1

2
 1. CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

INTRODUCCION

Se le llama Cultivo de Tejidos Vegetales (CTV) al conjunto de técnicas que

permiten el establecimiento, mantenimiento y desarrollo de cualquier parte de una
planta, desde una célula hasta un organismo completo, bajo condiciones artificiales,
axénicas y controladas

El CTV es una herramienta invaluable para la resolución de problemas básicos

y aplicados en la biología vegetal, ya que por una parte ofrece una serie de sistemas
modelo ideales para la investigación fisiológica, bioquímica, genética y estructural, y
por otro lado tiene una aplicación práctica en la clonación, conservación y
manipulación in vitro de cualquier material vegetal.

Los principios básicos del CTV fueron definidos a principios del siglo XX por
Haberlandt (1902), Hanning (1904), Küster (1909) y otros investigadores, pero fue
hasta mediados del siglo cuando White (1943 y 1963) y Gautheret (1934, 1942)
desarrollaron las bases en que se fundamentan los métodos actuales (Hurtado y
Merino 1987, Endress 1994). Los primeros trabajos en este campo tuvieron por lo
general un éxito limitado, debido a tres factores fundamentales. El primero de ellos era
el desconocimiento de los requerimientos nutricionales de los tejidos vegetales
cultivados in vitro; el segundo, era el uso frecuente de tejidos vegetales maduros y bien
diferenciados para iniciar los cultivos. Estos tejidos, como se sabe actualmente, son
los que muestran una menor capacidad de respuesta al cultivo in vitro. Finalmente, el
tercer factor que retardó el desarrollo de las técnicas de CTV fue la ignorancia de la
existencia y del papel que juegan en el desarrollo vegetal las llamadas fitohormonas o
reguladores del crecimiento. Estas substancias eran desconocidas hasta 1928 cuando
Went y Thimann descubrieron el ácido Indolacético (AIA), y 1955 cuando Skoog
descubrió la cinetina (CIN). En 1957 Skoog y Miller fueron los primeros que
consiguieron manipular la formación in vitro de brotes, raíces y tejido calloso mediante
el uso de diferentes combinaciones de una auxina (AIA) y una citocinina (CIN). Otro
de los pasos fundamentales para la consolidación de las técnicas de CTV lo dieron en
1962 Murashige y Skoog al desarrollar un medio de cultivo (MS) que reunía las
características apropiadas para ser utilizado en el cultivo de una gran variedad de
tejidos de diferentes especies vegetales; dicho medio de cultivo sigue utilizándose de
manera rutinaria en innumerables trabajos que se realizan actualmente (Murashige y
Skoog 1962). Los avances antes mencionados dieron un auge importante al CTV, a
tal grado que en 1963 se organizó ya el Primer Congreso Internacional de Cultivo de
Tejidos Vegetales. A pesar de esto, el desarrollo de estas técnicas continuó siendo
relativamente lento hasta finales de los años 70 y principios de los 80 en que se logró
la consolidación definitiva del CTV en el campo de la investigación en biología vegetal
y se comenzó con su uso directo en cuestiones aplicadas como la micropropagación,
la generación de plantas libres de enfermedades y la conservación de germoplasma
in vitro. A mediados de los años 80 el CTV tomó una importancia aun mayor al

3
contribuir al nacimiento de la ingeniería genética de plantas, junto con la cual integra
lo que hoy en día se conoce como biotecnología vegetal.

TIPOS DE CULTIVOS DE TEJIDOS VEGETALES

En la actualidad, se practican varios tipos de cultivos de tejidos vegetales que

varían en mayor o menor grado entre ellos. A continuación se mencionan y definen los
más importantes:

1. Cultivo de plantas completas. En este caso se trabaja con individuos completos,

aunque cultivados bajo condiciones artificiales. Algunos ejemplos de su uso lo son
las fases finales de la micropropagación, cuando se tienen plantas completas y se
está en espera de su crecimiento o adaptación para ser transferidas a suelo, o bien
cuando estas son mantenidas in vitro para ser utilizadas como fuente de tejidos
axénicos para el establecimiento de otros tipos de cultivos o para la transformación
genética.
2. Cultivo de órganos. Esta modalidad del cultivo in vitro se refiere al cultivo de
órganos vegetales aislados. Por ejemplo, el cultivo de raíces normales o
transformadas con Agrobacterium rhizogenes para la producción in vitro de
metabolitos de interés. Otro caso es el cultivo de embriones. Los embriones
aislados, ya sean maduros o inmaduros pueden ser cultivados in vitro con varios
fines; por ejemplo, el lograr su desarrollo para obtener plantas completas o bien el
generar a partir de ellos otros tipos de tejido como callo embriogénico o bien el
tejido organogénico. En algunas especies de coníferas, es muy difícil iniciar cultivos
in vitro a no ser que se parta de un embrión como explante inicial. También es
posible el cultivo de anteras y óvulos. Estas son técnicas utilizadas para la
regeneración de plantas haploides, las cuales tienen una aplicación importante en
el campo del fitomejoramiento.
3. Cultivo de tejidos o segmentos de órganos. Dentro de esta categoría se
encuentra el cultivo de tejido calloso. Este se refiere al mantenimiento in vitro de
masas celulares no diferenciadas, llamadas callos o tejido calloso. Este tipo de
tejido tiene innumerables aplicaciones en estudios de tipo fisiológico, bioquímico,
genético, producción de compuestos secundarios, y para la generación de
variación genética en los cultivos. Por otro lado, es frecuente el cultivo de
segmentos de órganos (hoja, tallo, raíz, etc.) con el fin de inducir la formación de
tejido calloso o la regeneración de plantas completas a partir de los mismos.
4. Cultivo de células. Un primer tipo de cultivo de células es el cultivo de células en
suspensión. En este caso se cultivan células aisladas o pequeños acúmulos no
diferenciados de células, lo cual se realiza en un medio liquido bajo agitación
continua. Este cultivo es ideal para estudios fisiológicos a escala celular, para la
producción in vitro de metabolitos de interés o bien para la selección in vitro de
variantes deseables. Un segundo tipo de cultivo de células vegetales es el cultivo
de protoplastos, los cuales son células vegetales desprovistas de pared celular. La
eliminación de la pared celular puede hacerse por medios físicos o más
comúnmente utilizando enzimas hidrolíticas. Los protoplastos se obtienen y cultivan
para su aplicación en ciertas técnicas como son la fusión, la clonación celular,
microinyección y electroporación. En algunas especies es posible regenerar

4
 plantas completas a partir de un solo protoplasto. Por último, es posible también el
cultivo de células gaméticas aisladas con el fin de obtener tejidos o plantas
haploides.
5. Cocultivo. Se le da este nombre al cultivo de cualquier tejido vegetal junto con otro
organismo, generalmente un microorganismo. Se utiliza, por ejemplo, para la
transformación genética de tejidos vegetales con el sistema de Agrobacterium
tumefaciens o A. rhizogenes. Los tejidos vegetales cultivados in vitro también
pueden ser inoculados con virus o infectados con nemátodos y de esta manera
servir como modelo para el estudio de dichos patógenos.

PRINCIPIOS BASICOS DEL CTV

El CTV se basa en tres principios básicos, de cuya comprensión y manipulación

depende el éxito o fracaso de cualquier trabajo en este campo. Los principios básicos
son los siguientes:

 Elección del explante. Se le llama explante al órgano, tejido o segmento de tejido

vegetal que va a ser utilizado para iniciar el cultivo. Este puede ser una semilla, un
embrión aislado, un segmento de hoja, de tallo, de cotiledón, de raíz o de órganos
reproductores entre otros. En teoría, cualquier segmento de tejido vegetal que
contenga células vivas puede ser utilizado como explante. Sin embargo, debe
tenerse siempre en cuenta que el tipo de explante que se elija será determinante
para la obtención de la respuesta deseada, ya que cada uno de ellos responderá o
se comportará de manera diferente al cultivo. Por regla general, entre más joven y
menos diferenciado sea un tejido, más fácil será su adaptación y respuesta al cultivo
in vitro. Otro hecho a considerar es el que el aislamiento de un fragmento de tejido
vegetal para ser cultivado en condiciones artificiales lleva implícito el cese de sus
relaciones con otros órganos, tejidos y células de la planta completa. Estas
relaciones deben ser de alguna manera compensadas por el medio y las
condiciones de cultivo.
 Elección del medio y condiciones de cultivo. El medio de cultivo junto con el tipo
de explante determina la respuesta que se obtendrá del mismo, por lo cual su
elección y adecuada formulación son uno de los aspectos fundamentales para el
éxito del CTV. A grandes rasgos, el medio de cultivo consiste de dos grupos de
componentes. Los primeros son los esenciales, es decir aquellos que satisfacen los
requerimientos nutricionales básicos del tejido cultivado. Este grupo incluye a los
nutrientes minerales, la fuente de carbono y algunas vitaminas. El segundo grupo
de compuestos son los llamados opcionales, que si bien en ocasiones no son
indispensables para mantener la vida del tejido cultivado, sí determinan en gran
medida el tipo de respuesta que se obtendrá de éste, y por lo tanto influyen en el
éxito o fracaso del establecimiento y repuesta de los cultivos in vitro. A este grupo
pertenecen las fitohormonas o reguladores del crecimiento vegetal. Además de la
formulación del medio, es importante considerar las condiciones físicas del cultivo
(luz, fotoperíodo, temperatura y humedad), ya que estas contribuyen también a la
respuesta del explante.

5
 Condiciones asépticas. Para que el cultivo de cualquier tejido vegetal prospere
de la manera deseada, debe excluirse del mismo a cualquier tipo de organismo
contaminante. Esto resulta particularmente difícil debido a que los medios utilizados
para el CTV son muy ricos, y por lo general, con un alto contenido de carbohidratos,
lo que los hace ideales para el desarrollo de prácticamente cualquier
microorganismo saprófito. Debido a lo anterior, tanto el material vegetal, como el
medio de cultivo deben esterilizarse para evitar cualquier tipo de contaminación.

El esquema básico que resume estos principios se presenta en la Figura 1.

6
 CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

MEDIO DE CULTIVO

EXPLANTE
CONDICIONES
ASEPTICAS

DESARROLLO

RESPUESTA
RAICES
ADVENTICIAS
NECROSIS

ORGANOGENESIS EMBRIOGENESIS
SOMATICA

TEJIDO
CALLOSO
ORGANOGENESIS
BROTES INDIRECTA
ADVENTICIOS

EMBRIOGENESIS SOMATICA

Figura 1. Principios básicos del cultivo de tejidos vegetales y comportamiento de los

cultivos.

Como puede apreciarse, la respuesta de un tejido al cultivo in vitro depende de

la interacción entre el explante, y el medio y las condiciones de cultivo. Esta respuesta
se puede dar como organogénesis (formación de órganos adventicios como raíces y
brotes), embriogénesis somática (formación de embriones a partir de células
somáticas), formación de tejido calloso o simplemente desarrollo del tejido. Una
respuesta no deseable, pero que suele presentarse, es la necrosis del tejido, la cual
es producto de una elección errónea del explante y/o del medio de cultivo.

7
EL LABORATORIO DE CTV

A pesar de no ser el CTV una técnica que requiera de equipo muy sofisticado,
sí se debe contar con ciertas facilidades e instalaciones para realizarlo de manera
adecuada. Actualmente existen laboratorios de CTV, sobre todo aquellos que se
dedican a la micropropagación comercial a gran escala, que cuentan con equipos
automatizados para realizar la mayoría de los procesos y trabajar con grandes
volúmenes de material. Sin embargo, un laboratorio normal no requiere de tales
complicaciones. Las necesidades mínimas para un laboratorio de CTV podrían ser las
siguientes:

 Area general destinada a la preparación de medios de cultivo, la cual deberá contar

con balanzas, agitadores magnéticos y material de cristalería para la elaboración de
las diferentes mezclas, así como refrigerador y congelador para almacenar aquellos
componentes que así lo requieren y sitios para el almacenamiento de reactivos que
no requieren de refrigeración. Resulta de gran utilidad contar con un horno de
microondas que permita fundir rápidamente los medios de cultivo.
 Area para la esterilización de medios de cultivo, la cual deberá contar con
autoclaves ya sean eléctricas o de gas.
 Area de lavado de material, tanto de cristalería como de recipientes de cultivo.
 Area de transferencia aséptica. Esta deberá contar con al menos una campana de
flujo laminar y tener los accesos controlados para evitar corrientes de aire y entrada
de contaminantes.
 Cuarto de cultivo. Deberá contar con repisas dotadas de iluminación y temperatura
controlada para la incubación de los cultivos. Se recomienda la iluminación con
lámparas fluorescentes debido al excesivo calor generado por las lámparas
incandescentes.
 El laboratorio deberá contar con suministro de gas, electricidad, agua corriente,
agua destilada y agua desionizada.

