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Biología y medicina de radicales libres 172 (2021) 286–297

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Biología y medicina de radicales libres

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Artículo original

El tratamiento de semillas con plasma frío mejora la resistencia al frío de las plantas de tomate a
través de la vía de señalización del peróxido de hidrógeno y el ácido abscísico

kai lia,1, Chongshan Zhongb,1, Qinghua Shia, Huangai Bia, Biao Gonga,*
aLaboratorio Estatal Clave de Biología de Cultivos / Laboratorio Clave de Biología de Cultivos Hortícolas e Innovación de Germoplasma, Ministerio de Agricultura / Centro de Innovación
Colaborativa de Calidad de Frutas y Verduras y Producción Eficiente en Shandong / Facultad de Ciencias e Ingeniería Hortícolas, Universidad Agrícola de Shandong, Tai'an, Shandong, 271018,
China
bUniversidad Agrícola de China, Pekín, 100083, China

INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO RESUMEN

Palabras clave: Cómo desarrollar un enfoque simple y económico para mejorar la tolerancia de las plantas al estrés por frío es un problema científico
ABA importante. Con la esperanza de que exploramos el efecto y el metabolismo del tratamiento de semillas con plasma frío (CP) sobre la
Plasma frio tolerancia al frío en las plantas de tomate. El tratamiento de semillas de 75 W CP mostró el mejor efecto mitigador sobre el daño inducido
estrés por frío
por frío de las plántulas de tomate, como lo demuestra la mayor eficiencia fotoquímica máxima de PSII (Fv/Fmetro), menor fuga de iones e
H2O2
índice de daño por frío. Además, los resultados mostraron que la tolerancia al frío inducida por PC estaba relacionada con el peróxido de
Tomate
hidrógeno (H2O2) mediada porhomólogo 1 de oxidasa de explosión respiratoria(RBOH1), lo cual se demostró por la disminución de la
tolerancia a bajas temperaturas observada enRBOH1silencio o eliminación química de H2O2
plántulas Es más,RBOH1-mediado H2O2actuó como la señalización posterior del tratamiento de CP para mejorar los niveles de
ácido abscísico (ABA) al aumentar la transcripción de9-cis-epoxicarotenoide dioxigenasa 1(NCED1). Mutación deNCED1abolió
completamente la resistencia al frío inducida por CP. La evidencia genética mostró que H2O2y ABA fueron reguladores
positivos de la tolerancia al estrés por frío. Por lo tanto, H inducida por CP2O2y la señal de cascada ABA regulaba al alza los
genes reguladores (HIELO1yCBF1) de aclimatación al frío, que aumentó la acumulación de sustancias de ajuste osmótico
(prolina y azúcar soluble) y la actividad de enzimas antioxidantes (SOD, APX y CAT). Nuestros resultados indican que H2O2y las
señales ABA están involucradas en conferir tolerancia al estrés por frío inducida por el tratamiento de semillas con CP en
plantas de tomate.

1. Introducción Sin embargo, algunas medidas especiales, como el calentamiento y la aplicación de

Tomate (Solanum lycopersicumL.), así como muchos otros cultivos hortícolas
tropicales/subtropicales son sensibles a ambientes de baja temperatura,
especialmente en su etapa de plántula [1]. Debido a la susceptibilidad al ambiente
de bajas temperaturas, la ubicación geográfica y la temporada de cultivo de estos
cultivos hortícolas son limitadas; mientras tanto, la calidad y el valor económico
del producto también se ven afectados. El área del invernadero ha crecido a 1.32×
106mmm2en China (FAO;http://www.fao.org/ag/agl/agll/spush/intro.htm) y
durante el cultivo de invierno de cultivos hortícolas tropicales/subtropicales en
invernadero, a menudo se encuentran con estrés por bajas temperaturas, lo que
conduce a una disminución significativa de la calidad y el rendimiento. Por lo
tanto, una serie de sistemas de cultivo en invernadero se han utilizado
ampliamente para superar la producción hortícola limitada por bajas
temperaturas en todo el mundo.
hormonas químicas, proporcionan diversos grados de gasto energético y contaminación
ambiental.
Numerosas evidencias indican que factores de estrés moderado, como el frío,
la sequía, el estrés oxidativo, etc., pueden inducir tolerancia al frío, lo que se
denomina aclimatación al frío.2]. La tecnología de cebado de semillas ha sido
inventada y utilizada para desencadenar el metabolismo previo a la germinación,
acelerar la germinación de las semillas y la tolerancia de las plántulas de acuerdo
con el mecanismo de aclimatación inducida por el estrés [3]. Como técnica de bajo
costo y bajo riesgo, el enfoque de cebado de semillas se ha utilizado ampliamente
para mejorar la calidad de las semillas o las plántulas.4]. Existen numerosas
técnicas de cebado de semillas que incluyen halo-cebado, hidrocebado, osmo-
cebado, cebado hormonal, cebado químico, cebado físico y cebado biológico.5].
Como una nueva tecnología de cebado fisicoquímico, el tratamiento de semillas
con plasma frío (CP) ha recibido mucha atención.

* Autor correspondiente.
Dirección de correo electrónico:gongbiao@sdau.edu.cn (B. Gong).
1Estos autores contribuyeron igualmente.

