidad de donación de hidrógeno y eliminadores de radicales superóxidos. La actividad
bactericida del amadannulen contra las bacterias ensayadas es de gran importancia. Es
necesario aprovechar la actividad antioxidante y antibacteriana que muestra el
amadannulen.