8
2. MEDIOS DE CULTIVO Y NUTRICION IN VITRO DE LOS TEJIDOS VEGETALES

La elección de un medio de cultivo adecuado para la especie, tipo de explante

y respuesta esperada determina en gran medida el éxito o fracaso de los cultivos in
vitro, por lo que siempre resulta un punto crítico a ser determinado experimentalmente.

En teoría, los requerimientos nutricionales de los tejidos vegetales cultivados in

vitro deben ser similares a los que se presentan en la planta completa bajo condiciones
normales. Sin embargo, existen algunas diferencias importantes que deben ser
consideradas. Primeramente, salvo muy raras excepciones, los tejidos vegetales
cultivados in vitro no son autótrofos, ya que su tasa fotosintética generalmente se
encuentra muy disminuida. Por lo anterior requieren de la adición de una fuente de
carbono orgánico en el medio para subsistir (Stephan-Sarkissian 1990). Además, los
tejidos cultivados bajo estas condiciones requieren algunas substancias orgánicas que
en condiciones normales la planta es capaz de producir, como por ejemplo la tiamina.
Estos compuestos, por lo tanto, deben adicionarse al medio de cultivo. Otra diferencia
importante radica en la manera en que los nutrientes son tomados por el tejido vegetal.
En las plantas in vivo, la adquisición de nutrientes es facilitada por un órgano
especializado en ello (raíz), mientras que en los cultivos in vitro, son las células no
especializadas expuestas al medio las responsables de tomar y distribuir los
nutrientes. Además, a excepción de los cultivos celulares en suspensión, el área de
absorción activa de nutrientes en un tejido vegetal cultivado in vitro es mucho menor a
la que podría tener una raíz dotada de pelos radicales y en algunos casos de micorrizas
(Leifert y col. 1995).

En la actualidad, se ha desarrollado una gran cantidad de medios de cultivo

diferentes que cumplen con los requerimientos nutricionales necesarios para sostener
el crecimiento de los tejidos vegetales cultivados in vitro. Algunos de estos medios son
específicos y se adaptan a un solo tipo de tejido o a una determinada especie vegetal.
Otros medios de cultivo son de uso más general, es decir, pueden ser aplicados al
cultivo de una amplia gama de especies y tejidos diferentes. El desarrollo de la gran
mayoría de estos medios de cultivo ha sido empírico, basado únicamente en pruebas
de ensayo y error. Esto se debe a que todavía se desconoce mucho acerca de los
requerimientos nutricionales precisos de las células vegetales cultivadas in vitro.
Además, se tiene evidencia de que los requerimientos nutricionales pueden variar
entre diferentes especies vegetales e incluso entre diferentes estados de desarrollo de
una misma especie (Leifert y col. 1995).

Actualmente los medios de cultivo más utilizados son el MS (Murashige y Skoog

1962), el LS (Linsmaier y Skoog 1965) y el medio B5 (Gamborg 1968). Estos medios
se usan por lo general cuando el objetivo es la regeneración in vitro de plantas. Otros
medios que también se utilizan frecuentemente con otros objetivos son el NN (Nitsch
y Nitsch 1969) y el N6 (Chu 1978). Los medios WPM (Lloyd y McCown 1980) y el
DKW (Driver y Kuniyuki 1984) son frecuentemente usados en el cultivo de especies
leñosas (Gamborg y Phillips 1995).

9
 De manera general todos los medios de cultivo están compuestos por los
siguientes grupos de substancias (Endress 1994, Gamborg y Shyluk 1981, Kyte 1987):

Macronutrientes. Se trata de los mismos compuestos inorgánicos utilizados por las

plantas en condiciones normales: N, P, K, Ca, Mg y S.

Nitrógeno (N).
Es un elemento esencial que determina en gran medida la tasa de crecimiento
del tejido. La carencia de nitrógeno se caracteriza por un amarillamiento de las hojas,
principalmente las más viejas, y por un crecimiento reducido o nulo del tejido. La
mayoría de los medios de cultivo tienen entre 25 y 60 mM de nitrógeno inorgánico.
Este se suministra en forma de nitrato (NO3-) en concentraciones de 25-40 mM y/o de
amonio (NH4+) en concentraciones de 2-20 mM. La proporción entre estas dos formas
de nitrógeno es una variable importante a considerar cuando se experimenta con
diferentes medios de cultivo. En algunos tejidos, el amonio tiene un efecto benéfico,
pero en otros puede resultar nocivo, sobre todo en concentraciones mayores a 8 mM.
El suministro de nitrógeno puede complementarse con alguna fuente de nitrógeno
orgánico, principalmente en forma de aminoácidos.

Fósforo (P).
Tiene un papel muy importante en el desarrollo de la planta, pues se utiliza en
la síntesis de ácidos nucleicos y compuestos de alta energía y, además, participa en
la activación de diversas enzimas. En el medio de cultivo se suministra en forma de
fosfatos de sodio (NaH2PO4 . H2O) o potasio (KH2PO4 ), en un rango que va de 1 a 3
mM.

Potasio (K).
Necesario para la división celular normal, síntesis de carbohidratos y clorofila y
asimilación de N. Su carencia origina un crecimiento débil y anormal. Se suministra en
forma de nitrato (KNO3), fosfato (KH2PO4 ) o cloruro (KCl), dependiendo del medio de
cultivo. Se utiliza en concentraciones de 20 a 30 mM.

Calcio (Ca).
Participa como componente de las paredes celulares en forma de pectatos.
Desempeña un papel importante en la regulación de innumerables procesos celulares
y en la estabilidad de membranas. Es adicionado en forma de cloruro (CaCl2.2H2O) o
de nitrato (Ca(NO3 )2 . 4H2O) en concentraciones de 1 a 3 mM.

Magnesio (Mg).
Es el elemento central de las moléculas de clorofila y un importante cofactor
enzimático. Es suministrado como sulfato (MgSO4 . 7H2O) en concentraciones de 1-3
mM.

Azufre (S).
Presente en las proteínas en forma de aminoácidos azufrados y constituyente
de algunas vitaminas. Se adiciona al medio de cultivo como sulfato de magnesio

10
(MgSO4 . 7H2O) o de amonio , en concentraciones de 1 a 3 mM. Los sulfatos de
manganeso, zinc, cobre y fierro suelen usarse como fuente de micronutrientes.

Micronutrientes. Además de los macronutrientes anteriores, tanto las plantas

normales como los tejidos cultivados in vitro requieren de otros compuestos
inorgánicos en concentraciones generalmente mucho menores. Estos actúan
básicamente como cofactores enzimáticos y algunos en sistemas de transporte de
electrones. Los micronutrientes utilizados en los medios de cultivo, así como sus
concentraciones adecuadas, son:

Fierro Fe 1 mM
Manganeso Mn 20 - 90 M
Boro B 25 - 100 M
Cobre Cu 0.1 M
Molibdeno Mo 1 M
Cobalto Co 0.1 M
Yodo I 5 M

De los micronutrientes mencionados, el Fe suele ser el más limitante debido a

su tendencia a precipitar en los medios de cultivo. Para evitar esto se suministra en
forma quelada con EDTA o bien como citrato o tartrato, sin embargo estas dos últimas
formas son poco empleadas.

Un fenómeno importante a tomarse en cuenta con relación a los macro y

micronutrientes, es el hecho de que existen varios factores que pueden afectar su
grado de disponibilidad en el medio de cultivo. Entre los más importantes están el tipo
y la concentración del gelificante utilizado, las reacciones químicas que ocurren en el
medio y que pueden causar la precipitación de algunos nutrientes, los productos de la
caramelización de los carbohidratos que ocurre durante la esterilización, y la presencia
de agentes quelantes en el medio. Por otro lado, la adquisición de los nutrientes por
parte de los tejidos cultivados puede verse limitada a causa de una toma insuficiente
de los mismos a partir del medio o bien por una translocación inadecuada a través de
los explantes (Leifert y col. 1995).

Fuente de carbono. Normalmente las plantas utilizan el CO2 atmosférico como fuente
de carbono para la síntesis de todos sus componentes, esto mediante la fotosíntesis.
Los tejidos vegetales cultivados in vitro tienen una capacidad fotosintética muy
reducida o nula, por lo que se les debe proveer de una fuente de carbono orgánico. La
gran mayoría de los medios de cultivo utilizan sacarosa en concentraciones del 2 al
3%, aunque esta concentración puede ser mayor para algunas especies. Además de
la sacarosa, se han probado otras fuentes de carbono como la glucosa, fructosa,
lactosa, galactosa, rafinosa, maltosa e incluso almidón, pero con resultados casi
siempre inferiores a la sacarosa. Finalmente, es importante considerar el hecho de que
la sacarosa, además de servir al tejido como fuente de carbono, tiene un papel muy

11
importante como regulador del potencial osmótico del medio de cultivo. Esto debe
tomarse en cuenta cuando se altera su concentración o se prueban fuentes alternas
de carbono.

Vitaminas y otros elementos orgánicos. En condiciones normales, las plantas tienen

la capacidad de sintetizar todas las vitaminas requeridas para su metabolismo; sin
embargo, los tejidos vegetales cultivados in vitro por alguna razón pierden total o
parcialmente esta capacidad y se vuelven dependientes del suministro externo de
estos nutrientes. Todas las células vegetales cultivadas in vitro requieren tiamina y en
algunos casos, se ha observado que resulta benéfica la adición de piridoxina, acido
nicotinico, biotina, ácido folico, ácido ascórbico, ácido pantotenico, riboflavina y ácido
p-aminobenzoico. Otro elemento orgánico importante en los medios de cultivo es el
mio-inositol, cuya adición en concentraciones de 50 – 5,000 mg/l estimula el
crecimiento de la mayoría de los tejidos. Se ha probado también el efecto de algunos
ácidos orgánicos como el citrato, malato, succinato y fumarato, pero su utilidad real es
dudosa. Generalmente, se ha observado un efecto benéfico de la adición de los ácidos
orgánicos cuando la fuente de nitrógeno es el amonio.

Fuentes de Nitrógeno orgánico. Además del nitrógeno inorgánico suministrado

como nitrato o amonio, algunos medios de cultivo utilizan una fuente adicional de
nitrógeno orgánico como complemento. Esto se ha visto que resulta benéfico en
muchos casos. Como fuentes de nitrógeno orgánico se utilizan básicamente
aminoácidos, ya sea en forma de mezclas complejas o como substancias individuales.
Las mezclas de aminoácidos más utilizadas son hidrolizados proteínicos, como el de
caseina del cual se agregan de 2 a 10 g/l. Los aminoácidos individuales utilizados
como fuente de carbono son la glutamina (hasta 100 mg/l), la asparagina (hasta 100
mg/l) y la glicina (2 mg/l). Por último, es importante mencionar que la adición de
algunos aminoácidos individuales en concentraciones altas puede tener un efecto
inhibitorio en el crecimiento de ciertos tejidos.

Complejos orgánicos. En ocasiones se utilizan mezclas orgánicas complejas en los

medios de cultivo, ya que se ha visto que éstas en algunos casos estimulan el
crecimiento de los tejidos. El efecto de los complejos orgánicos se debe seguramente
a la presencia en ellos de substancias no identificadas pero requeridas por las células.
Con este fin se utilizan el agua de coco, el extracto de levadura y de malta, el
endospermo de maíz, el jugo de tomate, de naranja y piña, y el extracto de plátano,
entre otros. La utilización de este tipo de productos en el medio de cultivo debe tomarse
como último recurso, dado el poco control que se tiene sobre los componentes de los
mismos.