https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2021.06.011
Recibido el 24 de abril de 2021; Recibido en forma revisada el 7 de junio de 2021; Aceptado el 11 de junio de 2021
Disponible en línea el 15 de junio de 2021
0891-5849/© 2021 Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.
K. Li et al.
del investigador para inducir el potencial de tolerancia al estrés de las plantas,
especialmente para cultivos hortícolas de alto valor agregado [6]. CP, también llamado
plasma no térmico, es uno de los estados de la materia y una mezcla de gas neutro, gas
ionizado, moléculas excitadas de especies reactivas de oxígeno (ROS) y especies reactivas
de nitrógeno (RNS), electrones y partículas con carga positiva. ROS y RNS tienen un
amplio espectro de funciones reguladoras involucradas en varios procesos de
crecimiento y desarrollo de las plantas, incluyendo la germinación, el metabolismo, el
transporte de señales, la absorción de nutrientes, la senescencia y la tolerancia al estrés
abiótico/biótico.7]. Como las ROS y RNS canónicas, el peróxido de hidrógeno exógeno (H2
O2) y el óxido nítrico (NO) se ha demostrado que juegan un papel positivo en el cebado
de semillas para mejorar el crecimiento de las plántulas y la tolerancia al estrés [5,8]. Más
recientemente, se ha informado que el tratamiento de semillas con CP modula el
crecimiento del tomate, la homeostasis redox y la respuesta al estrés osmótico mediante
la inducción de ROS.6]. En comparación con el electrón, CP tiene partículas masivas con
temperaturas más bajas de 25 a 45◦C. Además, teniendo en cuenta las características
rentables y ecológicas, CP se aplica ampliamente en el campo de la ciencia biológica y la
medicina [9]. Sin embargo, la inducción de respuestas de defensa mediante el
tratamiento de semillas con PC, especialmente la respuesta al frío, está aún menos
investigada en la agricultura.
ROS, que incluye principalmente anión superóxido (O⋅- 2), oxígeno singlete (1O2),
radicales hidroxilo (OH⋅)y peróxido de hidrógeno (H2O2), son los subproductos del
metabolismo aeróbico [10]. Cuando las plantas están sujetas a condiciones de estrés, las
ROS a menudo se acumulan y se asocian con el principio del estrés oxidativo, lo que
resulta en patología al dañar el ADN, las proteínas y los lípidos.11]. Sin embargo, se ha
hecho evidente en las últimas tres décadas que las ROS también sirven como moléculas
de señalización beneficiosas para regular los procesos de respuesta al estrés.10]. En las
células vegetales, las ROS se producen principalmente en los cloroplastos y las
mitocondrias, que provienen principalmente de la reacción de Mehler, los pigmentos de
antena y la reducción excesiva de la cadena de transporte de electrones.12]. Se cree que
las oxidasas dependientes de NADPH de la membrana plasmática, también conocidas
como homólogos de oxidasa de explosión respiratoria (RBOH), desempeñan un papel
clave en la señalización de ROS y contienen un flavocitocromo multimérico que forma
una cadena de transporte de electrones
⋅-
capaz de reducir O2también2 [13]. la o⋅- 2luego se convierte en H2O2por
superóxido dismutasa (SOD). en fresa (Fragaria×ananasaCV. Toyonaka),
los niveles de expresión deRbohAyRbohDfueron rápidamente
inducido por el estrés por frío, lo que lleva a O⋅- 2acumulación y activación de la
aumentos transitorios en la actividad de SOD, lo que sugiere que estos dos genes
pueden estar involucrados en el estrés por frío y las respuestas de defensa.14]. A
excepción de la regulación transcripcional, se ha identificado una proteína
inducible a baja temperatura SRC2 (gen de soja regulado por frío-2) que interactúa
con RbohF para mejorar la tolerancia al frío deArabidopsisraíces [15]. Expresión de
RBOHtambién está regulado por hormonas vegetales como los brasinolidos (BR) y
el ácido abscísico (ABA). La elevación de los niveles de BR y ABA resultó en una
mayor producción de H2O2a través de RBOH junto con una mejor tolerancia
contra un subconjunto de tensiones [dieciséis,17]. Es interesante notar que
nuestro estudio previo [18] y otro experimento independiente [6] mostró una
opinión similar de que el tratamiento de semillas CP indujo significativamente la
RBOHexpresión y H2O2acumulación, que puede ser la señalización de respuesta
de estrés clave inducida por CP. Sin embargo, no hay evidencia genética para
consolidar esta conclusión hasta el momento.
En el presente estudio, nuestro objetivo fue investigar el efecto del tratamiento de
semillas con CP sobre la tolerancia al estrés por frío en plántulas de tomate. Los niveles
de H2O2y ABA, así como sus genes reguladores, se examinaron durante tratamientos
combinados a baja temperatura y CP. Para proporcionar evidencia genética de la
resistencia al frío inducida por CP,RBOH1-plántulas de tomate silenciadas (RBOH1-) y
mutante deficiente en ABAnotabilis(no) se generó y utilizó para examinar los procesos de
respuesta fisiológica y molecular inducidos por CP en condiciones de baja temperatura.
Nuestros resultados mostraron, por primera vez, que el tratamiento de semillas CP
confirió tolerancia al frío a través de la regulación positivaRBOH1y su actividad
enzimática, que mejoró aún más los niveles de ABA para promover la tolerancia al estrés
por frío. Además, también evaluamos la fecha de vencimiento del almacenamiento de
semillas y la edad de las plántulas. Todos los resultados proporcionan una amplia
aplicación plausible prometedora del tratamiento de semillas CP para la mejora de
cultivos de tomate en el futuro.
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2. Materiales y métodos
2.1. Dispositivo de plasma frío y tratamiento de semillas.
El CP fue generado por descarga de barrera dieléctrica de baja presión. La
representación esquemática y CP real del dispositivo se mostró en Figura 1. El reactor CP
de barrera dieléctrica se colocó en una cámara de vacío y estaba constituido por dos
electrodos y un vidrio de cuarzo. Se colocaron semillas de tomate de un gramo sobre el
vidrio de cuarzo antes del tratamiento con CP. La presión se redujo a 60 Pa mediante una
bomba de vacío. Luego, se cerró la válvula n.º 1 y se abrió la válvula n.º 2 para agregar un
poco de helio a 130 Pa. La fuente de alimentación de plasma (13,56 MHz y 500 W) se
recibió en el terminal superior para generar CP. Las semillas de tomate fueron tratadas
por CP a 25, 50, 75 y 100 W durante 10 s mediante la regulación de la potencia de salida.
Después del tratamiento con CP, todas las semillas se almacenaron en un lugar fresco y
seco y se usaron para experimentos dentro de una semana o un tiempo específico en
Figura 11leyenda.
2.2. Materiales vegetales y condiciones de crecimiento.
Se utilizó tomate Ailsa Craig (AC) como plantas de tipo salvaje (WT). El mutante
ABAdeficientenotabilis(no; AC back-ground) tiene una mutación nula en el gen9-
cis-epoxicarotenoide dioxigenasa 1(NCED1), que se obtuvieron del Tomato
Genetics Resource Center [19]. losRBOH1-- las plantas silenciadas fueron creadas
mediante un enfoque de silenciamiento de genes inducido por virus (VIGS) basado
en el virus del cascabel del tabaco (TRV). Utilizando los materiales de WT ynopor
manipulación genética, obtuvimos laRBOH1-plantas silenciadas (RBOH1-) y doble
NCED1/RBOH1-plantas silenciadas (no/R-BOH1-) por separado.
Las semillas de todos los genotipos de tomate anteriores se sumergieron en
agua durante 6 h y luego se esparcieron en el plato de cultivo con el papel de filtro
humedecido para la germinación (28◦C). Las semillas germinadas se sembraron en
macetas (profundidad 15 cm, calibre 10 cm) llenas de turba y vermiculita (v:v =
2:1). Todas las plántulas se cultivaron en una cámara de crecimiento con la
condición 25/18◦C y 400 μmol m-2s-1densidad de flujo de fotones fotosintéticos
(PPFD) bajo un fotoperíodo de 12 h, y fertilizados con solución nutritiva de
Hoagland.
2.3. Tratamiento de temperatura
En la etapa de cuatro hojas, la mitad de las plántulas de cada genotipo se
transfirieron a otra cámara de crecimiento con la condición de 10/5◦C y 400 μmol
m-2s-1PPFD bajo un fotoperíodo de 12 h para tratamiento a baja temperatura (LT).
Las plántulas restantes permanecieron cultivadas en la cámara de crecimiento
original, que se usaron como control para el tratamiento de temperatura normal
(NT). La segunda y tercera hoja se utilizaron como muestra para el análisis de
datos en los puntos de tiempo correspondientes, lo cual se ha descrito en la
leyenda de cada figura.
2.4. Silenciamiento de genes por VIGS
VIGS se realizó mediante la infiltración de semillas germinales de tomate
con una mezcla de pTRV1 y pTRV2.Agrobacterium tumefaciens. los RBOH1-El
vector silenciado utilizado para el enfoque VIGS se ha creado en nuestro
estudio anterior, que se ha demostrado que reduce el ARNm y los niveles
enzimáticos deRBOH1significativamente [20].
2.5. Evaluación de la tolerancia al estrés por frío
La fluorescencia de la clorofila (FluorCam 7) se utilizó para medir la máxima
eficiencia fotoquímica de PSII en el estado adaptado a la oscuridad (Fv/Fmetro).
Primero, la segunda o tercera hoja de cada tratamiento se mantuvo en oscuridad
durante 30 min. Entonces elFv/Fmetrofue probado de acuerdo con la guía de
FluorCam 7software.
Referencia a Ref. [21]; trescientos miligramos de hojas se incubaron
en 20 mL de agua desionizada a 25◦C durante 3 h. La conductividad
eléctrica 1 (EC1) de la solución de baño se midió por
K. Li et al.
Figura 1.Imagen esquemática del dispositivo de procesamiento de semillas de plasma frío y la exposición del chorro de plasma frío a la superficie de la semilla de tomate.
DDSJ-308Fmedidor de conductividad (Leici). A continuación, las hojas se hirvieron a
100◦C durante 10 min. Cuando la temperatura de la solución de baño se redujo a
25◦C, se midió nuevamente la conductividad eléctrica 2 (EC2). Fuga de iones = EC1/
EC2×100.
Después del estrés por frío, todas las plántulas de tomate en cada tratamiento
se clasificaron de acuerdo con el estándar de daño por frío [22]. Índice de daño
por frío = Σ (plantas de diferente grado×grado)/[plantas totales×5 (la nota
máxima)].
2.6. Extracción de ARN y análisis de expresión génica.
El ARN total se extrajo de trescientos miligramos de hojas utilizando el método
TRIzol (TermoFisher). Luego, el RNA total se usó para generar cDNA a través del
SuperScript™Sistema de síntesis de primera cadena para RT-PCR (Invitrogen). Los
