Tinciones de laboratorio

Tinción de Gram
Tinción que nos permite diferenciar dos tipos de bacterias, gram positivas de las gram
negativas. Las gram positivas se teñirán de color violeta, estas bacterias tienen una pared de
peptidoglicano mas gruesa que las gram negativas las cuales se teñirán de color rosado.
Hay que recordar que menos, es más, no agregar tanta cantidad de bacteria y tinción.
1) Fijar bacteria en portaobjeto con una gota de agua destilada
2) Agregar cristal violeta por 1 minuto y lavar
3) Agregar Lugol por 1 minuto y lavar
4) Agrega decolorante, por 1 o 2 segundos y lavar inmediatamente
5) Agregar safranina por 30 segundos
6) Lavar y secar
7) Ver al microscopio, se agrega una gota de aceite de inmersión y se revisa la tinción.

Tinción Zihel-Nielsen
Es una tinción que permite ver si las bacterias son alcohol acido resistentes, las cuales son
bacilos que pertenecen al género Mycobacterium. Las bacterias acidorresistentes se verán
de color rosado fuerte, al retener la fucsina, ya que formarán un complejo con la pared de
las micobacterias, las bacterias que no resistente a la decoloración se verán de color azul,
por el colorante de contraste que es azul de metileno. Se pueden usar muestras como orina,
LCR, sangre, expectoración y otras.
1) Cubrir preparado con fucsina fenicada por 5 minutos, aplicando calor (flameando
por debajo del portaobjeto), hasta ver la emisión de vapores hasta 3 veces.
2) Eliminar colorante y lavar
3) Decolorar con alcohol-acido, lavar y decolorar nuevamente hasta quitar el exceso
de fucsina (3 minutos)
4) Cubrir con azul de metileno por 1 a 2 minutos, lavar y secar a t° ambiente.
5) Observar al microscopio con aceite de inmersión

Tinción de kinyoun
Se utiliza para ver bacterias alcohol resistentes. Los M.O se ven de color rojo en el fondo
de la preparación. No se flamea a diferencia de Zihel Nielsen
1) Fijar frotis al calor con fucsina fenicada por 3 minutos a temperatura ambiente y
lavar
2) Decolorar con solución acuosa de sulfhídrico al 1% y lavar
3) Cubrir con azul de metileno por 30 minutos
4) Lavar, secar y observar al microscopio con aceite de inmersión.
 Tinción de Hiss
Esta tinción nos permite ver capsulas de bacterias. Estas capsulas se observan
como halos azul pálido, mientras tanto la bacteria y el fondo se ven de un color azul oscuro
o color purpura.
1) Realizar suspendido de la bacteria en una gota de agua mas una gota de suero
sanguíneo, se deben dejar secar al aire y posteriormente con calor suave
2) Cubrir la preparación con cristal violeta en solución acuosa al 1%, calentar
suavemente por 1 minuto.
3) Lavar con solución acuosa de sulfato de cobre al 20%. El agua disuelve la capsula.
También podemos ver las capsulas observándolas al fresco con tinción negativa.
1) Suspender bacteria y agregar 1 gota de tinta china o nigrosina y cubrir con
cubreobjeto.
El colorante recubrirá las bacterias capsuladas sin teñirlas y se observaran como halos
incoloros sobre fondo negro.
Tinción de Gray de Leifson
Tinción que nos permite ver a la bacteria y sus flagelos. Se tiñen con métodos especiales,
usando mordientes como sustancias coloidales como el ácido tánico, que precipita
alrededor de la pared celular y flagelos, aumentando el diámetro de las bacterias. La bacteria
y sus flagelos se observarán de color rosado al microscopio.
1) Cubrir con mordiente que tenga alumbre de potasio, acido tánico y cloruro de
mercurio, por 10 minutos. Lavar con cuidado.
2) Cubrir por 5 a 10 minutos con fucsina básica o fenicada, lavar y secar

Tinción Dorner, Möeller, Shaeffer-Fulton/ Wirtz-Conklin

Técnica que nos permite ver esporas, las cuales se presentaran de color verde y los bacilos
de color rojo. Las endosporas de cultivos jóvenes no se tiñen, se ven incoloras muy claras,
se recomienda usar cultivos de 48 horas de incubación.
1) Realizar extendido fijando la bacteria
2) Cubrir con verde de malaquita al 5%
3) Calentar hasta desprender vapores y retirar, repetir entre 6 a 10 minutos y
lavar
4) Cubrir con safranina al 0,5% por 30 segundos.
5) Lavar, secar y observar al microscopio.
 Morfología bacteriana

Cocos
(esfericas)

Aisladas Diplococos Cadenas Racimos Tetradas

En forma de
maza

Redondeados
Cilindricos

Cuadrados
Bacilos
biselados
Fusiformes
Afilados

Espirilos

Vibrios
 Diagnóstico de laboratorio
En el laboratorio, se incorporan nutrientes en medios para permitir el crecimiento de
colonias bacterianas, causando que se multipliquen y se podrán visualizar de forma
macroscópica. (Incubar a condiciones óptimas 35.37° C).
Tenemos 2 tipos de siembra

• Cuantitativa: se realiza con asas calibradas, de 2, 3, 4, 5 mm.