Reguladores del crecimiento. Estos componentes constituyen sin duda uno de los
elementos más importantes del medio de cultivo, ya que determinan en gran medida
el tipo de respuesta de los tejidos. Sus tipos y aplicaciones serán discutidas más
adelante.

Gelificantes. Cuando se trabaja con medio semisólido, debe utilizarse un gelificante

para darle la consistencia adecuada. Este debe ser no reactivo y no digerible por el

12
tejido vegetal. Los gelificantes más utilizados son el agar (0.5 -1%) y el Phytagel o
Gelrite (marcas comerciales) en concentraciones de 0.2 a 0.3 %. Alternativamente,
pueden utilizarse puentes de papel filtro o poliuretano para dar soporte al tejido en un
medio líquido. Es importante considerar que la mayoría de los gelificantes que son
usados en la preparación de medios de cultivo, contienen cantidades considerables de
nutrientes minerales que pueden afectar el desarrollo de los tejidos (Leifert y col. 1995).

Otros elementos. Algunos tipos de tejido requieren la presencia en el medio de

cultivo de compuestos que adsorban algunas substancias inhibidoras que son
producidas por las mismas células durante el cultivo, o bien de substancias que
impidan la oxidación de los compuestos fenólicos excretados. En el primer caso se
utilizan el carbón activado, la polivinilpirrolidona (PVP) y la polivinilpolipirrolidona
(PVPP). Dichos compuestos pueden también adsorber en cierto grado algunos
reguladores del crecimiento, lo cual debe tomarse en cuenta al utilizarlos. Por otro lado,
para impedir la oxidación de los tejidos vegetales cultivados in vitro, pueden usarse
ácido cítrico y/o ascórbico, cisteína y 8-hidroxiquinoleina. Otro tipo de compuestos
utilizados en algunos medios de cultivo son los antibióticos, fungicidas y herbicidas, ya
sea para eliminar organismos contaminantes o para seleccionar tejidos vegetales
resistentes a algún tipo de agente selectivo en experimentos de transformación
genética.

Otro factor a tomar en cuenta en el medio de cultivo es el pH, el cual

generalmente se fija entre 5.5 y 5.8, ajustándolo una vez hecha la mezcla de los
componentes. El pH se ajusta con KOH, NaOH y HCl 0.1 N. En ocasiones los procesos
metabólicos que tienen lugar en el tejido o la adición de algunos componentes que se
hace después del ajuste del pH, pueden causar variaciones en el mismo. Para evitar
esto pueden utilizarse en el medio de cultivo estabilizadores de pH como el ácido 2-
morfolino etanosulfónico (MES 0.5 - 1.0 g/l).

Finalmente, antes de su utilización, el medio deberá ser esterilizado, esto se

realiza en autoclave a una temperatura de 121 C y una presión de 1.05 kg/cm2 (15 -
20 Psi). El tiempo de esterilización depende del volumen contenido en cada recipiente
individual, y aproximadamente es el siguiente:

VOLUMEN EN ml TIEMPO EN min a 121C

hasta 50 15
75 20
500 25
1500 35
2000 40

Ciertos elementos orgánicos contenidos en el medio de cultivo pueden

degradarse durante el proceso de esterilización con calor. Los componentes
termolábiles deben esterilizarse por filtración utilizando membranas estériles de 0.22 0
0.45 m (Millipore) y agregarse al medio ya estéril y frío, si se trata de medio líquido.

13
En el caso del medio semisólido, después de la esterilización, esperar a que se enfríe
a 45-50 C antes de agregar los componentes termolábiles filtrados. Mezclar bien y
vaciar en los recipientes de cultivo antes de que solidifique.

A continuación se detalla el protocolo de preparación de los medios de cultivo

de Murashige y Skoog (MS), de Gamborg (B5) y de Nitsch y Nitsch (NN).

14
 MEDIO MS (MURASHIGE Y SKOOG 1962)
PREPARACION:

Soluciones concentradas:

SOLUCION A. Concentración: 1 000 X. Volumen: 50 ml

Cloruro de calcio CaCl2 - 2 H2O 22.000 g

SOLUCION B. Concentración: 1 000 X. Volumen: 50 ml

Yoduro de potasio KI 41.50 mg

Cloruro de cobalto Co Cl2 - 6 H2O 1.25 mg

SOLUCION C. Concentración: 400 X. Volumen: 50 ml

Fosfato monobasico de potasio KH2 PO4 3.400 g

Ac. borico H3 BO3 0.124 g
Molibdato de sodio NaMoO4 0.005 g

SOLUCION D. Concentración: 400 X. Volumen: 50 ml

Sulfato de magnesio MgSO4 - 7 H2O 7.400 g

Sulfato de manganeso Mn SO4 - H2O 0.340 g
Sulfato de zinc Zn SO4 - 7 H2O 0.172 g
Sulfato de cobre Cu SO4 - 5 H2O 0.50 mg

SOLUCION E. Concentración: 200 X. Volumen: 100 ml

Sulfato ferroso Fe SO4 - 7 H2O 0.557 g

EDTA disódico Na2 EDTA 0.745 g

Disolver ambos componentes por separado, para lo cual puede requerirse calentar.
Agregar poco a poco la solución de Fe a la de EDTA y aforar. Debe de quedar de color
amarillo sin precipitados.

SOLUCION F. Concentración 100 X. Volumen: 100 ml

Glicina 20.00 mg
Piridoxina HCl 5.00 mg
Ac. nicotinico 5.00 mg
Tiamina HCl 1.00 mg
Mio inositol 1.00 g

PREPARACION DE 1 LITRO DE MEDIO MS:

15
1. En un vaso de precipitados colocar unos 850 ml de agua destilada. Agregar volumen
indicado de las soluciones concentradas.

SOLUCION VOLUMEN (ml)

A 1
B 1
C 2.5
D 2.5
E 5
F 10

2. Pesar, añadir y agitar hasta disolver, los siguientes compuestos:

Sacarosa 30.00 g
Nitrato de potasio 1.90 g
Nitrato de amonio 1.65 g

3. Ajustar el pH del medio a 5.7 con NaOH o HCl 0.1 N. Aforar a 1 litro con agua
destilada.

4. Si se trata de medio semisólido, agregar el gelificante y disolverlo calentando (se

recomienda por rapidez utilizar horno de microondas).

5. Agregar los reguladores del crecimiento en caso de requerirlos, antes de ajustar el

pH del medio de cultivo.

6. Distribuir en los recipientes de cultivo y esterilizar.

16
 MEDIO B5 (GAMBORG 1968)
PREPARACION:

Soluciones concentradas:

SOLUCION DE MICRONUTRIENTES: Concentración: 1000 X. Volumen: 100 ml

Sulfato de manganeso Mn SO4 - H2O 1 000 mg

Ac. borico H3 BO3 300 mg
Sulfato de zinc Zn SO4 - 7 H2O 200 mg
Molibdato de sodio NaMoO4 25 mg
Sulfato de cobre Cu SO4 - 5 H2O 2.5 mg
Cloruro de cobalto Co Cl2 - 6 H2O 2.5 mg

SOLUCION DE VITAMINAS: Concentración: 1000 X. Volumen: 100 ml

Ac. Nicotinico 100 mg

Tiamina HCl 1000 mg
Piridoxina HCl 100 mg
Mio inositol 10.0 g

SOLUCION DE CLORURO DE CALCIO: Concentración: 1000 X.Volumen: 100 ml

Cloruro de calcio CaCl2 - 2 H2O 15.0 g

SOLUCION DE YODURO DE POTASIO: Concentración: 1000 X.Volumen: 100 ml

Yoduro de potasio KI 75 mg

PREPARACION DE 1 LITRO DE MEDIO B5:

1. Tomar un recipiente adecuado con unos 850 ml de agua destilada y agregar 1 ml

de cada una de las soluciones concentradas.

2. Pesar, añadir y agitar hasta disolver, los siguientes compuestos:

Sacarosa 20.000 g
Nitrato de potasio 2.500 g
Sulfato de amonio 0.134 g
Sulfato de magnesio 0.250 g
Fosfato de sodio 0.150 g

17
 EDTA ferrico 0.043 g

3. Ajustar el pH del medio a 5.5 con NaOH o HCl 0.1 N.

4. Si se trata de medio sólido, agregar el gelificante y disolverlo calentando (se

recomienda por rapidez utilizar horno de microondas).

5. Agregar los reguladores del crecimiento en caso de requerirlos, antes de ajustar el

pH del medio.

6. Distribuir en los recipientes de cultivo y esterilizar.

18
 MEDIO NN (NITSCH Y NITSCH 1969)
PREPARACION:

Soluciones concentradas:

SOLUCION DE MACRONUTRIENTES: Concentración: 100 X. Volumen: 1 litro

Nitrato de amonio NH4NO3 72.00 g

Sulfato de magnesio Mg SO4 - 7 H2O 18.50 g
Nitrato de potasio KNO3 95.00 g
Fosfato monobásico de potasio KH2PO4 6.80 g

SOLUCION DE MICRONUTRIENTES: Concentración: 100 X. Volumen: 100 ml

Ac. borico H3 BO3 1.00g

Sulfato de cobre Cu SO4 - 5 H2O 2.50 mg
Sulfato de manganeso Mn SO4 - H2O 2.50 g
Molibdato de sodio NaMoO4 25.0 mg
Sulfato de zinc Zn SO4 - 7 H2O 1.00 g

SOLUCION Fe-EDTA: Concentración: 100 X. 1 litro

Sulfato ferroso FeSO4 - 7 H2O 2. 78 g

EDTA disódico Na2 EDTA 3. 73 g

SOLUCION DE CLORURO DE CALCIO: Concentración: 100 X. 1 litro

Cloruro de calcio CaCl2 - 2 H2O 16.6 g

PREPARACION DE 1 LITRO DE MEDIO B5:

1. Tomar un recipiente adecuado con unos 850 ml de agua destilada y agregar:

10 ml de la solución de macronutrientes
1 ml de la solución de micronutrientes
10 ml de la solución de Fe-EDTA
10 ml de la solución de cloruro de calcio

2. Pesar, añadir y agitar hasta disolver 30 g de sacarosa.

3. En caso de requerirse añadir una solución de vitaminas (por ejemplo la de los
medios MS o B5).

4. Ajustar el pH del medio a 5.7 con NaOH o HCl 0.1 N.

19
5. Si se trata de medio sólido, agregar el gelificante y disolverlo calentando (se
recomienda por rapidez utilizar horno de microondas).

6. Agregar los reguladores del crecimiento en caso de requerirlos, antes de ajustar el

pH.

7. Distribuir en los recipientes de cultivo y esterilizar.

20
 3. CONTROL HORMONAL DEL CRECIMIENTO Y DESARROLLO IN VITRO

El desarrollo de cualquier tejido vegetal es un proceso sumamente complejo en

el cual interviene un gran número de factores externos e internos cuyos mecanismos
precisos de acción en muchos casos aun no están claros. Entre los factores internos
que controlan el desarrollo de los diferentes tejidos de una planta destacan los
llamados reguladores del crecimiento vegetal (RCV), también conocidos como
hormonas vegetales o fitohormonas. Los RCV son compuestos orgánicos sintetizados
por la propia planta, que en muy pequeñas cantidades alteran el crecimiento o los
patrones de desarrollo de los tejidos vegetales.

Los RCV se clasifican en 5 grupos básicos dependiendo de su estructura

química y su efecto fisiológico: auxinas, citocininas, giberelinas, ácido abscísico y
etileno. Actualmente se han aislado y estudiado otras substancias fuera de estos
grupos, que podrían ser también consideradas como RCV, como por ejemplo las
poliaminas, jasmonatos, ácido salicílico y los brassinoesteroides (Davies 1995).