cebadores utilizados para el análisis qRT-PCR se enumeraron entabla 1. Las qRT-
PCR se realizaron con TransStart Top Green qPCR SuperMix (Transgénero) con las
siguientes condiciones: predesnaturalización durante 1 min (95◦C), 35 ciclos de
desnaturalización (95◦C) durante 10 s, recocer (60◦C) durante 15 s, extender (72◦C)
durante 15 s, con un ciclo de fusión de 65 a 95◦C. La expresión relativa de cada gen
probado se normalizó aβ-actinaValor Ct y calculado por los 2− ΔΔConnecticutmétodo.
2.7. Análisis de actividad enzimática
La actividad de RBOH se midió según la descripción detallada de Xia
et al. [dieciséis]. La actividad de superóxido dismutasa (SOD) se
determinó midiendo la inhibición de la reducción fotoquímica de
nitrobluetetrazolium [23]. La actividad de la ascorbato peroxidasa (APX)
se probó analizando el ácido ascórbico oxidado, que redujo la
absorbancia a 290 nm [23]. La actividad catalasa (CAT) se midió
determinando la extinción de H2O2, que redujo la absorbancia a 240
nm [24].
2.8. Determinación de H2O2concentraciones
El h2O2las concentraciones se midieron por el cambio de absorbancia del
complejo de peróxido de titanio a 415 nm. Los valores de absorbancia se
cuantificaron usando una curva estándar que se generó a partir de
concentraciones conocidas de H2O2[25].
tabla 1
Cebadores utilizados para el análisis qRT-PCR.
Número de acceso Nombre del gen
Solyc03g078400 β-actina
solyc08g081690 RBOH1
solyc07g056570 NCED1
solyc08g016720 NCED2
Solyc03g118310 HIELO1
Solyc03g026280 CBF1
Biología y medicina de radicales libres 172 (2021) 286–297
2.9. Determinación de las concentraciones de ABA
Las hojas se homogeneizaron en tampón de fosfato de potasio 20 mM (pH
7.4) y las concentraciones de ABA se determinaron mediante ELISA competitivo
utilizando el kit de inmunoensayo ABA como se estandarizó previamente [26].
2.10. Medición de las concentraciones de prolina y azúcar soluble
Según Shan et al. [27], se extrajeron quinientos miligramos de hojas con
5 mL de ácido sulfosalicílico al 3% (p/v) durante 10 min a 100◦C. Luego, se
incubaron 2 mL del extracto acuoso con 2 mL de ácido acético glacial y 3 mL
de reactivo de ninhidrina ácida [ninhidrina al 2,5% (p/v), ácido acético glacial
al 60% (v/v) y ácido acético glacial al 40% 6 ácido fosfórico M (p/v)] a 100◦C
durante 30 min. Después de enfriar, la mezcla de reacción se repartió con 5
ml de tolueno y la absorbancia de la fase orgánica se determinó a 520 nm
por espectrofotometría UV. Los valores de absorbancia se cuantificaron
usando una curva estándar que se generó a partir de cantidades conocidas
de prolina. Las concentraciones de azúcar soluble se midieron como se
describió anteriormente [28].
2.11. análisis estadístico
Los valores se presentan como media±SE de tres repeticiones. Los análisis
estadísticos se llevaron a cabo mediante el software SAS. Las diferencias entre los
tratamientos se determinaron por las diferencias menos significativas enpag <0.05.
3. Resultado
3.1. La tolerancia al estrés por frío se puede inducir mediante el tratamiento de semillas con 75 W CP
Para investigar los efectos del tratamiento de semillas con CP en la tolerancia al
estrés por frío, tratamos las semillas de tomate WT con diferentes niveles de potencia de
CP de 25 a 100 W. Se observó un fenotipo de marchitamiento en las plántulas en
condiciones de baja temperatura (LT) y los estados de marchitamiento de hojas se
redujeron con 50–100 W CP de tratamiento de semillas en comparación con las plántulas
de control (Figura 2A). losFv/Fmetro, la fuga de iones y el índice de daños por frío han sido
respaldados como indicadores de evaluación efectivos para los daños causados por LT [
21]. Había poca diferencia deFv/Fmetroy fuga de iones entre los tratamientos de semillas
de control y CP en condiciones de temperatura normal (NT) (Figura 2B–E), que indicó que
el tratamiento de semillas CP es un método seguro
Cebador delantero (5'→3′) Cebador inverso (5'→3′)
CAGCAGATGTGGATCTCAAA CTTGTGGACAATGGAAGGAC
CGAAGCATTTCTCGCAAG TTGAGTCCACGAAGAGCCTT
AGGCAACAGTGAAACTTCCATCAAG TCCATTAAAGAGGATATTACCGGGGAC
TGGTTTTCATGGGACATTCATTAGC ATCTCCCTTCTCAACTCCCTATTCC
GCTCGCCTGTTTCTGGTAAC AAGAGTTGGCTGTGCTCCA
GAGTCGGAAGAAGTTTCAGG TGTAGGCATCAGTTTCCAC
288
K. Li et al.
tecnología para plantas de tomate dentro de 100 W. Imágenes de fluorescencia y valores
deFv/Fmetrodisminuyeron significativamente en la condición LT (Figura 2B y C). Sin
embargo, los tratamientos de semillas de 50–100 W CP inhibieron fuertemente la
reducción inducida por LT deFv/Fmetroen comparación con el tratamiento de control (
Figura 2B y C). Además, la fuga de iones y el índice de daño por frío aumentaron
significativamente en la condición LT (Figura 2D y E). Estos dos parámetros fueron mucho
más bajos en el tratamiento de semillas de 50–100 W CP que en el tratamiento de control
(Figura 2D y E). Estos resultados destacaron que el lapso manejable del tratamiento de
semillas CP puede usarse para mejorar la tolerancia al estrés por frío del tomate. El
tratamiento de semillas 75 W CP mostró el mejor efecto de mitigación del frío entre todos
los tratamientos, por lo que fue seleccionado para estudiar el mecanismo regulador en
capítulos posteriores.
3.2. H inducido por estrés por frío2O2la señalización se puede amplificar mediante el tratamiento
de semillas CP
Las ROS actúan como segundos mensajeros en las respuestas al estrés.11]. Debido a
los estrechos vínculos entre el tratamiento de semillas CP y la señalización de ROS en las
plantas [6], primero probamos el H2O2nivel (Fig. 3A). Bajo condición NT (0 h), el H2O2las
concentraciones de hojas de tomate en el tratamiento CP fueron significativamente más
altas que en el tratamiento de control. Durante 15 h, el H2O2
las concentraciones del tratamiento de control solo aumentaron significativamente a las 6 h
después del tratamiento LT. Sin embargo, la H2O2las concentraciones del tratamiento con CP
primero aumentaron significativamente a la hora, alcanzaron el pico a las 6 horas y luego
disminuyeron a niveles de NT a las 15 horas después del tratamiento con LT. El h2O2
las concentraciones del tratamiento con CP fueron significativamente más altas que las
del tratamiento de control durante todos los períodos evaluados. Estos resultados
implicaron que H2O2la señalización fue inducida por el estrés por frío, y el H mejorado2O2
la señalización fue más temprana, más fuerte y más duradera en el tratamiento con CP
que en el tratamiento de control en respuesta al estrés por frío.
Analizar los mecanismos moleculares subyacentes para el H inducido por
frío o CP2O2señalización, examinamos elRBOH1expresión y actividad de
RBOH. losRBOH1la expresión fue significativamente mayor en el tratamiento
con CP que en el tratamiento de control en condiciones de NT (0 h)
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Biología y medicina de radicales libres 172 (2021) 286–297
Figura 2.Evaluación de la tolerancia al estrés por
frío inducida por el tratamiento de semillas CP en
plántulas de tomate.(A)Morfología de plántulas de
tomate a baja temperatura (LT; 10/5◦C) condición.(
B)Imágenes representativas de la máxima
eficiencia fotoquímica de PSII en el estado
adaptado a la oscuridad (Fv/Fmetro) indicando
lesión fotooxidativa. El código de color falso que
se muestra a la derecha de la imagen varía de 0,0
(azul) a 1,0 (rojo).(C)Fv/Fmetro.(D) Fuga de iones.(
MI)Índice de daños por frío. En la etapa de cuatro
hojas, las plántulas de tomate se expusieron a
temperatura normal (NT; 25/18◦C) y condiciones
LT durante 6 d. La segunda y tercera hoja se
utilizaron como muestra para el análisis de datos.
Los datos representan las medias de tres
repeticiones±SE, y diferentes letras son
significativamente diferentes (pag <0,05). (Para la
interpretación de las referencias al color en la
leyenda de esta figura, se remite al lector a la
versión web de este artículo).
(Fig. 3B). Tanto en el control como en el tratamiento de CP, elRBOH1la expresión
se reguló significativamente por la condición LT de 1 a 6 h en comparación con la
condición NT; sin embargo, los niveles de ARNm deRBOH1fueron
significativamente mayores de 0 a 10 h en el tratamiento CP que en el tratamiento
de control (Fig. 3B). Para confirmar esto, medimos la actividad RBOH del control y
el tratamiento CP en condiciones NT y 6 h LT. La actividad de RBOH fue inducida
significativamente por los tratamientos LT o CP, que fue inducida aún más por
ambos tratamientos (Fig. 3C). Estos resultados indicaron que el estrés por frío
indujo H2O2la señalización se amplificó mediante el tratamiento de semillas CP a
través de la regulación de ARNm y niveles enzimáticos deRBOH1.
3.3. RBOH1 juega un papel positivo en la tolerancia al estrés por frío inducida por CP
ComoRBOH1-mediado H2O2fue inducida por el tratamiento de semillas con CP, luego
investigamos si esto estaba relacionado con la tolerancia al estrés por frío. Con este fin,
utilizamos un enfoque VIGS para construir plantas de tomate con silenciamientoRBOH1.
En comparación con las plantas pTRV de vector vacío (WT), el pTRV-RBOH1plantas (
RBOH1-) exhibieron una reducción de la tolerancia al estrés por frío tanto en el control
como en el tratamiento con CP mediante análisis de morfología (Figura 4A). En las
plantas WT, el tratamiento con CP mejoró significativamente laFv/Fmetro, redujo la fuga de
iones y el índice de daño por frío en condiciones LT (Figura 4SER). Sin embargo, CP-
enhancedFv/Fmetro, así como la fuga de iones reducida por CP y el índice de daño por frío
se inhibieron significativamente enRBOH1-plantas en condiciones LT, que alcanzaron
niveles de WT en el tratamiento de control (Figura 4SER).
Para confirmar la conclusión de queRBOH1y H2O2contribuyen a la tolerancia al
estrés por frío inducida por CP, utilizamos un enfoque químico para controlar la
actividad de RBOH y H2O2nivel. Bajo condición NT, aplicación exógena H2O2, h2O2
eliminador de dimetiltiourea (DMTU), inhibidor de RBOH difenilenoyodonio (DPI) o
DPI + H2O2tuvo pocos efectos enFv/ Fmetro, fuga de iones e índice de daños por frío
en los tratamientos de control y CP (Figura 5). En condiciones LT, la aplicación de H
2O2promovió la tolerancia al estrés por frío en el tratamiento de control, pero no
tuvo ningún efecto sobre la promoción adicional de la tolerancia al estrés por frío
en el tratamiento con CP (Figura 5). Mientras tanto,
K. Li et al. Biología y medicina de radicales libres 172 (2021) 286–297