• Semicuantitativa: Se realiza la inoculación con torula, no sabemos la cantidad de
bacterias que tenemos como muestra.
Para la identificación macroscópica tendremos algunos criterios, los cuales son:
- Tamaño de la colonia: punta, pequeñas, medianas o grandes
- Color: pigmentación de las colonias, amarilla, blanca, rosada, transparente, opaca,
brillante, etc. Podemos analizarlo con una torula.
- Forma de colonia: incluye forma (puntiforme, circular, filamentosa, rizoide,
fusiforme), elevación (plana, elevada, forma de gota, umbilicada, convexa) y margen
de la colonia (liso, ondulado, lobulado, filamentoso, algodonosa).
- Aspecto de superficie de colonia: brillante, opaco, seco, etc.
- Hemolisis

En cuanto a la hemolisis esta se ve en agar sangre, para observar este criterio debemos alzar
la placa contra una fuente de luz y ver que transmite.

• Alfa hemolítica: hemolisis parcial y la zona de crecimiento aparece rodeada de un

halo color verdoso.
• Beta hemolisis: destrucción total de los glóbulos rojos, el halo que rodea a las
colonias es totalmente transparente.
• Gamma: sin presencia de hemolisis, no hay reacción en el medio.
 Pruebas bioquímicas rápidas
Catalasa
La Catalasa es una enzima que descompone al peróxido de hidrogeno en agua y en
oxígeno. La mayor parte de las bacterias aerobias y anaerobias poseen actividad catalasa a
excepción de los estreptococos. La catalasa es similar a la hemoglobina, hay que tener
cuidado al tomar las bacterias evitando romper el agar sangre, o puede darnos un falso
positivo.
Control de calidad

• Positivo: Staphylococcus spp

• Negativo: Streptococcus spp
Procedimiento
1) En un portaobjeto agregar una gota de peróxido de hidrogeno al 3%, con una
pipeta o palillo de madera transferir una parte de la colonia sobre el peróxido de
hidrogeno y observar la formación de burbujas
Resultados

• Positivo: aspecto rápido de efervescencia y sostenido, es de forma inmediata

• Negativo: aparición de burbujas entre 20 a 30 segundos
Citocromo-c-oxidasa
Los citocromos son hemoproteínas que contienen hierro y actúan como último eslabón
en la cadena de respiración aerobia, transfiriendo electrones con la formación de agua. La
citocromo-c-oxidasa ocupa tinciones como la P-fenilendiamina diclorhidrato, que sustituye
al oxigeno como aceptor final. En presencia de citocromo-c-oxidasa y oxígeno, la p-
fenilendiamina se oxida y forma el color azul de indofenol.
Control de calidad

• Positivo: Pseudomona aeruginosa

• Negativo: E. Coli
Procedimiento (2 métodos)
1) Directo en placa, se agregan dos o tres gotas de reactivo directamente a colonias
bacterianas aisladas en el agar
2) Procedimiento en tiras de papel, se añaden unas gotas del reactivo en tira de papel
filtro o se usan discos comerciales, o tiras impregnadas con reactivos secos.
 Resultados

• Las colonias que presentan actividad citocromo-c-oxidasa desarrollan un color

azul intensos en el sitio de inoculación en un lapso de 10 segundos.
• Si produce el color después entre 10 a 60 segundos se considera negativo
• No ocupar asas o alambres de inoculación, ocasionan falsos positivos.

Oxidasa
Nos sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción de la oxidasa
se debe a la presencia de un sistema citocromo oxidasa, que activa la oxidación del
citocromo, el cual es reducido por el oxígeno molecular produciéndose agua o
peróxido de hidrogeno según la especie. Esta enzima no esta presente en bacterias
anaerobias estrictas. Se puede realizar en tira o en portaobjeto.

Test de susceptibilidad Kirby-Bauer

También es conocido como antibiograma, en disco o placa. Prueba que consiste en
depositar en la superficie de agar de una placa Petri previamente inoculada con el M.O,
discos de papel secante impregnados con los diferentes antibióticos.
1) Se coloca el disco impregnado de antibiótico en contacto con el agar.
2) Se incuba entre 18 a 24 horas y se observa el halo de inhibición
¿Cuándo se realiza un antibiograma?
Cuando una bacteria es responsable de un proceso infeccioso y no puede predecirse
su sensibilidad, especialmente si se sabe que la bacteria puede presentar resistencia a
los antimicrobianos.
Procedimiento
1) Preparación del inoculo:
- Método de medio de cultivo liquido que consiste en tomar unas colonias y
sembrarlas en 5 ml de liquido e incubar a 35°C por 5 a 6 horas hasta conseguir un
0.5 en la escala de MacFarland.
- Método suspensión directa de colonias: a partir de una placa incubaba entre 18 a
24 horas, coger varias colonias con un asa y ajustar el inoculo hasta generar una
turbidez al 0.5 de la escala de MacFarland en suero fisiológico.
2) Inoculación de las placas
- Con una torula introducirla en el inoculo y sacar una cantidad para sembrarla en el
agar Mueller Hinton, en 3 direcciones, repetir dos veces la inoculación (6 veces),
no hay que dejar ninguna zona libre de siembra.
 3) Dispensación de los discos
- Colocar los discos con los dispensadores o manualmente con pinzas,
para placas de 100 mm ocupar máximo 6 discos. Se deben incubar las placas
antes de transcurrir 15 minutos.
4) Lectura de los resultados
- Después de la incubación leer el diámetro de las zonas de completa inhibición
(donde no crecen las bacterias) con un pie de metro.
- Las zonas de los medios transparentes se miden por el reverso de la placa y en los
de agar sangre sobre la superficie.
- Cuando aparecen colonias dentro del halo de inhibición se puede deber a
contaminación, mutantes resistentes, cultivos mixtos, etc. Se recomienda repetir.