Hasta hace pocos años se tenía la creencia de que la mayoría de los

fenómenos relacionados con el desarrollo de los vegetales podían ser explicados
sobre la base de simples cambios en las concentraciones y tipos de estos compuestos
presentes en un tejido. Actualmente se sabe que el papel de la concentración de estos
compuestos en un tejido, aunque importante, no es tan determinante como llegó a
suponerse, pues hay otro tipo de consideraciones a tomar para explicar el proceso del
desarrollo en las plantas. A pesar de lo anterior, los RCV tienen aun una gran
importancia en campos como la agricultura, donde poseen un buen número de
aplicaciones prácticas. Otro campo en donde destaca el uso de los RCV es el Cultivo
de Tejidos Vegetales, ya que mediante el manejo de los tipos, concentraciones y
combinaciones de estos compuestos en un medio de cultivo se pueden manipular
hasta cierto grado los patrones de desarrollo de los tejidos y obtener las respuestas
deseadas como la formación de tejido calloso, brotes, embriones somáticos y raíces.
Por lo anterior, el correcto manejo de los RCV en le cultivo in vitro de tejidos vegetales
suele ser determinante para el éxito o fracaso del sistema.

Al utilizar los RCV en el cultivo de tejidos, se deben tener en mente las

siguientes consideraciones:

 La respuesta de un tejido al cultivo in vitro es el producto de la interacción de los

reguladores del crecimiento endógenos (producidos por el propio tejido) y aquellos
exógenos añadidos al medio. De acuerdo a esto, cada tejido puede responder de
manera diferente a una misma concentración de reguladores del crecimiento a
causa de diferencias en el contenido de reguladores endógenos.
 La respuesta del tejido a los reguladores exógenos depende en gran medida del
estado fisiológico particular de dicho tejido, así como de su origen y tipos celulares
presentes en el mismo. Cada tejido tiene una determinada “sensibilidad” ante los
reguladores del crecimiento, lo que los hace más o menos capaces de responder
ante ellos. La sensibilidad puede definirse como la capacidad de respuesta a los

21
 RCV y está dada por la cantidad de receptores específicos para los reguladores del
crecimiento presentes en el tejido. Esto también es causante de la respuesta
diferente de cada tipo de tejido ante un mismo tratamiento.
 Las concentraciones de RCV que se utilizan normalmente en los medios de cultivo
exceden por varios ordenes de magnitud a las concentraciones fisiológicas de estos
compuestos en los tejidos. Esto debe ser tomado en cuenta al intentar explicar las
respuestas de un tejido in vivo mediante observaciones hechas in vitro.

La Figura 2 resume los diferentes factores que influyen en la respuesta de un

tejido cultivado in vitro a la adición de RCV exógenos. Como puede apreciarse, estos
factores hacen que la respuesta del tejido a los RCV exógenos no sea simplemente
proporcional a la cantidad que se añada al medio de cultivo.

22
 CANTIDAD DE RCV DEPENDE DE:
SUMINISTRADOS AL
CULTIVO IN VITRO -EXPERIENCIA PREVIA
-EXPERIENCIA CON ESPECIES SIMILARES
-EXPERIMENTACION

CANTIDAD REAL DE RCV DEPENDE DE:

PRESENTES EN EL
CULTIVO IN VITRO -CANTIDAD DE RCV ENDOGENOS
-ERRORES DE MEDICION
-LABILIDAD DURANTE LA ESTERILIZACION
-TASA DE ABSORCION POR EL TEJIDO
-DISTRIBUCION DENTRO DEL TEJIDO
-METABOLISMO Y DEGRADACION

ACTIVIDAD DE LOS RCV EN DEPENDE DE:

EL SITIO DE ACCION
(TEJIDO O CELULAS -FACTORES GENETICOS
BLANCO) -SENSIBILIDAD DE LAS CELULAS AL RCV
-INTERACCION CON OTROS RCV TANTO
EXOGENOS COMO ENDOGENOS
-HABITUACION DEL TEJIDO

RESPUESTA DEL TEJIDO

Figura 2. Resumen de los diferentes factores que influyen en la respuesta

de un tejido cultivado in vitro a la adición de RCV exógenos.

Los RCV más utilizados en los cultivos in vitro son los pertenecientes a los
grupos de las auxinas y de las citocininas, ya que son los que regulan en gran medida
los procesos de crecimiento y desarrollo organizado en los cultivos de tejidos
vegetales. En menor grado se utilizan algunos reguladores no pertenecientes a estos
grupos como las giberelinas y el ácido abscísico.

23
Auxinas

Las auxinas son un grupo de compuestos derivados comúnmente del triptofano,

sintetizados por lo general en los ápices, y que están implicados en varios eventos
relacionados con el crecimiento y diferenciación celular. Se sabe que participan en la
regulación de algunos procesos que ocurren en los tejidos vegetales como el
crecimiento celular, la acidificación de la pared celular, el inicio de la división celular,
la formación de tejidos no diferenciados (tejido calloso), la diferenciación del tejido
vascular y la formación de órganos (raíces). En las plantas completas las auxinas
tienen que ver con la dominancia apical, afectan la senescencia y abcisión de las hojas
y coordinan algunas respuestas trópicas. La auxina natural más común es el ácido
indolacético (AIA) (Fig.3), pero dependiendo de la especie, edad de la planta, estación
del año y condiciones de crecimiento pueden aparecer otras auxinas naturales en los
tejidos, como por ejemplo el ácido 4-cloroindol-3-acético, el ácido indol-3-acrílico o el
ácido indolbutírico (AIB) (Fig. 3). Además, algunos precursores de las rutas
biosintéticas de las auxinas pueden tener actividad propia como auxinas y substituir
así al AIA (Gaspar y col. 1996). Las auxinas naturales pueden encontrarse con
frecuencia conjugadas con otros compuestos como alcoholes, aminoácidos y
azúcares. Esto parece ser un mecanismo de almacenamiento temporal y estabilización
de la concentración de auxinas activas. El AIA y el AIB se utilizan frecuentemente en
los medios de cultivo. Por ser compuestos que se encuentran naturalmente en la
planta, tienden a ser metabolizados por los tejidos; además, éstos se desnaturalizan
con relativa rapidez en el medio. Esto hace que la disponibilidad real de estas auxinas
en el medio de cultivo disminuya paulatinamente, lo cual resulta útil en aquellos
procesos que requieren altas concentraciones de auxinas sólo para la inducción inicial
de los mismos (por ejemplo el enraizamiento) (Gaspar y col. 1996). Actualmente se
conocen y utilizan varios compuestos sintéticos que tienen una fuerte actividad de
auxinas, como los ácidos fenoxiacéticos, que son utilizados como herbicidas en altas
concentraciones. Estos compuestos artificiales suelen ser más activos, ya que las
células vegetales carecen en muchos casos de sistemas enzimáticos para
degradarlos. Ejemplos de auxinas artificiales son el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-
D), el ácido naftalenacético (ANA) y el ácido 4-amino-3,5,6-tricloropiridin-2-carboxílico
(Picloram) (Fig. 3).

24
ácido indolacético (AIA) ácido indolbutírico (IBA)

ácido naftalenacético (ANA)

ácido 2,4-diclorofenoxiacético
(2,4-D)

ácido 4-amino-3,5,6-tricloropiridin-2-
carboxílico (Picloram)

Figura 3. Estructura química de algunas auxinas naturales y sintéticas.

25
 NOMBRE NOMBRE PM CONC. DE SOLVENTE METODO DE
COMÚN TRABAJO ESTERILIZACION
(mg/l)

ÁCIDO AIA 175.2 0.01-3.0 NaOH AUTOCLAVE

INDOLACETICO (IAA) 1N FILTRACION

ÁCIDO ANA 186.2 0.1-10.0 NaOH AUTOCLAVE

NAFTALENACETICO (NAA) 1N
ÁCIDO AIB 203.2 0.1-10.0 NaOH AUTOCLAVE
INDOLBUTIRICO (IBA) 1N FILTRACION

ÁCIDO 2,4-DICLORO 2,4-D 221.0 0.01-5.0 NaOH AUTOCLAVE

FENOXIACETICO 1N
ETANOL
ÁCIDO t-CINAMICO 148.2 0.1-10.0 NaOH AUTOCLAVE
1N FILTRACION
ÁCIDO NOA 202.2 0.1-10.0 NaOH AUTOCLAVE
NAFTOACETICO 1N
ÁCIDO PAA 136.2 0.1-50.0 ETANOL AUTOCLAVE
FENILACETICO FILTRACION
ÁCIDO p-CLORO CPA 186.6 0.1-10.0 ETANOL AUTOCLAVE
FENOXIACETICO
ÁCIDO 2,4,5- 2,4,5-T 255.5 0.01-5.0 ETANOL AUTOCLAVE
TRICLORO
FENOXIACETICO
ÁCIDO PICLOR 241.5 0.1-10.0 DMSO AUTOCLAVE
AMINOTRICLO AM
ROPICOLINICO
ÁCIDO IPA 189.2 0.1-10.0 NaOH AUTOCLAVE
INDOLPROPIONICO 1N FILTRACION

Tabla 1. Auxinas más utilizadas en el cultivo de tejidos vegetales.

Citocininas

Las citocininas generalmente son derivados de la adenina y son sintetizadas en

tejidos jóvenes y raíces. Poseen dos propiedades que las hacen muy útiles para el
cultivo in vitro de tejidos vegetales; por un lado estimulan la división celular y por otro
rompen la latencia de las yemas axilares haciéndolas brotar. En las plantas completas,
las citocininas promueven la brotación de yemas axilares, estimulan la expansión de
las hojas y retardan la senescencia. Junto con las auxinas, las citocininas regulan la
división celular. Debido a lo anterior, el balance entre auxinas y citocininas en un cultivo
in vitro suele ser determinante para el patrón de desarrollo que siga el tejido. Las
respuestas que pueden esperarse del tejido ante el balance auxinas/citocininas se

26
muestran en la figura 4, pero pueden presentarse variaciones notables entre especies
y tejidos.

CONCENTRACION DE AUXINAS CONCENTRACION DE CITOCININAS

RESPUESTA
ALTA NULA

PRODUCCION DE RAÍCES

EMBRIOGENESIS

TEJIDO CALLOSO

BROTES ADVENTICIOS

PROLIFERACION DE YEMAS

NULA ALTA

Figura 4. Respuestas generadas en los cultivos in vitro por las auxinas y

citocininas.

Las citocininas naturales más comunes son la zeatina, la isopentiladenina (2iP)

y el ribósido de zeatina (Fig. 5). Estas citocininas naturales se caracterizan por poseer
un esqueleto de adenina con una cadena lateral isoprenoide (Gaspar y col. 1996). Las
citocininas sintéticas benciladenina (BA) y cinetina son las más utilizadas en el cultivo
in vitro de tejidos vegetales. Algunos herbicidas sintéticos como las fenilureas tienen
actividad de citocinina en bajas concentraciones. Un ejemplo de esto último es el N-
fenil-N`-1,2,3-tidiazolil-5-urea (Tidiazurón) (Fig. 5).

27
Zeatina Isopentiladenina (2iP)
Ribósido de
Zeatina

Cinetina
Benciladenina (BA)

N-fenil-N`-1,2,3-tidiazolil-5-
urea (Tidiazurón)

Figura 5. Estructura química de algunas citocininas naturales y sintéticas.

28
 NOMBRE NOMBRE PM CONC. SOLVENTE ESTERILIZACION
COMUN (mg/l)
BENCILADENINA BA 225.3 0.1-10.0 NaOH 1N AUTOCLAVE
FILTRACION
CINETINA CIN 215.2 0.1-10.0 NaOH 1N AUTOCLAVE
FILTRACION
ISOPENTIL- 2iP 203.2 1.0-30.0 NaOH 1N AUTOCLAVE
ADENINA FILTRACION
ADENINA 135.1 50-250 HCl 1N AUTOCLAVE

HEMISULFATO 184.2 50-250 AGUA AUTOCLAVE

DE ADENINA
FENILTIDIAZOL TIDIAZU 220.2 0.001-0.1 DMSO AUTOCLAVE
UREA -RON FILTRACION
(TDZ)
ZEATINA ZEA 219.2 0.01-5.0 NaOH 1N AUTOCLAVE
FILTRACION
DIFENILUREA DPU 212.3 0.1-1.0 DMSO FILTRACION

CLOROPIRIDIN 4CPPU 247.7 0.001-1.0 DMSO FILTRACION

FENILUREA

Tabla 2. Citocininas más utilizadas en el cultivo de tejidos vegetales.