plantas de tomate, es la enzima limitante de la velocidad en la biosíntesis de

ABA.19]. En condiciones de NT, CP indujo laNCED1transcripción y
acumulación de ABA en plantas WT, que se abolió enRBOH1-plantas (Figura
6). Mientras tanto, encontramos que el tratamiento con LT regulaba
notablemente la transcripción deNCED1yNCED2en hojas dentro de las 24 h,
lo que aumentó las concentraciones de ABA (Figura 6). Fue interesante notar
que silenciarRBOH1no influyó en dosNECDexpresión y concentraciones de
ABA en el tratamiento de control. Sin embargo, silenciarRBOH1disminuyó
significativamente la acumulación inducida por CP deNCED1ARNm y ABA en
comparación con los niveles de control en condiciones LT (Figura 6).
Además, la transcripción deNCED2fue solo respuesta a la condición LT, pero
no tratamiento CP o silenciamientoRBOH1en este estudio (Figura 6B). Estos
resultados sugirieron que CP regulaba al alza la transcripción deNCED1para
aumentar la acumulación de ABA en unRBOH1-De manera dependiente bajo
condición LT.
Para determinar aún más los roles deNCED1y señalización ABA, así como sus
enlaces cruzadosRBOH1en la tolerancia al estrés por frío inducida por CP,
utilizamos un enfoque VIGS para silenciarRBOH1tanto en plantas WT como en
mutantes de biosíntesis ABAnotabilisplantas (no; una mutación nula en el gen
NCED1de fondo AC; [19]). Bajo la condición de NT, hubo pequeñas diferencias deFv
/Fmetroy fuga de iones entre WT,no,RBOH1-yno/RBOH1-
plantas (Figura 7A, C), que indicó que la falta deNCED1,RBOH1o ambos genes no
causaron daño celular para la planta en condiciones normales. Según los índices
de lesión por LT en el tratamiento control (Figura 7), carenteNCED1oRBOH1
carácter sensible al frío causado; Entretanto, noLas plantas mostraron una
tolerancia al estrés por frío más débil queRBOH1-plantas. Es más,no/RBOH1-las
plantas disminuyeron aún más la tolerancia al estrés por frío en comparación con
nooRBOH1-plantas (Figura 7). Es importante destacar que la tolerancia al estrés
por frío solo mejoró con el tratamiento con CP en plantas WT, pero no aumentó en
no,RBOH1-ono/RBOH1-plantas (Figura 7). Estos resultados implicaron que ABA, al
menos en parte, actuó aguas abajo de RBOH1para participar en la tolerancia al
estrés por frío inducida por CP.