Interpretación de resultados
Sensible La infección causada por la cepa se puede tratar apropiadamente con la
> o igual a 20 mm dosis de antibiótico recomendada
Intermedio Incluye cepas que pueden ser inhibidas por concentraciones más elevadas
Entre 15-19 mm de antibióticos, siempre y cuando se pueda aumentar la dosis (ej.,
betalactámicos)
Resistente Las cepas no son inhibidas por concentraciones séricas normales alcanzadas
< o igual 14 mm a dosis habituales
No sensible Se usa para m.o que solo tienen interpretación sensible, debido a ausencia o
rara aparición de cepas resistentes

• Punto de corte de sensibilidad es 20 mm

• Punto de corte de resistencia 14 mm
Tenemos otros métodos cuantitativos como: dilución en agar, macro dilución en caldo,
micro dilución en caldo, épsilon test (E test), métodos automatizados. Algunas de estas se
ocupan con el método de dilución hasta obtener un gradiente decreciente adecuado.
Concentración inhibitoria mínima (CIM): Se define como la concentración mas baja de un
antimicrobiano expresada en mililitro, que inhibe el crecimiento visible de un m.o después
de incubarlo. Varia depende de la droga, m.o testeado y zona de infección. Es importante
conocer la CIM de un antimicrobiano para que cuando realicemos el antibiograma
podamos mantener concentraciones sobre la CIM para inhibir el crecimiento bacteriano.
Epsilometría
Sus principales uso son
- CIM a penicilina y cefotaxima en Streptococcus pneumoniae y Streptococcus grupo
viridans aislados de cuadros invasivos.
- CIM a vancomicina y teicoplanina en Enterococcus spp resistentes a glucopéptidos aislados
de cuadros invasivos.
 - CIM a vancomicina y daptomicina en Staphylococcus aureus y
Staphylococcus coagulasa negativa.
- CIM para Listeria monocytogenes, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae,
Campylobacter spp, algunos anaerobios y bacterias fastidiosas.
- CIM a imipenem, meropenem, ertapenem y doripenem en enterobacterias y bacilos gram
negativos no fermentadores resistentes a carbapenémicos.
- Confirmar/detectar un fenotipo de resistencia específico, p. ej., BLEE

Cocáceas gram positivas género

Staphylococcus
• Si son catalasa positiva: entonces sospecho de Staphylococcus (gram en racimo)
o Micrococcus (gram en tétradas).
• Se agrupan en racimos. Son anaerobios facultativos
• Se realiza coagulasa, es una buena prueba para realizar una subdivisión

¿Qué pruebas puedo realizar para este género?

• Coagulasa
- Coagulasa positiva: Staphylococcus aureus, Staphylococcus pseudintermedius
- Coagulasa negative: S. saprophyticus, lugdunensis, epidermis
• Tira de PYR S. Aureus
• MIO (para leer ornitina no realizar indol) Colonias generalmente de
aspecto amarillo, anaranjado o
• Disco de bacitracina (opcional, hacerlo en MH)
dorado, también pueden ser a
• Dnasa (pruebas complementaria) pigmentadas. Pueden tener o no
• Manitol salado (prueba complementaria) presencia de beta hemolisis.

Coagulasa
proteína con actividad similar a la protombina, convierte el fibrinógeno en fimbrina y causa
un coagulo. Nos permite identificar Staphylococcus aureus y diferenciarlo de otros tipos
de Staphylococcus.
Procedimiento: Emulsionar (mezclar) una pequeña cantidad de colonia en un tubo que
contenga 0,5 ml de plasma de conejo o humano, incubar a 36 (+-1°C) por cuatro horas y
ver formación de coagulo, si no se observa dejar a T° ambiente por 18 horas .
Control de calidad
 Positivo: Staphylococcus aureus
Negativo: Staphylococcus epidermis
DNASA
El Staphylococcus aureus produce una Dnasa termoestable que hidroliza DNA.
Procedimiento: inocular el m.o en el agar DNA en forma de estría o una línea, después se
incuba entre 18 a 24 horas y se revela con HCL al 1%, que causa que precipite el DNA
nativo del medio.
Interpretación
Se observan colonias rodeadas por una zona clara donde el DNA fue despolimerizado e
hidrolizado, es positivo si hay cambios, si no presenta cambios es negativo.

Manitol salado
El medio contiene, cloruro de sodio al 7,5%, rojo fenol y peptonas. En cuanto al
procedimiento se siembra y se incuba entre 18 a 24 horas. Este medio solo se usa como
identificación, no para aislamiento ya que la sal inhibe a otros m.o.
Interpretación

• Crecimiento y viraje (color amarillo): Staphylococcus aureus

• Crecimiento sin viraje (color original rojo): S. epidermis u otros coagulasa negativos.