Además de las auxinas y citocininas que son con mucho los RCV más utilizados
en los cultivos in vitro, el ácido giberelico y el ácido abscísico (Fig. 6) tienen algunas
aplicaciones en procesos fisiológicos en los tejidos. El ácido giberelico puede utilizarse
en algunos casos para la elongación de estructuras como brotes, así como para
acelerar la brotación en ciertos tipos de yemas y meristemos. Por su parte el ácido
abscísico se utiliza en raras ocasiones para inhibir la germinación de embriones
somáticos o para completar el proceso de maduración de los mismos.

29
 Ácido giberelico Ácido abscísico

Fig. 6. Estructura química del ácido giberelico y del ácido abscísico.

NOMBRE NOMBRE PM CONC. SOLVENTE ESTERILIZACION

COMUN (mg/l)
ÁCIDO ABA 264.3 0.1-10.0 NaOH 1N AUTOCLAVE
ABSCISICO FILTRACION

ÁCIDO 3,6, DICAM- 221.0 0.1-10.0 ETANOL FILTRACION

DICLORO BA
ANISICO
ÁCIDO GA3 346.4 0.01-5 ETANOL AUTOCLAVE
GIBERELICO FILTRACION

ÁCIDO 210.3 0.01-100.0 ETANOL FILTRACION

JASMONICO

ÁCIDO MALEICO 112.1 0.01-10.0 NaOH 1N FILTRACION

FLOROGLUCINOL 126.1 HASTA 160 AGUA AUTOCLAVE

FILTRACION
FOSFONOMETIL GLIFO- 169.1 ___ NaOH 1N FILTRACION
GLICINA SATO

Tabla 3. Otros reguladores del crecimiento y substancias afines utilizadas en

el cultivo de tejidos vegetales.

30
Algunas recomendaciones generales para el uso de los RCV en el CTV son las
siguientes:

 Cuando se ignora la concentración a utilizar de algún RCV para inducir una

respuesta deseada en el tejido, puede realizarse un experimento preliminar
tomando los límites inferior y superior del rango de concentraciones recomendado,
así como el valor intermedio. Con el resultado obtenido podrá montarse un
experimento más fino para determinar la concentración más apropiada.
 Para preparar una solución concentrada de cualquier regulador del crecimiento,
debe pesarse la cantidad indicada y disolverse en el menor volumen posible del
solvente, lo cual puede tomar tiempo. Una vez disuelto se afora al volumen final con
agua.
 Aquellos reguladores en que se indican tanto el autoclave como la filtración como
métodos de esterilización, pueden perder una parte de su actividad si se esterilizan
con calor. Para experimentos críticos se recomienda esterilizarlos por filtración a
través de membranas Millipore. Esta pérdida de actividad también puede
compensarse incrementando un poco la concentración del RCV.

31
 4. PROBLEMAS ASOCIADOS AL CTV Y FORMAS DE COMBATIRLOS

CONTAMINACION

Una de las condiciones básicas que se requieren para el CTV es la asépsia, es

decir, la ausencia en el sistema de cualquier organismo contaminante que pudiera
afectar los resultados o incluso matar al tejido vegetal cultivado. Por desgracia la
contaminación de los cultivos es un fenómeno frecuente, que se ve facilitado por el
hecho de que se utilizan medios muy ricos, en los cuales prospera una muy amplia
gama de microorganismos. Los contaminantes presentes en los cultivos de tejidos
vegetales pueden ser hongos, incluyendo levaduras o bacterias, aunque los tejidos
pueden además contener virus, viroides o micoplasmas. Entre los hongos, los que
suelen aparecer con mayor frecuencia como contaminantes en los cultivos pertenecen
a los géneros Penicillium, Candida, Cladosporium, Aspergillus, Botrytis, Alternaria y
Fusarium. En cuanto a las bacterias, suele presentarse contaminación tanto por Gram
positivas como negativas. Entre las primeras destacan los géneros Actinomyces,
Bacillus, Bordetella, Lactobacillus, Staphylococcus, Micrococcus y Streptomyces,
mientras que entre las Gram negativas son frecuentes Acinetobacter, Agrobacterium
radiobacter, Erwinia, Klebsiella, Pseudomonas y Xanthomonas (Cassells 1991, Leifert
y col. 1994).

La mayoría de los microorganismos contaminantes crecen muy rápidamente

bajo las condiciones en que se cultivan los tejidos vegetales, por lo que su presencia
se hace claramente visible a los pocos días de iniciado el cultivo. Sin embargo, existe
una minoría de microorganismos para los cuales el medio no resulta apropiado, por lo
que su crecimiento es sumamente lento y no son fácilmente detectables en el cultivo.
A estos contaminantes se les denomina crípticos o subliminales y son los responsables
en la mayoría de los casos del llamado efecto de halo alrededor de los explantes. La
detección de este tipo de contaminantes puede realizarse ya sea colocando
segmentos del tejido en medios apropiados para estos organismos y observando si se
presenta crecimiento de los mismos o bien por pruebas serológicas.

Existen dos fuentes probables de contaminación para los cultivos;

primeramente, aquella que proviene de los instrumentos utilizados y las condiciones
en que se manipulan los mismos y, segundo, aquella que proviene del explante mismo.

Para combatir la contaminación derivada de la manipulación del cultivo, deben

tomarse las siguientes precauciones:

 Realizar todas las manipulaciones que impliquen la exposición de los tejidos o del
medio de cultivo en área axénica, siendo lo ideal trabajar en una campana de flujo
laminar.
 Esterilizar todos los implementos utilizados para la manipulación de los tejidos antes
de hacer uso de ellos. Los instrumentos metálicos como pinzas, bisturíes y
espátulas pueden mantenerse en etanol al 70% y flamearlas cada vez que se usen;

32
 sin embargo, deben enfriarse en agua destilada estéril antes de ponerlos en
contacto con el tejido.
 Los frascos o recipientes de cultivo deben permanecer sellados en un ambiente libre
de polvo y corrientes de aire durante el período de incubación, Sin embargo, existen
especies que requieren intercambio gaseoso con el ambiente externo para su
correcto desarrollo. En este caso, los recipientes de cultivo deben incubarse
tapados, pero no sellados, o bien, pueden utilizarse tapas que contengan un área
cubierta por una membrana muy fina. Estas tapas permiten el intercambio gaseoso,
pero impiden la entrada de contaminantes.

El segundo tipo de contaminación, es la que se deriva del explante mismo,

siendo ésta más difícil de controlar. Las superficies vegetales son el hábitat natural de
un gran número de microorganismos potencialmente contaminantes, que deben de
eliminarse antes de iniciar el cultivo in vitro. Por otro lado, existe un grupo importante
de microorganismos llamados endofíticos, cuyo hábitat se encuentra dentro de los
tejidos vegetales, ya sea en espacios intercelulares o incluso dentro de las células. Los
microorganismos que pertenecen a este segundo grupo son prácticamente imposibles
de eliminarse por métodos convencionales, por lo que al presentarse dificultan
enormemente el establecimiento de los cultivos. Para la eliminación de los
microorganismos superficiales existen varios métodos de esterilización del tejido, que
serán discutidos más adelante. Para la eliminación de los microorganismos
endofíticos, existen dos métodos; el primero de ellos es el uso de antibióticos, lo cual
desde luego no es efectivo contra virus y viroides. Las desventajas de este método
son el efecto que los antibióticos pueden tener sobre las células vegetales, y el hecho
de que estos compuestos suelen detener la multiplicación de los microorganismos,
pero no necesariamente los matan a todos. Los microorganismos que se mantienen
vivos de esa manera pueden reanudar su multiplicación al degradarse el antibiótico o
al subcultivar los tejidos en un medio que carezca del mismo. El segundo método es
el aislamiento y cultivo de meristemos combinado con quimioterapia o termoterapia
para eliminar patógenos. Este método suele dar buenos resultados, pero resulta
complicado.

La esterilización superficial de los tejidos vegetales se realiza básicamente

mediante el empleo de compuestos químicos capaces de eliminar a los
microorganismos. Para ello, debe considerarse el hecho de que cualquier agente
químico que mate microorganismos también causará daño al tejido vegetal, por lo que
la principal limitante en este punto es encontrar un sistema que mate a la inmensa
mayoría de los microorganismos causando el menor daño posible a la células
vegetales. Tomando en cuenta lo anterior, es sumamente difícil obtener un porcentaje
de contaminación de cero, por lo que siempre debe considerarse un margen de
pérdidas por contaminación al iniciar un cultivo. El método general para la esterilización
superficial de tejidos vegetales consta de un lavado previo de los mismos con agua
corriente y un detergente suave, seguido de un tratamiento con el agente químico
esterilizante y, el enjuague de los tejidos con agua destilada estéril en un ambiente
aséptico. En la tabla 4 se presentan los agentes químicos más utilizados para la
esterilización de tejidos vegetales así como su concentración y tiempo de exposición
recomendable.

33
 AGENTE CONCENTRACION TIEMPO (min)

Hipoclorito de sodio* 0.5 - 5 % 5 - 30

Hipoclorito de calcio 8 - 10 % 5 - 30

Nitrato de plata 1% 5 - 30

Cloruro de mercurio** 0.1 - 1 % 2 - 10

Etanol 70 - 96 % 0.5 - 3

Isopropanol 70 % 0.5 - 3

Peróxido de hidrógeno 3 - 12 % 5 - 15

Zephiran (cloruro de 0.01 - 0.1 % 5 - 20

benzalkonio)
Antibióticos 40 - 500 mg/l 30 - 90

*. Los blanqueadores comerciales contienen aproximadamente un 5 % de hipoclorito de sodio, por lo que pueden
ser utilizados en concentraciones del 10 al 100%.
**. Su uso es poco recomendable debido a su alta toxicidad.

Tabla 4. Agentes químicos más utilizados para la esterilización de

tejidos vegetales

La esterilización exitosa del explante suele ser un paso crítico para el

establecimiento de un cultivo in vitro. Por desgracia este proceso puede ser
sumamente difícil en algunos casos por lo que deben hacerse modificaciones o
adaptaciones a los métodos usuales, para lo cual pueden tomarse en cuenta las
siguientes recomendaciones:

 La probabilidad de que un explante lleve contaminantes aun después de esterilizado

es directamente proporcional al tamaño del mismo, por lo que entre más pequeño
sea el explante, menor es la probabilidad de que lleve contaminantes. Sin embargo,
los explantes de tamaño pequeño tienen una menor probabilidad de sobrevivir y
establecerse; además entre mayor sea la proporción de superficie herida en relación
con el tamaño total del explante, mayor será la probabilidad de necrosis causada
por fenómenos como la oxidación.
 Aquellos explantes con una superficie irregular o cubierta de ceras, vellosidades o
tricomas, dificultan la penetración del agente esterilizante por lo que requieren un
mayor tiempo de exposición al mismo. Desgraciadamente, un mayor tiempo de
tratamiento resulta casi siempre nocivo para el tejido, de ahí que sea recomendable
facilitar de algún modo la penetración del esterilizante en lugar de incrementar el