3.5. Diafonía entre RBOH1 y ABA en respuesta a la tolerancia al estrés por frío
inducida por CP

para analizar comoRBOH1y ABA participan en la tolerancia al estrés por frío

inducida por CP, examinamos la expresión de dos genes resistentes al frío, el
inductor de la expresión de CBF 1(HIELO1) y elFactor de unión 1 del elemento
sensible a la deshidratación/repetición C(CBF1). En condiciones NT, las plántulas
tratadas con CP mostraron una alta transcripción deHIELO1yCBF1en plantas WT,
que fue abolido enno,RBOH1-ono/RBOH1-plantas (Figura 8). Aunque la condición
Fig. 3.Efectos oF Semilla de 75 W CPtrato tamiento y baja temperatura (LT; 10/5◦C) en LT aumentó la expresión deHIELO1yCBF1en las cuatro plantas de genotipo, los
(A)peróxido de hidrógeno (H2O2) concentraciones,(B)RBOH1expresión y(C) actividad de aumentos fueron mucho menores ennoyRBOH1-plantas, especialmente enno/
RBOH. En la etapa de cuatro hojas, las plántulas de tomate se expusieron a temperatura RBOH1-plantas (Figura 8). Es importante destacar que la falta deNCED1, RBOH1o
normal (NT; 25/18◦C) y condiciones LT durante 15 h. La segunda y tercera salidas a las 0, ambos dos genes inhibieron la expresión inducida por CP deHIELO1y CBF1
1, 3, 6, 10, 15h después del tratamiento con LP se utilizaron como muestra para H2O2 completamente (Figura 8). Estos resultados sugirieron que CP amplificó la
concentraciones yRBOH1análisis de expresión, y la segunda y tercera hojas a las 6 h después del
señalización resistente al frío a través deRBOH1y vía de enlaces cruzados ABA.
tratamiento con LP se usaron como muestra para el análisis de actividad de RBOH. Los datos
El azúcar soluble y la prolina son dos tipos de materiales de ajuste osmótico
representant la media de tres repeticiones±SE, y diferentes letras son significativamente
que disminuyen la pérdida de agua y el punto de congelación para mejorar la
diferentesiF
(pag <0,05).
tolerancia a la sequía y al estrés por frío en las plantas.30]. Tanto el tratamiento de
CP como la manipulación genética deNCED1yRBOH1tuvo poco efecto sobre las
yo
i
Aplicación de DMTU y DPI completayo y negó los efectos protectores de CPAGS
concentraciones de azúcar soluble en condiciones NT (Figura 9A). Los niveles de
-tolerancia al estrés por frío inducida (Figura 5). Además,a aplicación de DPI+ H2O2
prolina eran mucho más altos ennoyno/RBOH1-plantas que en las plantas WT en
mostró características similares a las del simulacro en bot h control y tratamiento
el tratamiento de control en condiciones NT (Figura 9C). Aunque el nivel de prolina
CP (Figura 5). Con base en estas evidencias genéticas y fisiológicas, especulamos
aumentó con el tratamiento con CP en las plantas WT, no pudo mejorarse más con
que el tratamiento de semillas CP indujo tolerancia al estrés por frío a través detu
el tratamiento con CP ennoyno/RBOH1-plantas (Figura 9C). Los niveles tanto de
ghRBOH1-metroedición ado H2O2vía de señalización.
azúcar soluble como de prolina aumentaron en condiciones LT; sin embargo, los
aumentos fueron mucho menores enno,RBOH1-ono/RBOH1-
3.4. CP induce la biosíntesis de ABA a través de la vía RBOH1 para mejorar la plantas en comparación con las plantas WT (Figura 9B, D). Aunque los
tolerancia al estrés por frío niveles de azúcar soluble y prolina fueron significativamente inducidos por
el tratamiento con CP en plantas WT, este efecto fue abolido por completo
Ácido abscísico ( ABA) pl ays un ro le en m Ediando el estrés por frío enno,RBOH1-o no/RBOH1-plantas (Figura 9B, D). Estos resultados sugirieron
tolerancia en plantapero importante sique ta parte en CP- oRBOH1-inducido que CP indujo laRBOH1y red reticulada ABA para acumular los materiales de
defensa rerespuesta es desconocido propio [29]. el 9- Ces-epox ycarotenoide dioxi- ajuste osmótico frente a la condición LT.
genasa (N whola h como dos familias gen ly
SECCIÓN DE LA ECONOMÍA), ED1yNCED2en
s deCAROLINA DEL NORTE Actividades de SOD y CAT de WT ynolas plantas fueron significativamente

290
K. Li et al. Biología y medicina de radicales libres 172 (2021) 286–297

Figura 4.Efectos interactivos del tratamiento de semillas

CP y RBOHsobre la tolerancia al estrés por frío.(A)
Morfología de plántulas de tomate a baja temperatura (LT;
10/ 5◦C) condición.(B)Imágenes representativas de la
máxima eficiencia fotoquímica de PSII en el estado
adaptado a la oscuridad (Fv/Fmetro) indicando lesión
fotooxidativa. El código de color falso que se muestra a la
derecha de la imagen varía de 0,0 (azul) a 1,0 (rojo).(C)Fv/F
metro.(D)Fuga de iones.(MI)Índice de daños por frío. En la
etapa de cuatro hojas, las plantas pTRV de vector vacío
(WT) y pTRV-RBOH1plantas (RBOH1-) fueron expuestos a
temperatura normal (NT; 25/18◦C) y condiciones LT
durante 6 d. La segunda y tercera hoja se utilizaron como
muestra para el análisis de datos. Los datos representan
las medias de tres repeticiones±SE, y diferentes letras son
significativamente diferentes (pag < 0,05). (Para la
interpretación de las referencias al color en la leyenda de
esta figura, se remite al lector a la versión web de este
artículo).

mayor en el tratamiento CP que en el tratamiento de control en condiciones NT ( tratamiento.