El género de Staphylococcus posee el gen Mec A, este codifica para la alteración de

estructura de la proteína PBP2a, esta inhibe la unión de la meticilina a la transpeptidasa, y
esto causa que se inhiba la acción de los beta-lactamicos.

• Hay Staphylococcus resistentes a meticilina (SAMR), estos causan cuadros de

enfermedades persistentes, tienen alto impacto comunitario. Estos confieren
resistencia a todos los beta lactamicos.
• Puedo ocupar cefoxitin para S. lugdunensis, S. aureus y SCN
• Oxacilina para S. pseudintermedius

D-TEST
Se ocupa para ver el fenotipo MLSb que son resistentes a eritromicina y clindamicina.
Para detectar la resistencia inducida se colocan los discos de eritromicina y clindamicina
juntos, a una distancia de 15 a 26 mm.
1) Staphylococcus con resistencia inducible a la clindamicina (positivo): se informa como
resistente a clindamicina o indicar resistencia inducible. (se ve una D)
 2) Staphylococcus con resistencia mediada por bomba de expulsión activa
(Negativo): sensible a clindamicina y resistente a eritromicina.

Novobiocina
Algunas bacterias son sensibles a la Novobiocina, se pone el disco en un agar MH, para ver
su sensibilidad el diámetro de inhibición debe ser mayor o igual a 16 mm.
Sensible → Staphylococcus: epidermis, lugdunensis.

Streptococcus y Enterococcus
• Cocaceas gram positivas que tienen tendencia a formar cadenas o pares, son
anaerobios facultativos, pueden presentar hemolisis alfa, beta o gamma, pero en un
99% son gamma hemolíticos. Generalmente se encuentran en infecciones de piel,
tracto respiratorio y tracto urinario
¿Qué pruebas puedo realizar para esta cepa?

• PYR
• NaCl (6,5%)
• Mio (para ver motilidad, no agregar indol)
• Bilis esculina
• Disco de arabinosa (250 ul. de agua destilada o suero fisiológico)
• Otros (ppt): test de detección de antígeno, sensibilidad a bacitracina u optoquina

Clasificaciones…
Grupo de Lancefield
Se basa en la clasificación de un carbohidrato que va en la pared celular, se clasifica de
la A hasta la W (sin contar la I y la J). Para identificar se utiliza la manera más rápida la
cual consiste en la extracción de los grupo A, B, C, F, y G. El grupo D lo encontramos
en S. bovis y Enterococcus.
 Clasificación actúa “gen 16S RNA ribosomal (2006)”
1) Piogénico (S. pyogenes, S. agalactiae, S. aureus)
Generalmente formado por colonias betahemolíticas, colonias grandes.
S. pyogenes: Se encuentra principalmente en faringitis bacterianas, tiene la fama de
bacteria come carne, debido a que causa mionecrosis graves. Colonia betahemolítica.

• Sensible a bacitracina (0,04 u)

• Aglutina para el grupo A de lancefield
• Pyr: Positivo + (me da sospecha de Enterococcus, S. porcinus, S. iniae)
Bacitracina
Se inocula el m.o en agar sangre, con discos de bacitracina de 0,04 u. Sensible a cualquier
halo de inhibición de crecimiento bacteriano. Se incuba entre 18 a 24 horas, a 33° a 35° en
Co2.
PYR
Detecta la enzima pirrolidonil arilamidasa, se utiliza como sustrato el reactivo L-pirrolidonil-
beta-naftilamida (PYR), nos sirve para la identificación rápida de enterococos.
Puede realizarse en disco (30 minutos y leer) o en tira (1 minuto y leer).
Positivo: disco color rosado o rojo
Negativo: amarillo o incoloro
S. agalactiae: se relaciona con el canal de parto, abortos espontáneos, infecciones
urinarias. Las colonias son betahemolíticas. Aglutina para el grupo B de lancefield.

• Pyr: negativo
• Test de camp: positivo
• Hidrolisis de Hipurato: positivo
• Arginina: positivo
• Agar granada: positivo
Test de camp
Prueba que permite separar Streptococcus agalactiae de los demás Streptococcus
betahemolíticos. El S. agalactiae produce un factor llamado CAMP que interactúa con la Beta
hemolisina secretada por una cepa betahemolítica de S. aureus, causando sinergismo de
hemolisis.
Procedimiento: En el agar sangre, sembrar una línea de S. aureus y perpendicular a esta
estría sembrar cerca la cepa de estafilococo en estudio. Se incuba por 18 a 24 horas a 35°
C en aerobiosis.
 Resultados: se verá una punta de flecha si es positivo

Hipurato de sodio
Los enterococos y el S. agalactiae pueden hidrolizar al Hipurato de sodio. La producción de
hipuricasa resulta en la hidrolisis del Hipurato de sodio y forma benzoato de sodio y glicina.
Procedimiento: se inocula un tubo con Hipurato de sodio con el m.o, se incuba por 24 horas
a 35°C. Centrifugar, pipetear 0,8 ml el sobrenadante, agregar 0,2 ml de cloruro férrico 7%.
Inocular tubo con 0.4 ml de medio Hipurato de sodio con el m.o e incubar 2 horas a 35°C,
agregar 0,2 de ninhidrina.
• Positivo benzoato: formación de un precipitado denso y persistente por 10 minutos
• Positiva a glicina: aparición de un color purpura profundo

2) Mitis (neumococos)
S. pneumoniae: presenta colonias con centro deprimido producto de la autolisis, solo el
serotipo 3 se puede reconocer por sus colonias grandes y mucosas. Puede causar
meningitis, bacteriemia, neumonía.