34
 tiempo de exposición. Esto puede lograrse ya sea aplicando vacío por un corto
tiempo al utilizar al agente esterilizante y/o agregándole al mismo algún detergente
suave como el Tween 20 para disminuir la tensión superficial y facilitar su
penetración.
 Una combinación en serie de varios de los agentes mencionados suele resultar
mejor y menos nocivo para el tejido que el incrementar el tiempo de exposición a
uno solo de ellos. Por ejemplo, el utilizar etanol al 70% por 40 seg seguido de
blanqueador comercial al 15-20% por 15 min suele dar muy buenos resultados con
ciertos tipos de explante. Sin embargo, es conveniente recalcar que los tratamientos
deben ser aplicados uno después de otro y no mezclando los agentes esterilizantes.
 En ocasiones, los lavados previos del explante pueden resultar tan importantes
como la esterilización misma. Es recomendable, pues, extender lo mas posible
estos lavados con el fin de utilizar tratamientos de esterilización menos drásticos.
En casos extremos, pueden lavarse los explantes toda la noche colocándolos en
abundante agua con un detergente suave y bajo agitación, para dar al día siguiente
varios enjuagues y proceder luego a la esterilización.
 Una alternativa a la esterilización de los explantes es la utilización de cultivos
axénicos que sirvan como fuente de tejidos u órganos. Para esto, se deben
esterilizar semillas y germinarlas bajo condiciones asépticas para obtener plántulas,
cuyas partes pueden ser utilizadas como explante sin necesidad de esterilizarlas.
Una de las ventajas de esta alternativa es que las semillas son mucho más
resistentes al tratamiento con agentes esterilizantes, lo que permite una mayor
exposición a los mismos eliminándose así una mayor proporción de contaminantes.
 Cuando se tiene fácil acceso a las plantas madre de donde se tomarán los
explantes, suele resultar muy útil para reducir la contaminación, un pretratamiento
con fungicidas y el colocarlas en un ambiente lo más limpio posible unas semanas
antes de tomar los explantes.
 Los explantes susceptibles a la contaminación deben inocularse con una densidad
lo más baja posible, de preferencia uno por recipiente de cultivo. De esta manera el
hecho de que un explante se contamine no repercutirá en la pérdida de otros.
 Finalmente, en ocasiones a pesar de que se tomen todas las precauciones
mencionadas, los porcentajes de contaminación se mantienen muy altos, (hasta en
un 90%). Esto se debe a las condiciones de la planta madre y resulta prácticamente
imposible reducir la contaminación sin dañar el tejido. En este caso, queda la opción
de trabajar inicialmente con un número muy alto de explantes, esperando que aun
después de las pérdidas por contaminación queden suficientes para iniciar el cultivo.

Como se ha mencionado, aun con todas las precauciones antes citadas, es

relativamente común el hecho de que se presente contaminación en los cultivos. Esta
contaminación puede aparecer al momento de iniciar el cultivo, durante la incubación
o durante los subcultivos. En muchos casos es difícil encontrar la causa o la fuente de
la contaminación, por lo cual también resulta difícil evitarla. En la tabla 5 se resumen
algunas posibles causas de contaminación en diferentes etapas del cultivo así como
la forma de evitarlas o disminuirlas.

35
 ETAPA CAUSA DE FORMA DE EVITAR LA
CONTAMINACION CONTAMINACION
Selección de plantas 1. Presencia de 1. No utilizar plantas con
madre patógenos síntomas
fitopatológicos como
fuente de explantes
2. Plantas creciendo en 2. Pretratamientos para
ambientes muy sanear las plantas 15-
contaminados 30 días antes de tomar
los explantes

Esterilización de los 3. Método de 3. Probar otros métodos y

explantes esterilización agentes esterilizantes
inadecuado 4. Utilizar vacío o
4. Falta de penetración detergentes
del agente esterilizante
5. Baja concentración de 5. Utilizar soluciones
cloro activo en el nuevas. No dejarlas
esterilizante destapadas.
Preparación del medio de 6. Poco tiempo de 6. Revisar el autoclave,
cultivo esterilización o incrementar el tiempo
temperatura de esterilización
inadecuada.
7. Almacenamiento 7. Almacenar en un
inadecuado del medio ambiente limpio los
recipientes con medio
de cultivo, cerrados
herméticamente y
sellados con plástico.
Subcultivos 8. Contaminación 8. Verificar el
proveniente del aire funcionamiento de la
campana de flujo
laminar (prefiltro, filtros
y potencia del motor,
posibles fugas de aire).
Verificar la técnica
utilizada por el
operador.
9. Instrumentos y 9. Flamear
accesorios utilizados en frecuentemente pinzas,
la manipulación del espátulas y bisturíes.
cultivo Verificar esterilidad del
agua y las cajas de
petri utilizadas.

36
 10.Cultivos utilizados 10.Verificar el estado de
como fuente de inoculo los cultivos antes de
con contaminación subcultivar.
críptica
11.Contaminación durante
el período de 11.Verificar las tapas y
incubación sellos de los
recipientes, sanear el
ambiente de incubación

Tabla 5. Causas más frecuentes de contaminación en el establecimiento y

mantenimiento de cultivos in vitro.

VITRIFICACION

Frecuentemente, sobre todo en algunas especies, los tejidos cultivados in vitro

toman un aspecto vítreo y presentan deformaciones evidentes. Esto se debe a toda
una serie de desordenes anatómicos, morfológicos y fisiológicos causados al parecer
por las condiciones en que se realiza el cultivo. A este fenómeno se le aplica el nombre
de vitrificación. Las condiciones que se cree favorecen la vitrificación de los tejidos son
el exceso de nutrientes, el exceso de carbohidratos, los altos niveles de reguladores
del crecimiento, la baja intensidad luminosa y, sobre todo, la alta humedad relativa y
la alta disponibilidad de agua en el medio (Ziv 1991). Hasta la fecha, se conoce muy
poco acerca de este fenómeno, pero se sabe que el aspecto vítreo y las deformaciones
son únicamente el producto final de toda una serie de eventos que comienzan mucho
antes de que se presente un síntoma visible. Algunas de las características que se han
encontrado en los tejidos vitrificados son: hiperhidratación, con una pérdida aparente
del control de las relaciones hídricas del tejido, paredes celulares delgadas y poco
lignificadas, grandes espacios intercelulares llenos de agua, deformaciones en la
cutícula e incluso atrofia de los estomas.

Las plantas vitrificadas, aunque en ocasiones son capaces de prosperar in vitro,

no tienen ninguna posibilidad de adaptarse exitosamente a las condiciones externas.
Algunas plantas como el clavel, la gerbera, algunos frutales y las cactáceas, son
especialmente susceptibles a la vitrificación, Aun cuando el fenómeno de vitrificación
no está bien entendido, se sabe que se puede evitar en cierta medida utilizando altas
concentraciones de agar en el medio (0.8 - 1.2 %), añadiendo polietilenglicol,
reduciendo la concentración de reguladores del crecimiento y utilizando algunos
compuestos como el floroglucinol.

OXIDACION

La obtención de un explante para iniciar un cultivo in vitro implica casi

invariablemente la necesidad de causar heridas en el tejido vegetal; de hecho, estas

37
heridas facilitan la respuesta del tejido al permitir la entrada de nutrientes y RCV, por
ejemplo en la organogénesis. Sin embargo, cualquier tejido vegetal que es herido
excreta una gran cantidad de compuestos que intervienen en el proceso de
cicatrización y defensa contra patógenos, la mayoría de los cuales pertenecen al grupo
de los compuestos fenólicos. Estos compuestos, al contacto con la atmósfera tienden
a ser oxidados causando un oscurecimiento del tejido. Esta oxidación conlleva la
generación de radicales como las quinonas que resultan altamente tóxicos para los
tejidos vegetales. En muchas plantas, sobre todo leñosas, este oscurecimiento debido
a la oxidación llega a ser tan intenso que causa la necrosis completa del explante con
la consecuente pérdida del cultivo. Este fenómeno, aunado a la contaminación, hace
sumamente difícil el establecimiento de cultivos de leñosas, sobre todo cuando se
parte de explantes tomados de plantas adultas. Algunas de las maneras de evitar o al
menos reducir este fenómeno son:

 Cortar los explantes en un recipiente con agua abundante (por supuesto estéril),
cambiándola frecuentemente (esto para eliminar los compuestos que están siendo
excretados). Se pueden añadir a dicha agua compuestos antioxidantes; por
ejemplo, una mezcla de ácido cítrico 100 mg/l y ácido ascórbico 150 mg/l , los cuales
deben esterilizarse por filtración.
 Agregar antioxidantes al medio de cultivo, como los mencionados arriba u otros
como cisteína, ditiotreitol y metabisulfito de sodio, aunque éstos pueden resultar
tóxicos al tejido en ciertas concentraciones.
 Utilizar en el medio de cultivo agentes que adsorban los compuestos fenólicos
excretados, como el carbón activado, ficol, la PVP y la PVPP (2 - 5 g/l). Debe
tenerse en cuenta que estos pueden adsorber también ciertos componentes del
medio, como por ejemplo los RCV.
 Subcultivar muy frecuentemente, (por ejemplo cada 24-48 hrs), hasta que cese la
excreción de los compuestos fenólicos. Suele ser muy útil también incubar a bajas
temperaturas los tejidos los primeros días.
 Si se les da un pretratamiento con frío a los explantes antes de la inoculación, suele
reducirse un poco la excreción de compuestos fenólicos al medio de cultivo.

38
 5. TEJIDO CALLOSO: INDUCCION, MANTENIMIENTO Y USOS

Se le denomina tejido calloso a una masa amorfa de células vegetales poco

diferenciadas y de rápida proliferación. En condiciones naturales este tejido aparece
como un mecanismo de cicatrización cuando se presentan heridas o bien en tumores
(“agallas”) inducidos por algunos organismos fitopatógenos como la bacteria
Agrobacterium tumefaciens (Fig. 7a). La aparición natural de tejido calloso se da como
consecuencia de un cambio en los niveles endógenos de reguladores del crecimiento,
básicamente auxinas y citocininas. Este tipo de tejido puede también obtenerse y
mantenerse in vitro con relativa facilidad cuando se manejan apropiadamente las
concentraciones de los reguladores del crecimiento mencionados (Fig. 7b y 7c).

El tejido calloso está compuesto por células que muestran características

similares a las del parénquima, aunque los estudios citológicos demuestran que es un
tejido heterogéneo en cuanto a su composición celular. Las características del tejido
calloso cultivado in vitro dependen de los reguladores del crecimiento utilizados, de la
especie y órgano de que fue tomado el explante inicial, y de las condiciones físicas de
incubación.

Una de las propiedades más importantes del tejido calloso es la llamada

friabilidad. Esta puede ser definida como la tendencia de las células a separarse unas
de otras, por lo que un tejido calloso friable es aquel que se disgrega fácilmente. Por
lo general las altas concentraciones de auxinas en el medio de cultivo favorecen la
friabilidad del tejido, mientras que la presencia de citocininas tiende a producir tejidos
de consistencia más dura. La friabilidad es una propiedad deseable cuando se
pretende utilizar el tejido calloso para iniciar cultivos de células en suspensión.

INDUCCION DEL TEJIDO CALLOSO

Con un medio de cultivo adecuado, casi cualquier tejido vegetal que contenga
un alto número de células viables es capaz de producir tejido calloso. Se sabe que son
sólo unas pocas células del explante inicial las que dan lugar a este tejido; usualmente
éstas son las localizadas en la superficie del inóculo o adyacentes a las heridas
producidas al tomar el explante. Para la inducción de tejido calloso se requiere un
medio de cultivo rico (como el MS o el B5), generalmente sólido, y con una
concentración adecuada de auxinas y citocininas. La inducción de tejido calloso se
produce cuando la proporción de auxinas es superior a la de las citocininas. Se ha
observado que son en realidad las primeras las responsables de la aparición de este
tipo de tejido, mientras que las citocininas sólo favorecen su proliferación. En ciertas
especies, la inducción de tejido calloso puede lograrse agregando únicamente auxinas
al medio de cultivo. Las auxinas más utilizadas para la inducción de tejido calloso son
el 2,4-D, el AIA y el ANA, mientras que las citocininas que más se utilizan son la
cinetina y la BA.