Figura 10A,E). Sin embargo, este efecto fue significativamente inhibido en RBOH1-
ono/RBOH1-plantas (Figura 10A,E). También se mostraron tendencias similares en 4. Discusión
la condición LT (Figura 10B, F), que indicó que CP regulaba las actividades de SOD
y CAT dependiendo deRBOH1vía de señalización. Mientras tanto, tanto el Debido a la amplia gama de aplicaciones en un sistema biológico, la tecnología CP ha
tratamiento de CP como la manipulación genética deNCED1y RBOH1tuvo poco recibido una enorme atención. Todos los sistemas de generación de CP tienen en común
efecto sobre las actividades de APX en condiciones de NT (Figura 10C). Sin una fuente de alimentación, un gas de alimentación y la presión utilizada durante la
embargo, las actividades de APX inducidas por CP se inhibieron significativamente generación de plasma (presión atmosférica o baja presión al vacío). Estudios previos
enno, RBOH1-ono/RBOH1-plantas en condiciones LT (Figura 10D), que sugería que demostraron que el crecimiento estimula [31], antisenescencia [18], eficacia
CP regulaba las actividades de APX dependiendo tanto deRBOH1 y vía de antimicrobiana [32], y resistencia a la sequía [6] del tratamiento de CP puede variar si hay
señalización ABA. un aumento o disminución de potencia/voltaje. En este estudio, observamos que el mejor
efecto se produce en 75 W durante 10 s. Los gases de alimentación comunes utilizados
para los sistemas de generación de CP contienen aire, aire modificado (p. ej., una mezcla
3.6. Evaluación del período de validez de la tolerancia al estrés por frío inducida por CP
de aire y gas helio en el presente estudio) o algunos otros gases nobles (p. ej., argón,
hexafluoruro de azufre, etc.) [33]. Aunque no comparamos los diferentes efectos de
Aunque los datos anteriores han demostrado que el tratamiento de semillas con CP tiene un
varios gases de alimentación para la tolerancia al estrés por frío inducido por CP, Basaran
efecto positivo en la mejora de la tolerancia al estrés por frío en las plántulas de tomate, también
et al. [34] han proporcionado la evidencia de que el uso de la mezcla de hexafluoruro de
queremos saber si la efectividad del tratamiento con CP cambiará con la extensión de la edad de
azufre y argón como gas de alimentación fue más efectivo que el aire para el control de
las plántulas o el tiempo de almacenamiento de las semillas. Para obtener esta conclusión,
hongos. Sin embargo, considerando el costo y la manipulación, el aire o el aire
probamos elFv/Fmetrode plantas de control y tratadas con CP con diferentes edades de plántulas
modificado es el gas de alimentación más utilizado para aplicaciones comerciales. En
en condiciones LT. Descubrimos que la tolerancia al estrés por frío mejoró con el aumento de la
comparación con la presión atmosférica, las ventajas de la baja presión incluyen un alto
edad de las plántulas a través de la Fv/Fmetroprueba (Figura 11A). Sin embargo, el tratamiento con
rendimiento energético y precisión debido a la alta pureza del plasma [35]. Por lo tanto,
CP aumentó significativamente la Fv/Fmetroen plántulas de 10 a 40 días de edad en comparación
agregamos un poco de gas helio a 130 Pa para crear una condición de aire modificada y
con el tratamiento de control (Figura 11A). No hubo diferencia deFv/Fmetroen plántulas de 50 o 60
de baja presión para un mejor efecto, que no tuvo ningún efecto adverso en la salud de
días de edad entre el control y el tratamiento con CP (Figura 11A). A continuación, probamos la
las semillas.
influencia del tiempo de almacenamiento de las semillas después del tratamiento con CP en la
activación de la tolerancia al estrés por frío. losFv/Fmetrode plántulas de 20 días de edad en el
Sistema de plasma directo, gustando nuestro sistema CP (Figura 1A), se basa en que
tratamiento CP disminuyó gradualmente con la extensión del tiempo de almacenamiento, que
se genera CP entre una superficie dieléctrica que contiene un electrodo, con las semillas
llegó a los niveles de control al sexto mes después del almacenamiento de la semilla (Figura 11B).
de tomate actuando como un segundo electrodo (Figura 1B), proporcionando así un
Estos resultados evidenciaron que la tolerancia al estrés por frío inducida por CP podría
contacto directo de las semillas de tomate con el plasma. La capa más externa de la
mantenerse durante aproximadamente 40 días en la etapa posterior de la plántula o
semilla de tomate es el epispermo, que tiene un pelo fuerte y grueso como
aproximadamente 3 meses de vida útil después de la CP.

291
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Figura 5. yo errar
Nuevo cinco efectos de semilla CP tres
Testamento ent y H2
Cajero automático O2s encendido en frio
estrés ance. (A)el ellos axima um ph otochemieffi cal ciency de PSII en la oscuridad-
más viejo

adaptadoS t ami (Fv/Fmetro).(B)yonorte fuga.( C) relajándosej urioen dex. En la etapa de

cuatro hojas, agua (simulacro), 100 μM H2O2, 100 μM DMTU, 100 μM DPI y 100 μM H2O2+
100 μM DPI por plantas de tomate tratadas fueron expuestas a temperatura normal (NT;
25/18◦C) y baja temperatura (LT;1 0/5◦C) condiciones para 6 d. La segunda y tercera hoja
se utilizaron como muestra para el análisis de datos. Los datos representan las medias de
tres repeticiones±SE, y diferentes letras son significativamente diferentes (pag <0,05).

estructura. El plasma directo puede dañar lael e pisperma durante el tratamiento,

corriente. T-flo fue a través de h
the semillas, w hola como se ha shocasarse para mejorar
Figura 6.Efectos interactivos del tratamiento de semillas CP yRBOHen la biosíntesis de ABA.
el agua opción una di mejorar CP - ind tuvo que reaccionar he acceso material
abdominales
(A)Expresión relativa deNCED1.(B)Expresión relativa deNCED2.(C)concentraciones de
posibilidad de la embrión [6 ]. S o, CP-principal En g es usualmente máse efectivo que
ABA. En la etapa de cuatro hojas, las plantas pTRV de vector vacío (WT) y pTRV- RBOH1
químicayo -pagsborde ing oph y siccebado soloy. El di re ct ssistema proporciona plantas (RBOH1-) fueron expuestos a temperatura normal (NT; 25/18◦C) y condiciones LT
⋅- .
alta c una vezmintraciones deR (Oh, oh3 , oh 2 , OS.S2 O2, etc.) y RNS (NO,
sistema operativo
durante 24 h. La segunda y tercera hoja se utilizaron como muestra para el análisis de
NO2, norte O3, etc.) , y relajar asesdébil radio ación un t the prsitio de producción a
ultravioleta datos. Los datos representan las medias de tres repeticiones±SE, y diferentes letras son
el a estera o seeds-sur cara miund emb ryo, definitiva En p
hysilógico, meta-
resolución significativamente diferentes (pag <0,05).
bólico, epigenético y genéticot cambios ic [36,37]. Aunque la activación de la
resistencia de amplio espectro se ha informado mediante el tratamiento de CP o la Condición LT. Varias líneas de evidencia indicaron que el NO o H exógeno2O2puede
aplicación exógena de materiales de ROS, RNS y UV generados por CP en varias inducir la acumulación endógena de ROS, que se dirige al sistema de defensa celular
plantas, se sabe poco sobre el mecanismo más profundo, especialmente a nivel contra el estrés abiótico o biótico.38–40]. Para estudiar el mecanismo de los cambios
genético. positivos por el tratamiento con CP, primero analizamos el H endógeno2O2homeostasis
El tratamiento de semillas con CP induce tolerancia al estrés por frío en las plantas, El tratamiento con CP mostró niveles más altos de H2O2en la etapa de plántula con
principalmente dependiendo de la señalización de ROS. Aquí, analizamos marcadores respecto al control no solo en condición NT sino también en condición LT. En las plantas,
morfológicos y fisiológicos para evaluar CP - ind resfriadot tolerancia al estrés en el los RBOH juegan un papel clave en la red de producción de ROS.41]. Al buscar en las
la semillags tage de las plantas de tomate. se En tratamiento CP, la mayoría de las plántulas bases de datos NCBI y SOL UniGene, seis de ochoRBOHLos genes tienen soportes de
mantuvo firmey recta con mayorFv /Fmetro . y bajo er yo sobre fugas y cDNA de longitud completa.42]. Por lo tanto, probamos los niveles de ARNm de todos
relajándose omcomparado conC ontroyo Estos son
jurado índice como c ha propuesto que resultado
RBOHgenes familiares (datos no mostrados); sin embargo, soloRBOH1fue
tratamiento de CP ent r un olism y esos r júbilo ed señalización a
puede que noaparejo mi Licenciatura enpestaña
ca
significativamente regulado por el tratamiento con CP (ver el punto de 0 h enFig. 3B), que
disminuir seCellular wa ter
o l ss, cual pasto ds a mejor verdling crecimiento bajo fue