• Alfa hemolisis
• Sensible a optoquina (halo >14 mm con disco de 6mm)
• Solubilidad en bilis: positiva
Solubilidad en bilis
S. pneumoniae produce enzimas autolíticas. La adición de solución de sales de bilis a la
suspensión de la bacteria acelera el proceso de lisis.
Procedimiento: a partir de un cultivo preparar una suspensión densa del microorganismo
en solución salina con una turbidez igual al numero 1 de la escala de McFarland. En cada
tubo colocar 0,5 ml de la suspensión salina del m.o mas la bacteria.

• Positivo: si se aclara el tubo

• Negativo: sin cambios
 Prueba de optoquina
Se usa un disco de optoquina para diferencia S. pneumoniae es sensible a
comparación de otros Streptococcus que son resistentes.
Procedimiento: se toma una suspensión de colonias puras en caldo MH o tioglicolato, con
un hisopo realizar una estría en agar sangre y sobre la estría colocar el disco de optoquina,
se debe incubar con atmosfera de CO2 al 5% por 24 horas a 35°.
Formación de genes en mosaico
Incorporación de fragmentos de material genético de otros m.o (S. sanguis, S. oralis, S. mitis,
etc.) a través de transformación y recombinación homologa generando genes en parche.
PBPs codificadas por genes en mosaico son: PBP2b, PBP2x, PBP1a.
3) Anginosus o milleri
Especies encontradas generalmente en cavidad oral, tracto genital y gastrointestinal.
Característica importante olor leve a caramelo, pueden presentar las 3 hemolisis, alfa, beta
y gamma.
4) Salivarus
• Hay 3 tipos de Streptococcus relacionados: S. vestibularis, S. Salivarus, S.
thermophilus.
• Todos son voges proskauer positivos.
• No fermentan arginina, manitol y sorbitol.
5) Bovis
Generalmente habitan en el tracto gastrointestinal de los animales, rara vez afectan al
humano. Pertenecen al grupo D de lancefield.
6) Mutans
Engloba 8 especies, relacionadas con las caries dentales.
_________.__________

• Streptococcus pyogenes, agalactiae, pneumoniae → son resistentes a

Eritromicina y clindamicina.
 Prueba Nacl 6,5%
Los Enterococcus y Streptococcus poseen la capacidad especifica de desarrollarse en
presencia de NaCl. Se usa en conjunto con bilis esculina.
Procedimiento

• Sembrar en caldo hasta alcanzar turbidez y traspasar al caldo sal 2-3 gotas. Incubar
a 36 +-1°C por 24 horas.
Resultados
• Positivo: desarrollo bacteriano en medio, se ve turbio, con o sin cambio de color.
• Si el m.o es BE positivo, pero NO se desarrolla en NaCl es Streptococcus grupo D
• Si el m.o es BE positivo y se desarrolla en NaCl es perteneciente al grupo
Enterococcus.

Genero Enterococcus
Son 29 especies, aislados o en cadenas cortas. Pertenecen al grupo D de lancefield
Bilis esculina (tubo)
Estos estreptococcus hidrolizan la esculina a esculetina en presencia de 1-4% de sales
biliares.
Procedimiento
• Se inocula el m.o sobre el agar que se encuentra en superficie pico de flauta, en
forma de estría. Es importante no romper el agar o puede dar falso positivo.
Resultados

• La hidrolisis de esculina se ve cuando hay un oscurecimiento del medio, queda

color negro. Y se observa si hay o no crecimiento.
 Telurito
Se utiliza para ver si las bacterias son capases de tolerar y reducir el Telurito de
potasio a teluro, producen colonias negras

Resistencia propia del genero

• Lincosamidas: resistencia de bajo nivel a clindamicina y lincomicina, por expresión
del gen INU (b) nucleotidiltransferasa adenila grupo hidroxilo.
• Betalactámicos: tienen baja afinidad a PBP5 (Ampicilina, penicilina, piperacilina,
cefalosporinas)
• SXT: Falsa sensibilidad invitro. Resistente invitro por incorporación de ácido fólico
exógeno.
• Aminoglucósidos: resistencia de bajo nivel por ingreso de ATB

Resistencia propia de la especie

• Estreptograminas: E. faecalis, E. gallinarum, E. casseliflavus
• PEN, AMP: La mayoría de E. Faecium y E. raffinosus son resistentes
• Vancomicina: E. gallinarum, E.casseliflavus, E. flavescens

Enterococcus → fenotipo van A

Resisten altamente a:
• Vancomicina (CIM mayor o igual a 64 ug/ml)
• Teicoplanina (CIM mayor o igual a 16 ug/ml)
Esto se debe a la adquisición de un transposón Tn1546, que es parte de un plásmido que se
transfiere por conjugación.