39
MANTENIMIENTO DEL TEJIDO CALLOSO

Dada la alta tasa de proliferación que muestra este tipo de tejido se requieren
subcultivos cada 3 - 8 semanas (dependiendo de la especie), para mantenerlo en un
estado adecuado. Si los subcultivos no se realizan con la frecuencia apropiada se
presenta el agotamiento de los nutrientes y la desecación del medio, así como la
acumulación de desechos metabólicos potencialmente tóxicos que pueden causar la
necrosis del tejido. Para el subcultivo deben tomarse solo aquellos fragmentos de
aspecto sano que no muestren señales de deshidratación, obscurecimiento o necrosis,
y transferirlos a un medio de cultivo fresco. Este medio suele ser el mismo en que se
dio la inducción del tejido, aunque en algunos casos puede reducirse la concentración
de auxinas y añadir suplementos como el hidrolizado de caseina y extracto de malta,
que en algunas especies ayudan a mantener al tejido en crecimiento contínuo. En
cuanto a la adición de citocininas, hay algunos tejidos que las requieren para mantener
la proliferación de los mismos, mientras que para otros, aparentemente no son
necesarias. Lo que sucede en realidad es que ciertos tejidos tienen niveles endógenos
de citocininas suficientes para mantener su proliferación, por lo que no requieren de
una fuente exógena de las mismas.

Para tener datos más precisos acerca del crecimiento del tejido calloso cultivado
in vitro y, por lo tanto, para conocer el efecto de los reguladores del crecimiento u otros
tratamientos aplicados, debe determinarse la tasa de crecimiento del mismo. El
método más sencillo para hacer la determinación es mediante la medición del peso
fresco del tejido al momento de la inoculación y luego al final de cada subcultivo. Este
método tiene la ventaja de no dañar el tejido; sin embargo, se puede ver influido por
el estado de hidratación del mismo, por lo que no aporta un dato preciso sobre la
ganancia real de biomasa. Alternativamente se puede utilizar la ganancia en peso seco
como medida más precisa de la ganancia en biomasa del tejido, pero la desventaja
obvia de este método es la pérdida del tejido al hacer la determinación. Algunos otros
métodos para determinar la tasa de proliferación del tejido son la determinación del
número de células por unidad de peso, el índice mitótico y la tasa de respiración. El
tejido calloso puede mantenerse por tiempo indefinido cuando se hacen los subcultivos
apropiados; sin embargo, aquí hay un punto muy importante a considerar. Las
condiciones en que se mantiene el tejido calloso favorecen de una manera aun no
comprendida del todo, la aparición de cambios genéticos y epigenéticos como son las
aberraciones cromosómicas, mutaciones y diferentes tipos de ploidías que en conjunto
causan una gran variabilidad genética en estas células Estos cambios generalmente
causan una pérdida progresiva de la capacidad morfogénica de los tejidos Esta
capacidad es la que les permitiría regenerar órganos o plantas completas. Esto debe
tomarse en cuenta cuando se utiliza el tejido calloso para estudios genéticos o cuando
se pretende la regeneración plantas a partir del mismo.

USOS DEL TEJIDO CALLOSO

El tejido calloso tiene varias aplicaciones en el CTV. Primeramente, por su fácil

mantenimiento en condiciones controladas y su rápida proliferación, resulta un modelo
apropiado para estudios sobre el metabolismo celular, producción de compuestos

40
secundarios, fitotoxicología y ultraestructura celular. También es muy útil para el
estudio de los mecanismos celulares de respuesta a diferentes tipos de estrés como
déficit hídrico, salinidad, temperaturas extremas y ataque de patógenos, entre otros.
Por otro lado, los cultivos de células en suspensión, que tienen también varias
aplicaciones, usualmente se inician a partir de tejido calloso. Por último, el tejido
calloso puede ser un paso intermedio para la regeneración de plantas por las vías de
organogénesis y/o embriogénesis somática. En el primer caso, en el explante original
se induce la aparición de tejido calloso organogénico a partir del cual se da la formación
de brotes adventicios. A este proceso se le conoce también como organogénesis
indirecta. En el segundo caso, a partir del explante original (que en muchos casos es
un embrión cigótico), se induce la aparición de un tejido calloso embriogénico el cual
es mantenido en un medio rico en auxinas. La aparición de embriones somáticos a
partir de este tejido se da al reducirse o eliminarse las auxinas. No todo el tejido calloso
tiene potencial organogénico o embriogénico, por lo que la regeneración de plantas a
partir de este tejido no siempre es posible.

Debido a las variaciones genéticas y epigenéticas que aparecen en las células

del tejido calloso, es posible regenerar plantas fenotípicamente diferentes a la planta
original que fue utilizada como fuente del tejido. Este hecho hace que el tejido calloso
sea útil en programas de mejoramiento genético en los que la variabilidad genética
natural de algún cultivo importante está muy reducida. Siempre se debe tener una
fuente de variación genética de la cual se pueda partir para seleccionar individuos con
características agronómicas deseables.

41
a

Figura 7. Tejido calloso. a. Tumores inducidos por la infección de Kalanchoe tubiflora

con Agrobacterium tumefaciens de la cepa silvestre C58. Se trata de un tejido calloso
natural que se produce a causa de la sobreproducción de auxinas y citocininas
inducida por la infección. b. Tejido calloso de Pinus strobiformis inducido y cultivado
in vitro en un medio con 1 mg/l de 2,4-D y 0.5 mg/l de cinetina. c. Tejido calloso de
Allium tuberosum inducido y cultivado in vitro en un medio con 2 mg/l de 2,4-D
y 1 mg/l de cinetina.

42
 6. ORGANOGENESIS IN VITRO

Sin duda, una de las mayores ventajas que ofrece el cultivo de tejidos es la
posibilidad de regenerar plantas completas a partir de pequeños fragmentos de tejido
vegetal incubados en un medio artificial apropiado. Esto tiene aplicaciones inmediatas
en campos como la propagación masiva de plantas de alto valor y es un paso obligado
y fundamental para técnicas más sofisticadas, como la obtención de plantas
transgénicas.

Existen tres vías diferentes para la regeneración de plantas in vitro: la brotación

y proliferación de yemas, la embriogénesis somática y la organogénesis. En el primer
caso se parte de meristemos ya formados para la obtención a partir de ellos de una o
varias plantas completas, mientras que en la embriogénesis somática y la
organogénesis se parte de tejidos no meristematicos y se requiere un proceso de
desdiferenciación y rediferenciación de los tejidos para dar lugar a embriones
somáticos o brotes adventicios. Otra diferencia básica es que en el primer sistema, las
nuevas plantas se originan a partir de estructuras multicelulares, mientras que en los
sistemas de embriogénesis somática y organogénesis las nuevas plantas se originan
al parecer a partir de una sola célula.

El término organogénesis aplicado al cultivo in vitro de tejidos vegetales se

refiere a la formación de novo de órganos en los explantes cultivados. Entre los
órganos que se pueden formar están las raíces o los llamados brotes adventicios, los
cuales son estructuras muy similares a una yema y tienen la capacidad de originar una
nueva planta después de elongarse y formar raíces (Fig. 8).

El fenómeno de la organogénesis in vitro se basa en la llamada totipotencialidad

celular, es decir, cada célula posee toda la información genética necesaria para
constituir una planta completa o desempeñar las funciones de cualquier órgano o tejido
vegetal. Sin embargo, en condiciones normales este potencial no se expresa, y se
requieren condiciones extraordinarias como las que pueden derivarse del cultivo in
vitro para que una célula exprese su potencial y pueda originar un órgano o una planta
completa. Por otro lado, aun cuando en teoría cualquier célula viva que posea núcleo
es totipotente, se ha visto que en la realidad no todos los tipos celulares son capaces
de desencadenar el proceso de organogénesis, y la probabilidad de que esto suceda
decrece conforme se incrementa el grado de diferenciación de una célula. Según
Halperin (1986), esta incapacidad para manifestar la totipotencialidad celular se debe
a bloqueos que pueden actuar en tres niveles diferentes:

1. Bloqueo genético. En este caso no existe la totipotencialidad celular real o bien se

carece de algún factor genético indispensable para que ésta se manifieste, aun
cuando las señales externas (hormonales y de otro tipo) sean las requeridas para
desencadenar el proceso de organogénesis.
2. Bloqueo epigenético. En ocasiones puede existir un bloqueo estable, pero
reversible, en la expresión de aquellos genes responsables del proceso de

43
organogénesis. De esta forma, aun cuando las señales externas que desencadenan
la organogénesis estén presentes, las células son incapaces de responder a ellas.
3. Bloqueo fisiológico. Es el más sencillo de superar y se debe a la falta de las señales
apropiadas (hormonas, luz, etc.) para desencadenar el proceso de organogénesis. Al
darse estas señales se dará la manifestación de la totipotencialidad celular.

La organogénesis puede ser directa, cuando tiene lugar en el explante original,

o bien indirecta cuando primeramente se origina tejido calloso y luego se originan los
órganos a partir de este. Aun cuando la organogénesis in vitro es un proceso muy
utilizado en la actualidad, incluso con fines comerciales para la propagación de plantas,
es muy poco lo que se sabe acerca de los fenómenos fisiológicos, bioquímicos y
genéticos que la hacen posible. De manera general, se sabe que bajo las condiciones
adecuadas, ciertas células dentro de un explante comienzan a dividirse cambiando su
estado de diferenciación y dando lugar a regiones llamadas meristemoides. Los
meristemoides están compuestos por células pequeñas, isodiamétricas, de pared
celular delgada, varias vacuolas periféricas pequeñas y un núcleo grande en posición
central, lo cual corresponde a las características de las células meristemáticas
comunes. Cada uno de estos meristemoides es capaz de desarrollarse para dar lugar
a uno o varios brotes adventicios. El punto crítico en este proceso es el momento en
que una célula dentro del explante, usualmente parenquimatosa y vacuolada,
comienza a dividirse para dar lugar al grupo de células que componen el meristemoide.
A este proceso en concreto se le da el nombre de inducción. Existen dos visiones
básicas acerca del proceso de inducción, la primera de ellas, propone que en un
momento dado ciertas células dentro del explante sufren un aislamiento físico y/o
fisiológico con respecto al resto del tejido, lo cual acarrea una pérdida de los controles
externos y permite que las células aisladas expresen su potencial de desarrollo
dividiéndose y formando los llamados meristemoides. Una segunda visión, propone
que son los cambios cuantitativos en la disponibilidad de nutrientes y reguladores del
crecimiento en una célula en particular, lo que induce a ésta a dividirse y formar el
meristemoide (Hicks 1994). En la mayoría de los casos estudiados, los brotes
adventicios se originan a corta distancia del medio de cultivo, o bien del tejido vascular,
lo cual parece indicar que los gradientes fisiológicos que se dan dentro del explante
tienen mucho que ver con el desarrollo de los meristemoides. De acuerdo a los
conocimientos actuales, esta segunda visión puede ser la más acertada.

Entre los factores que contribuyen a la inducción de los brotes adventicios

destacan los reguladores del crecimiento, en particular, las citocininas y las auxinas.
En la mayoría de los casos, pero no en todos, se ha visto que la organogénesis suele
darse en presencia de proporciones elevadas de citocinina/auxina. Actualmente se
trabaja en el estudio de los genes asociados al proceso de organogénesis, así como
de los mecanismos moleculares de acción de las auxinas y citocininas, lo cual
seguramente permitirá en un futuro comprender y manipular de mejor manera el
proceso de la organogénesis. Además del mencionado papel de los reguladores del
crecimiento, hay un gran número de factores que afectan el proceso de la
organogénesis, los cuales se comentan a continuación:

44
Factores que dependen del explante.

 Genotipo
 Estado general de la planta donadora del explante
 Organo de donde se toma el explante
 Tejidos y tipos celulares presentes en el explante
 Tamaño del explante
 Edad fisiológica y ontogénica del tejido de donde proviene el explante
 Posición del explante dentro de la planta donadora
 Estación del año en que se toma el explante
 Pretratamientos aplicados al explante o a la planta donadora
 Posición y orientación en que se inocula el explante
 Densidad de inoculación

Factores que dependen del medio de cultivo.

 Reguladores del crecimiento (tipo, concentración y proporción de uno con respecto

a otro)
 Macro y micronutrientes
 Vitaminas
 Nitrógeno orgánico
 Fuente de carbono
 Suplementos nutritivos
 Consistencia del medio ( líquido o sólido )
 Tipo y concentración del gelificante en el caso de medio sólido
 Otros componentes ( antioxidantes, carbón activado, etc. )

Factores relacionados con el ambiente de incubación.