292
K. Li et al. Biología y medicina de radicales libres 172 (2021) 286–297

Figura 7.Efectos interactivos del tratamiento de semillas

CP, RBOHy señalización ABA sobre la tolerancia al estrés
por frío. (A y B)La máxima eficiencia fotoquímica de PSII
en el estado adaptado a la oscuridad (Fv/Fmetro).(C y D)
Fuga de iones.(E y F)Índice de daños por frío. En la etapa
de cuatro hojas, las plantas pTRV de vector vacío (WT), el
mutante de biosíntesis ABAnotabilisplantas (no), el pTRV-
RBOH1plantas (RBOH1-), y pTRV- RBOH1 noplantas (no/
RBOH1-) fueron expuestos a temperatura normal (NT;
25/18◦C) y condiciones LT durante 6 d. La segunda y
tercera hoja se utilizaron como muestra para el análisis de
datos. Los datos representan las medias de tres
repeticiones±SE, y diferentes letras son significativamente
diferentes (pag <0,05).

Figura 8.Efectos interactivos del tratamiento de semillas CP,RBOHy señalización ABA en la transcripción de genes resistentes al frío.(A y B)El inductor de la expresión de CBF 1 (HIELO1).
(C y D)El factor de unión 1 del elemento sensible a la repetición C/deshidratación (CBF1). En la etapa de cuatro hojas, las plantas pTRV de vector vacío (WT), el mutante de biosíntesis ABA
notabilisplantas (no), el pTRV-RBOH1plantas (RBOH1-), y pTRV-RBOH1 noplantas (no/RBOH1-) fueron expuestos a temperatura normal (NT; 25/18◦C) y condiciones LT durante 24 h. La
segunda y tercera hoja se utilizaron como muestra para el análisis de datos. Los datos representan las medias de tres repeticiones±SE, y diferentes letras son significativamente
diferentes (pag <0,05).

también respaldado por análisis enzimático. Estudios recientes revelaron que el
tomateRBOH1, con un patrón de expresión constitutivo, jugó un papel importante
en la tolerancia cruzada al estrés inducido por la aclimatación a través de H
apoplásico2O2producción [dieciséis,40,43]. Por lo tanto, conjeturamos que tal vez
el único promotor constitutivo deRBOH1podría transmitir la señalización de CP
desde el embrión hasta la plántula entera. Aunque las ROS y RNS exógenas
pueden inducir laRBOHtranscripción o actividad enzimática, sus efectos suelen ser
a corto plazo.44]. En este estudio, inducida por CP
sobre regulación deRBOH1se puede conservar durante al menos 20 d. Tal vez el tratamiento de
semillas de CP puede causar micro daños en las células del embrión, lo que genera un efecto de
memoria a través de la metilación del ADN [45].
además de h2O2, ABA ha sido bien establecido como un papel positivo en la
tolerancia al estrés por frío [46]. Se ha demostrado que ABA puede desencadenar
las transcripciones deRBOHpara producir H2O2en el apoplasto [40, 47]. Por el
contrario, diferentes fuentes de ROS pueden mejorar el nivel de ABA en las
plantas. Cuando las Arabidopsis fueron expuestas a un alto estrés lumínico, las

293
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Figura 9.Efectos interactivos del tratamiento de semillas CP,RBOHy señalización ABA en concentraciones de(A y B)azúcar soluble y(C y D)prolina. En la etapa de cuatro hojas, las plantas
pTRV de vector vacío (WT), el mutante de biosíntesis ABAnotabilisplantas (no), el pTRV-RBOH1plantas (RBOH1-), y pTRV-RBOH1 noplantas (no/RBOH1-) fueron expuestos a temperatura
normal (NT; 25/18◦C) y condiciones LT durante 24 h. La segunda y tercera hoja se utilizaron como muestra para el análisis de datos. Los datos representan las medias de tres
repeticiones±SE, y diferentes letras son significativamente diferentes (pag <0,05).

Figura 10.Efectos interactivos del tratamiento de

semillas CP, RBOHy señalización ABA sobre las
actividades de la enzima antioxidante.(A y B)
Superóxido dismutasa (SOD).(C y D)Ascorbato
peroxidasa (APX).(E y F)Catalasa (CAT). En la etapa de
cuatro hojas, las plantas pTRV de vector vacío (WT), el
mutante de biosíntesis ABAnotabilisplantas (no), el
pTRV- RBOH1plantas (RBOH1-), y pTRV-RBOH1 no
plantas (no/RBOH1-) fueron expuestos a temperatura
normal (NT; 25/18◦C) y condiciones LT durante 24 h. La
segunda y tercera hoja se utilizaron como muestra
para el análisis de datos. Los datos representan las
medias de tres repeticiones±SE, y diferentes letras
son significativamente diferentes (pag <0,05).

H endógeno2O2y ABA se acumularon cooperativamente [48]. Zhou et al. [40]
encontró que la biosíntesis de ABA se incrementó por ROS inducida por paraquat
en hojas de tomate. Mientras tanto, el paraquat no logró mejorar el nivel de ABA
en tomateRBOH1-plantas silenciadas, lo que sugiere el papel mejorado de H2O2en
la biosíntesis de ABA [40]. El tomateNCED1 yNCED2Se sabía que estaban
principalmente involucrados en la biosíntesis de ABA. Cuando un gen se desactiva,
otro miembro de la familia puede asumir su función.49]. En el presente estudio,
encontramos que los niveles de ABA fueron inducidos por el tratamiento con CP
mediante la activación delNCED1transcripción, pero
fueron significativamente inhibidos por el silenciamientoRBOH1en plantas de tomate (
Figura 6). Sin embargo, las transcripciones inducidas por LT deNCED1yNCED2, así como
la acumulación de ABA no fueron influenciados por el silenciamientoRBOH1 (Figura 6), lo
que implicaba que no sóloRBOH1-mediado H2O2la señalización, pero también múltiples
vías de señalización ABA, son una respuesta a la condición LT.
El presente estudio sugiere una conclusión novedosa de que H2O2está involucrado
en la tolerancia al estrés por frío inducida por CP, lo que mejoró la acumulación de ABA
para mejorar aún más la resistibilidad (Figura 12). Hay principalmente cuatro puntos de
evidencia para sugerir esta conclusión. Primero, inducido por CPRBOH1