Enterococcus → fenotipo van B

Resistencia intermedia o alta a:

• Vancomicina (CIM 8/16 ug/ml o CIM mayor a 1000 ug/ml)

Sensible a teicoplanina.
Van B está en el transposón Tn1547.
 Resumen de baterías y clasificación

Enterobacteriaceae
Gram negativos →Bacilos
Enterobacterales

• Todas son Gram negativas

• Fermentan glucosa y producen acido
• Reducen nitratos a nitritos
• Oxidasa negativa -
• Catalasa positiva +
• Anaerobios facultativos (No necesitan O2)
• móviles, excepto Shigella y Klebsiella
• Sin capsula (solo klebsiella)
• No son fastidiosas
• Crecen en medio conteniendo bilis, en agar MacConkey
Puedo ocupar varios agares para diferenciar si son F. de lactosa positivos y negativos
- Agar MacConkey (Selectivo y diferencial para esta especie)
- Eosina de azul de metileno (agar)
- Salmonella Shigella
- TSI (agar)

Baterías para bacilos gram negativos

Oxidasa negativa - Oxidasa positiva +
TSI OF GLUCOSA
LIA BILIS
MIO Desarrollo a 42°C MacConkey (de
preferencia usar este para ver pigmento en
UV) o sangre a 4° C.
CITRATO
UREA
BILIS
OF GLUCOSA

Clasificación básica

Fermentadores de Fermentadores tardíos Fermentadores sin

lactosa de lactosa lactosa
E. coli Shigella sonnei Shigella
Escherichia Salmonella
Klebsiella
 Vista taxonómica, clasificación por tribus

Escherichia Klebsiella Proteeae Erwinieae

Escherichia Klebsiella Proteus Erwinia
Edwarsiella Enterobacter Morganella
Citrobacter Hafnia Providencia
Salmonella Serratia
Shigella

Bacilos no fermentadores (BNF)

GENEROS
Pseudomonas (oxidasa +)
Strenotrophomonas
Acinetobacter
Burkholderia (oxidasa +)
Alcaligenes (oxidasa +)

Estos BNF son

• Catalasa positiva +
• Oxidasa positiva + (algunas excepciones)
• Todos son gram negativos

batería que se debe realizar a BNF

TSI MIO
LIA CITRATO
UREA ARGININA
DNASA OF GLUCOSA
MANITOL MALTOSA
BILIS ESCULINA
 EJEMPLOS BNF

Tamizaje antibiograma
Antibióticos de primera línea:

Ampicilina, cefazolina, gentamicina, tobramicina

Antibióticos de Segunda líneas:

Ampicilina/sulbactam, cefepime, amoxa/clavulánico, doripenem, imipenem,

ertapenem, aztreonam, etc.

BLEEs
Hidrolizan Inhibidas Parcialmente inhibidas
Amino penicilinas Carbapenems Piperacilina/Tazobactam
(ampi-amoxa)
Cefalosporinas Cefaminas Ceftolozane/tazobactam
(todas) (cefoxitin, cefotetan,
moxalctam)
Ampi/sulbactam Avibactam
Monobactams Acido clavulánico
(Aztreonam) (in vitro)
 Ejemplos perfiles fenotípicos de BLEEs

• Estas bacterias tienen la capacidad de hidrolizar

A EROMONAS a todas las cefalosporinas, inhibidores de
betalactamasas y aztreonam.
M MORGANELLA • No hidrolizan carbapenémicos ni cefepime
• No asociadas a MDR excepto con otra
P ROTEUS/PROVIDENCIA/PANTOEA betalactamasa presente

C ITROBACTER Resistentes: ampicilina/sulbactam,

amoxicilina/clavulánico, cefoxitin, ceftazidima,
ceftriaxona, aztreonam, ciprofloxacina.
E NTEROBACTER
Sensible: Cefepime, Ertapenem, Imipenem,
S ERRATIA Meropenem, Amikacina, Gentamicina, Fosfomicina,
Colistina.

De- Represión: Enterobacter y Serratia

Al comienzo se observan que son sensibles al comienzo,

pero durante la terapia se vuelven resistentes.
 Enzimas de tipo AmpC inducible

¿Cómo informar las enterobacterias AmpC inducibles?

Cefalosporinas de 3° generación: Sensible: fenotipo inducible

• SENSIBLE Cef. 3° Gen *posible selección de resistencia durante

tratamiento.
• No informar C3° Gen; informar S las Cef de 4° Gen.