294
K. Li et al.
Figura 11.Evaluación del período de validez de la tolerancia al estrés por frío inducida por el
tratamiento de semillas CP en plántulas de tomate utilizando la máxima eficiencia fotoquímica de
PSII en el estado adaptado a la oscuridad (Fv/Fmetro) como lesión fotooxidativa.(A) Cuando las
plántulas de tomate llegaron a los 10, 20, 30, 40, 50 y 60 días de edad, se expusieron por
separado a baja temperatura (LT; 10/5◦C) condición para 6 d. La segunda y tercera hoja se usaron
como muestra paraFv/Fmetrodeterminación.(B)Las semillas de tomate se trataron con 75 W CP.
Luego, estas semillas tratadas con CP se almacenaron a 4◦C para 0, 1, 3, 6, 9, 12 meses. Se
germinaron tanto las semillas de control como las almacenadas, y las plántulas de 20 días de
edad se expusieron a condiciones LT durante 6 días. La segunda y tercera hoja se usaron como
muestra paraFv/Fmetrodeterminación. Los datos representan las medias de tres repeticiones±SE, y
diferentes letras son significativamente diferentes (pag <0,05).
Figura 12.Modelo propuesto para tolerancia al estrés por frío inducido por CP.
295
Biología y medicina de radicales libres 172 (2021) 286–297
transcripción, actividad enzimática y H2O2nivel se han producido en condiciones
NT, que se mejoró aún más en la etapa inicial de la condición LT (Fig. 3). Segundo,
silenciarRBOH1por VIGS, barrido de H2O2por DMTU, o la inhibición de la actividad
enzimática de RBOH por DPI abolió la tolerancia al estrés por frío inducida por CP,
que puede recuperarse en la prueba de compensación de H exógeno2O2(higos. 4 y
5). En tercer lugar, los cambios en los niveles de ABA inducidos por CP estaban
estrechamente relacionados con los cambios en H2O2niveles; mientras tanto, el
silenciamiento deRBOH1abolió la acumulación de ABA potenciada por CP pero no
influyó en las concentraciones de ABA inducidas por LT (Figura 6). Cuarto, la falta
deRBOH1(RBOH1-) oNCED1(no) disminución de la tolerancia al estrés por frío
inducido por CP en diferente grado; y doble falta deRBOH1 yNCED1(no/RBOH1-)
mostró caracteres sensibles al frío más fuertes que enRBOH1-onoplantas.
Como principal regulador de la aclimatación al frío,HIELO1yCBF1han sido
aisladas e identificadas de varias plantas. ICE1 que puede unirse directamente a
unoMI Celemento deCBFpromotores es reconocido como la corriente arriba de
CBFpara comenzar sus transcripciones [50].HIELO1yCBF1Se ha sugerido
constantemente que participen en la inducción de varios genes sensibles al estrés
oxidativo y en la acumulación de materiales de ajuste osmótico para proteger las
plantas de tomate transgénicas del estrés por frío.2,51]. En el presente,
encontramos que la expresión inducida por CP o LT deHIELO1yCBF1 mostraron
patrones de expresión similares y dependían en parte de ABA y H2O2señalización (
Figura 8). Además, los niveles de azúcar soluble y prolina (Figura 9), así como
actividades de SOD, APX y CAT (Figura 10), que mejoraron la capacidad de
aclimatación al frío, también se correlacionaron positivamente con el patrón de
expresión deHIELO1yCBF1. Los niveles transcripcionales de la Δ-pirrolina-5-
carboxilato sintetasa (P5CS) gen, que codifica una enzima clave en la biosíntesis de
prolina, se sobrerregularon de 2 a 7 veces en elHIELO1-sobreexpresión de plantas
con o sin estrés, lo que resulta en niveles más altos de prolina [51,52]. Además, la
transcripción de P5CS2y los niveles de prolina aumentaron mucho en transgénicos
Arabidopsisplantas expresandoCBF3[53]. Estos resultados indicaron que RBOH1
-mediado H2O2yNCED1-mediado por ABA podría actuar como la estación de
intercambio de señalización clave para activar la tolerancia al estrés por frío
inducida por CP a través deHIELO1yCBF1ruta. Aunque no se puede usar evidencia
genética para sugerir que ABA y H2O2actuando como aguas arriba deHIELO1y
CBF1vía de señalización, se podrían obtener algunos resultados indirectos para
apoyar nuestra conclusión. En primer lugar, ABA yRBOH1-mediado H2O2Se ha
demostrado que son inducidos por la aclimatación al frío y están involucrados en
la tolerancia al frío de las plantas de tomate.43,54,55]. En segundo lugar, en
transgénicosArabidopsiscon constitutivamente expresadoHIELO1por el promotor
CaMV 35S, las transcripciones deCBFy otros genes inducidos por el frío, así como
el frío
K. Li et al.
la tolerancia al estrés no puede mejorarse sin una aclimatación preliminar al frío [
56]. En tercer lugar, las transcripciones deHIELO1yCBF1puede ser inducida por
ABA o estrés oxidativo [57].
Hasta ahora, se puede utilizar poca información para evaluar el período de validez
del efecto de estimulación biológica inducido por CP. Aunque algunos estudios han
observado que el tratamiento de semillas con PC promueve el crecimiento y el
rendimiento de la planta durante todo el ciclo de vida, no pueden garantizar que los
efectos útiles provengan de la estimulación temprana del crecimiento de las plántulas o
de cambios posteriores en el metabolismo fisiológico y bioquímico.37,58]. Bajo la
presente condición experimental, sugerimos que la tolerancia al estrés por frío inducida
por CP se mantuvo durante aproximadamente 40 días en la etapa posterior de la plántula
o aproximadamente 3 meses de vida útil después del tratamiento con CP. Sin embargo, si
reducimos la potencia del tratamiento y extendemos el tiempo de tratamiento, el cambio
de efectos estimulantes y el período de validez también deben estudiarse en una futura
aplicación comercial. Además, debido a los roles de RBOH1-mediado H2O2yNCED1La
señalización ABA mediada por ABA en la tolerancia al estrés abiótico, el presente estudio
implica que la tecnología de tratamiento de semillas CP podría usarse para inducir no
solo tolerancia al estrés por frío, sino también otra tolerancia al estrés de amplio
espectro de sequía, sal, osmótico, oxidativo, UV, etc. en.
5. Conclusión
Este estudio evalúa varias modulaciones de la tolerancia al estrés por frío en
plántulas de tomate de diferentes genotipos (WT,no,RBOH1-, yno/ RBOH1-) en los
niveles morfológicos, fisiológicos, bioquímicos, moleculares y genéticos
desencadenados por el tratamiento de semillas CP y trata de vincular estos
eventos. Como se muestra enFigura 12, cuando las semillas de tomate se exponen
al tratamiento con CP, reacciones físicas y químicas complicadas de gas neutro,
gas ionizado, moléculas excitadas de ROS y RNS, electrones y partículas cargadas
positivamente generarán y estimularán el embrión. Luego, este efecto de
"adaptación al estrés" se puede registrar por un corto tiempo, qué actividades
RBOH1tanto en el ARNm como en los niveles enzimáticos para generar H2O2
señalización. El H inducido por CP2O2amplifica la señalización resistente al frío a
través de la regulación ascendenteNCED1-acumulación mediada por ABA. Como
reguladores centrales resistentes al frío, las transcripciones deHIELO1yCBF1 se
activan por H inducida por CP2O2y la red de señalización ABA, que se enfoca en el
ajuste osmótico y el sistema antioxidante para mejorar la tolerancia al estrés por
frío en las plántulas de tomate. Sin embargo, hasta ahora no está claro cómo las
plantas recuerdan el efecto de "adaptación al estrés" del tratamiento con CP.
Además, es necesario realizar estudios a nivel epigenético para una mejor
comprensión de los efectos del tratamiento de semillas CP en las plantas.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias
Naturales de China (U1903105 y 31872943); Fundación Provincial de Ciencias
Naturales de Shandong, China (ZR2019MC067); Proyecto mejorado de
ingeniería de demostración de ciencia y tecnología "Bohai Granary" de
Shandong (2019BHLC005).
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