Cefalosporinas de 3° generación Resistente:

• BLEE+: Informar resistente todos los betalactámicos

• AmpC Desrreprimida: informar C4° Gen. Si da sensible con nota* o no
informar.
• *Posible selección de resistencia durante tratamiento: Alternativa: no
informar, solo informar Carbapenems.
 Diagnostico de laboratorio de
Carbapenemasas en enterobacterias

Tenemos de 3 tipos

Tipo A → de tipo SERIN

Tipo B → de tipo METALO dependiente de ZINC

Tipo D → de tipo SERIN

CREE

• Tienen clasificación y fenotipos complejos

• Expresión variable (heterorresistencia)
Detección fenotípica
metalobetalactamasa

Pseudomona aeruginosa portadora de Betalactamasa VIM

• Boron, ácido boronico

• ETP, Ertapenem
• IMI, Imipenem
• MRP, Meropenem
• D.P.A Acido dipicolínico

Detección fenotípica de Serincarbapenemasa

 Klebsiella pneumoniae
Portadora de betalactamasa tipo KPC

Reglas de expertos para Carbapenemasas

Si se detectan Carbapenemasas de clase A o inhibibles con Ac Boronico y Avibactam
• Reportar aminopenicilinas, ureido penicilinas, cefalosporinas y aztreonam como R
• Ertapenem reportarlo como R
• Tamizar y reportar Ceftazidime/Avibactam por E-test o microdilucion en caldo
Si se detectan Carbapenemasas de clase B o inhibibles con EDTA/Ac dipicolínico

• Reportar aminopenicilinas, ureidopenicilinas, cefalosporinas y ertapenem como R

• Tamizar y reportar aztreonam
Si detecto Carbapenemasas de tipo D o no inhibibles por Boronico y EDTA

• Aminopenicilinas, ureidopenicilinas y cefalosporinas de 1 y 2° G como R

• Ertapenem R
• Cefalosporinas de 3 y 4 generación (S/I/R)
• Tamizar y reportar Ceftazidime/Avibactam por E-test o microdilucion
 RESUMEN DE BACILOS GRAM NEGATIVOS

Bacilos gram positivos esporulados y no

esporulados
Pueden ser aerobios y anaerobios, formadores y no de esporas.
Tenemos 4 géneros

• Bacillus
• Clostridium
• Corynebacterium
• Listeria

Bacillus
• Son bacilos Gram positivos, de tipo aerobios, son grandes y están agrupados en
cadenas ----
• Presentan esporas, son productoras de antibióticos, vitaminas, alcoholes y enzimas
 • Tenemos: Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus anthracis
Bacillus anthracis : Bacilos grandes, gram positivo, forma
esporas, extremos rectangulares, Catalasa positiva +, inmóvil.
Se encuentra generalmente en suelo, cadáveres de animales, los
animales pastan y se infectan por una mucosa lesionada.
- Cutaneo (anthrax)
- Respiratorio
- Gastrointestinal
En él humano: Carbunco Cutaneo
Esporas → entran por piel o mucosas lesionadas → germinan en el tejido → Crecimiento
de células vegetativas (edema gelatinoso) →Multiplicacion-diseminacion→ Liberación de
toxina que causa: edema, necrosis, hemorragia.
Carbunco respiratorio:
Aspiración pulmonar de esporas → germinación en los pulmones o ganglios linfáticos
traqueobronquiales → causa: mediastinitis hemorrágica, neumonía, meningitis y septicemia.
Carbunco digestivo
Germinación mucosa intestinal digestiva → linfáticos mesentéricos →causa: adenitis
hemorrágica.
Determinantes de la patogenicidad: Espora, capsula, tiene actividad anti fagocítica,
producción regulada por plásmido exotoxina, depende de un plásmido de tipo A-B.
• Diagnostico
Muestras: pus, líquidos de lesión local.
Se realizan frotis de las muestras
Cultivo: Agar sangre: colonias grises no hemolíticas – medio semisólido: inmóvil— Prueba
ascoli: extractos de tejidos muestran anillo precipitado – Pruebas serológicas AC
• Tratamiento: Penicilina, tetraciclinas, eritromicina, clindamicina
Bacillus cereus:
Produce envenenamiento alimentario por carne y salsa
Causa cuadro emético: al incubar el Bacillus por 6 horas
Causa cuadro diarreico: incubación de 1 a 24 horas
 Clostridium
Bacilos gram positivos, anaerobios, esporulados. No sobreviven en aerobiosis.
Pueden causar infecciones de origen endógeno y exógeno.
Especies: Clostridium botulinum, C. difficile, C. perfringes, C. tetani.

Clostridium tetani
Presente en la microbiota intestinal animal, las esporas las
encontramos en el suelo o animales en descomposición.
Bacilos gram positivos, finos (parecen raqueta de tenis),
esporulados, móvil, a capsulado, anaerobios estrictos, presentan
flagelos peritricos.
Sintetiza toxinas: Tetanospamina, Tetanolisina.
Periodo de incubación: 4 días-varias semanas
Formas clínicas: tétanos generalizado, localizado y neonatal
¿Qué signos causa? → contracciones tónico-clónicas involuntarias y dolorosas (se curvan
los pacientes) y rigidez muscular (como parálisis)
Diagnostico:

• Directo: bacilos finos gram positivos + o negativos -, con una espora esférica
terminal.
• Cultivo e identificación: siembra en agar sangre, anaerobiosis. La muestra se somete
a calentamiento por 10 minutos para eliminar flora acompañante, se siembra y se
incuba.
Tratamiento:

• Medidas de sostén: mantener funciones vitales, mitigar síntomas clínicos.

• Neutralizar toxina: administrar toxoide
• Eliminar fuente de producción de toxina: debridación y drenaje
• Usar antibiótico con penicilina G, tetraciclina o macrólidos

Clostridium botulinum
Produce botulismo: debilidad muscular, parálisis flácida,
Gram positivos, esporulados, móviles, a capsulados, flagelos peritricos.
Producen toxinas (8 tipos de A-H)
Transmisión: ingestión de conservas vegetales y embutidos mal
procesados y por contaminación de heridas por esporas.
 Diagnostico:

• Muestras: alimentos sospechosos, heces, material de origen digestivo,

exudados de heridas o tejidos.
• Presencia de la toxina: PCR
• Cultivo: Tratamiento térmico o con alcohol para enriquecer la muestra, usar
medio no selectivo (agar yema de huevo) y selectivos
Tratamiento

• Neutralizar o eliminar toxina: inducción de vomito o lavado gástrico

• Mantener funciones del huésped: respiratoria, debridación y drenaje de herida
• Administrar antimicrobianos

Clostridium Perfringes
Produce mionecrosis, que es gangrena gaseosa, celulitis, tosxiinfecciones alimentarias,
enteritis necrosante, diarreas entero toxicas no relacionadas con alimentos e infecciones
inespecíficas.
Bacilos gram positivos, capsulado, esporulado e inmóvil. Anaerobio poco
estricto
Metabólicamente activo: sacarolitico y produce gas
Se divide en 5 tipos: A. B, C, D, E . (en el hombre se presenta el tipo A)
Es un bacilo corto, ancho y no suele apareces esporulado.
Diagnostico

• Tinción de gram: Ausencia de PMN

• Cultivo: en agar sangre, agar yema de huevo en anaerobiosis
• Actividad lecitinasica: se inhibe añadiendo antisuero a la mitad de la placa (prueba
nagler)
• Técnicas serológicas: para presencia de toxinas en heces
Tratamiento

• Medidas quirúrgicas: fasciotomías (favorece irrigación muscular).

• Penicilina G, clindamicina, metronidazol, imipenem, meropenem
• Oxigeno hiperbárico

Clostridium difficile
Produce enterocolitis pseudomembranosa.
Bacilo gram positivo, esporulado, móvil, capsulado y anaerobio
Sintetiza 2 toxinas: A (Enterotoxina) y B (citotoxina)
 batería bioquímica para bacilos gram positivos
esporulados
TSI
PIGMENTO
Test de CAMP con S. aureus ATCC productor de betalisina

Bacilo gram positivos no esporulados

Corynebacterium diphteriae
Productor de difteria.
Bacilos gram positivos pleomórficos, aerobios, Catalasa positiva.
Tiene tipos: Gravis, Intermedius, Mitis
Reservorio es el hombre portador o enfermo, resiste a la disecación y luz
por 3 meses, son sensibles al calor y desinfectantes habituales.
Difteria respiratoria
La puerta de entrada puede ser vía mucosas.
Tenemos tipos: Faringoamigdalar, nasal, laríngea y traqueobronquial. Conjuntival, vaginal y
oído.
Factores de virulencia

• Exotoxina → inhibe síntesis proteica y ocasiona destrucción de células del huésped

• Antígeno O
• Antígeno K
Diagnostico:

• Muestra de zona inflamada hisopo o raspado

• Medio de cultivo: suero coagulado (Loeffler), se ven colonias pequeñas, granulares
y grisáceas/ Agar sangre + Telurito: colonias grises a negras / Detección de la
toxina por inmunodifusión

Tratamiento:

• Rápida supresión de bacterias productoras de toxinas por fármacos

• Penicilina, eritromicina
• Administración temprana de la antitoxina diftérica o antisuero
• Prevenir: vacuna
 Propiniobacterium

Parte de la flora normal cutánea y conjuntiva.

Bacilos gram positivo NO esporulados y son anaerobios

Acné vulgaris
Al producir lipasas liberan ácidos grasos de lípidos cutáneos, estos tapan los poros
de la cara y causan inflamación tisular que contribuye al acné. Puede producir
infección en válvulas cardiacas y de derivaciones artificiales de LCR.

Listeria monocytogenes
Produce listeriosis en humanos.
Cocobacilos gram positivos, presentan antígeno O y antígeno H, es móvil (flagelos y
peritricos), se transmite con los alimentos
Se transmite por contacto directo con animales o materia infectada, vía placentaria,
canal de parto, vía digestiva o alimentos contaminados
Tratamiento
• Ampicilina (penicilina+aminoglucósido), gentamicina, cotrimoxazol
Diagnostico.
• Directo: tinción de gram
• Indirecto: muestras (sangre, líquido amniótico, secreciones genitales, LCR, heces).
Agar triptosa (colonia verde o azul), agar sangre.
• Oxidasa negativa
• Catalasa positiva

Bacilos gram positivos no Bacilos gram positivos no

esporulados esporulados
Catalasa positiva Catalasa negativa
TSI TSI
MIO (movilidad a 25°C) Test de CAMP con S. aureus ATCC
productor de betalisina
Test de CAMP con S. aureus ONPG*
ATCC productor de betalisina
Bilis Esculina
Ramnosa
 Cocos gram negativos
DNASa
CTA glucosa o pastilla, oxidación glucosa
CTA Maltosa o pastilla
CTA Sacarosa o pastilla (sucrosa)
Nitritos, solicitar revelador