 Luz, obscuridad o fotoperíodo

 Tipo de luz
 Temperatura

Como se puede ver, el número de factores implicados en el proceso de

organogénesis es muy grande, y el fenómeno en sí aun no se comprende lo suficiente
como para manipularlo a partir de una base sólida de conocimientos. A pesar de ello,
la organogénesis puede llevarse a cabo en muchas especies vegetales de una forma
relativamente sencilla; sin embargo, los conocimientos prácticos que se tienen hasta
la fecha provienen en su inmensa mayoría de experimentos de ensayo y error. Debido
a esto, al trabajar con una especie por primera vez deberán montarse experimentos
que nos permitan desarrollar el mejor sistema para regenerar órganos a partir de ese
material vegetal. Algunas consideraciones para el montaje de estos experimentos son
las siguientes:

45
 Aun cuando la respuesta de cada especie e incluso de cada variedad vegetal a los
sistemas de cultivo in vitro suele ser propia y diferente a las demás, siempre es
conveniente buscar en la literatura trabajos sobre especies o variedades
relacionadas con la de interés, ya que estos pueden servir como base para el
montaje de los experimentos adecuados para el desarrollo del sistema de
regeneración mediante organogénesis.
 Usualmente las primeras variables a probar son el tipo de explante y los reguladores
del crecimiento. El tipo de explante depende de la especie, pero los más utilizados
son segmentos de hoja, cotiledón, hipocotilo o tallos jóvenes. En cuanto a los
reguladores del crecimiento, generalmente se plantean experimentos donde se
prueba el efecto de varias concentraciones de una citocinina combinada con varias
concentraciones también de una auxina. Las citocininas más frecuentemente
utilizadas son BA, CIN, ZEA y TDZ, mientras que como auxinas suelen utilizarse
AIA, ANA y en menor medida 2,4-D. Como medio base se recomienda uno de uso
general como el MS o el B5. Se recomienda realizar experimentos de manera
secuencial y tomar en cuenta los resultados de un experimento para el diseño del
siguiente, ya que de lo contrario el número de variables a probar puede ser
demasiado grande.
 Una vez conocida la respuesta de los diferentes tipos de explante a los reguladores
del crecimiento pueden tomarse únicamente los mejores tratamientos y probar otras
variables como macro y micronutrientes, compuestos orgánicos y condiciones de
incubación, con el fin de optimizar el sistema.
 Para determinar la eficiencia de un sistema se toman como parámetros el número
promedio de brotes por explante así como el porcentaje de explantes que presentan
brotes. Con el fin de manejar un solo valor es aconsejable utilizar como parámetro
la CFB ( Capacidad de Formación de Brotes; Pulido y col. 1992), la cual se deriva
de la siguiente expresión:

CFB = ( PROMEDIO DE BROTES POR EXPLANTE ) ( % DE EXPLANTES CON BROTES )

100

Aunque en la mayoría de los casos se determina la eficiencia de un sistema en

función del número de brotes producidos, es muy importante considerar también el
grado de diferenciación de los mismos. Los brotes poco diferenciados tienen una
menor probabilidad de producir una planta completa y pueden requerir un mayor
número de subcultivos para que esto suceda.

Por último, es aconsejable diseñar los experimentos de tal forma que los
resultados puedan ser sometidos a un análisis estadístico que nos facilite la elección
de los mejores tratamientos. Para esto suele utilizarse, aunque no siempre, un diseño
completamente al azar o de bloques al azar, para practicar luego un análisis de
varianza seguido de una prueba de Duncan, de Tukey o de diferencia mínima
significativa (DMS).

46
a

47
 c

Figura 8. Organogénesis. a. Organogénesis en Pinus maximartinezii. Aparición de

brotes adventicios a lo largo de un cotiledón procedente de un embrión maduro tratado
con altas concentraciones de BA (10 mg/l por 12 días). b. Organogénesis en limón
mexicano (Citrus aurantifolia). Aparición de brotes adventicios sobre heridas
practicadas en un segmento internodal de tallo. Se utilizó un medio de cultivo con una
alta concentración de BA (7.5 mg/l) combinada con una baja concentración de ANA (1
mg/l). c. Organogénesis en guayabo (Psidium guajava). Brotes adventicios generados
sobre la nervadura central de una hoja cultivada en presencia de TDZ (0.5 mg/l) y ANA
(0.5 mg/l). Nótese la presencia de brotes adventicios bien diferenciados del lado
izquierdo y de brotes en sus primeras etapas de diferenciación del lado derecho.

48
 7. EMBRIOGENESIS SOMATICA

Una de las características más notables del cultivo de tejidos vegetales es que
ciertas células, y bajo ciertas condiciones de cultivo in vitro, tienen la capacidad de
formar embriones mediante un proceso muy similar a la embriogénesis cigótica. A este
proceso se le denomina embriogénesis somática y es una de las pruebas más notables
de la totipotencia celular. Los embriones somáticos tienen, al igual que los cigóticos,
la capacidad de formar una nueva planta después de un proceso de germinación, con
la diferencia de que la embriogénesis somática es un proceso asexual por lo que la
nueva planta será exactamente igual a la donadora de la célula inicial. La
embriogénesis somática no es un proceso que suceda únicamente en cultivos in vitro,
de hecho es relativamente común en algunas familias de plantas y se conoce como
apomixis (Kiran y Thorpe 1995).

Para que una célula vegetal lleve a cabo el proceso de embriogénesis somática
debe estar “determinada” o “inducida”. Por lo anterior, las células capaces de formar
embriones somáticos reciben el nombre de células embriogénicas determinadas (CED
o EDC por sus iniciales en inglés) o células proembriogénicas. Este proceso de
inducción aun no se conoce con exactitud pero se sabe que implica un cambio drástico
en los patrones de expresión genética mediante el cual las células pasan del patrón
normal a uno embriogénico.

Existen dos tipos de embriogénesis somática in vitro, la directa (ESD) y la

indirecta (ESI). En la embriogénesis somática directa, los embriones aparecen
directamente sobre el explante original. Un ejemplo es la aparición de embriones
somáticos en tejidos nucelares de cítricos y otras especies. Por otro lado, en la
embriogénesis somática indirecta, en un primer paso es indispensable obtener un
tejido calloso o bien una suspensión celular embriogénica a partir de la cual se
obtendrá la diferenciación de los embriones somáticos en un segundo paso. Este es
un proceso mucho más complejo que la ESD. Se supone que la ESD se da cuando
en el explante original existen ya células proembriogénicas, por lo que no es necesario
el proceso de inducción y solo se requiere proporcionar al tejido las condiciones
adecuadas para que suceda la diferenciación de los embriones somáticos. En la ESI,
el explante original no tiene células proembriogénicas, por lo que se requiere primero
darle al tejido las condiciones para que ocurra la inducción y luego cambiarlo a otras
que sean propicias para la diferenciación de los embriones. Las células de tejidos muy
jóvenes, como por ejemplo los embriones cigóticos inmaduros, son ya en una buena
proporción células proembriogénicas, o si no, son fácilmente inducibles para que lo
sean. Por el contrario las células más diferenciadas o de tejidos adultos muy
difícilmente o casi nunca se llegan a convertir en proembriogénicas. Esto explica por
qué la embriogénesis somática resulta sencilla en algunos tejidos y prácticamente
imposible en otros.
El proceso de embriogénesis somática consta de varias etapas (Fig. 9 y 10), en
cada una de las cuales se requieren diferentes estímulos y ocurren fenómenos
diferentes (Merkle et al. 1995). A continuación se detallan estas etapas.

49
 Inducción. Es el proceso de conversión de una célula somática a una célula
proembrigénica. Se considera que los factores determinantes para que suceda el
proceso de inducción son: 1. Genotipo. Se sabe que diferentes genotipos aun de
una misma especie muestran diferencias notables en la capacidad para activar los
elementos clave que se requieren para iniciar el proceso de embriogénesis
somática. Lo anterior hace que ciertos genotipos sean más propensos a la
embriogénesis somática, mientras que en otros esta vía de regeneración sea
prácticamente imposible. 2. Grado de diferenciación de las células del explante.
Como ya se mencionó, la embriogénesis somática es mucho más factible en tejidos
jóvenes muy poco diferenciados, y prácticamente imposible en tejidos maduros
completamente diferenciados. 3. Auxinas. La presencia de auxinas es un factor
determinante para que ocurra el fenómeno de inducción. Se sabe que la presencia
de este tipo de reguladores del crecimiento estimula entre otras cosas la metilación
del ADN, lo cual puede favorecer el cambio del patrón de expresión genética que
se requiere para que ocurra la inducción. Entre las auxinas más efectivas para la
inducción de la embriogénesis somática se encuentran las sintéticas, como por
ejemplo los ácidos fenoxiacéticos (2,4-D, ac. clorofenoxiacético y 2,4,5-T). Esto se
debe a que las células vegetales son incapaces de degradar o inactivar
eficientemente las auxinas sintéticas como lo hacen con las auxinas naturales, por
lo que sus efectos son más intensos y duraderos. 4. Aislamiento celular. Se sabe
que el aislamiento de una célula o de un grupo de células con respecto al resto del
tejido estimula también la inducción o conversión de una célula somática en
proembriogénica. Este aislamiento sucede cuando hay necrosis en el tejido
adyacente o bien cuando se aplican tratamientos físicos para separar las células.
La presencia de auxinas puede contribuir también a este aislamiento celular al
promover la friabilidad del tejido.

 Histodiferenciación. En esta etapa las masas de células proembriogénicas se

diferencian formando embriones somáticos, mediante una división y diferenciación
celular simultáneas. Para que estas células cesen su multiplicación y pasen a una
fase de diferenciación se requiere la eliminación de las auxinas exógenas. Uno de
los fenómenos iniciales en esta etapa es el establecimiento de una polaridad en las
masas de células proembriogénicas. Esta polaridad se mantendrá durante todo el
desarrollo del embrión. Durante la etapa de histodiferenciación, los embriones
somáticos pasan por una serie de estadios intermedios muy similares a los que
ocurren en la embriogénesis cigótica. En las dicotiledoneas estos estadios son :
globular, de corazón y de torpedo, mientras que en las monocotiledoneas son:
globular, coleoptilar y escutelar.

 Maduración. Normalmente un embrión somático en estadio de torpedo aun no tiene

la capacidad de germinar. Para que se adquiera esta capacidad se requiere una
fase de maduración durante la cual ocurre básicamente una elongación celular ya
sin división. Para la mayoría de las especies se sabe que los estímulos que hacen
posible la maduración son el ácido abscísico y la desecación. En el caso de las

50
 dicotiledoneas, al embrión somático maduro se le da el nombre de estadio
cotiledonario.

 Germinación. Es el proceso de elongación y reactivación metabólica de un embrión

somático maduro para convertirse en una plántula. Para que esto suceda se
requieren estímulos como la luz, el ácido giberélico o citocininas. Obviamente, los
embriones somáticos carecen de tejidos de reserva por lo que su germinación solo
ocurre in vitro en donde el medio de cultivo aporta los nutrientes, o bien, cuando se
les proporcionan depósitos artificiales de nutrientes (semillas artificiales).

La embriogénesis somática se ha conseguido con éxito en un menor número de

especies que la organogénesis, debido a que es un fenómeno en apariencia más
complicado. Sin embargo, cuando esta es posible, su productividad en cuanto al
número de plantas que se pueden generar es mayor. Debido al origen presuntamente
unicelular de los embriones somáticos, ésta es una vía de regeneración aplicable a la
transformación genética. Por otro lado, la embriogénesis somática sirve como base
para la producción de semillas artificiales, que no son más que embriones somáticos
encapsulados en una matriz que contiene nutrientes que hace las veces de tejido de
reserva, y en algunos casos inhibidores como el ácido abscísico que detienen la
germinación prematura.

Para el montaje de un sistema de embriogénesis somática, las variables

principales a manejar son el tipo de explante, y el tipo y concentración de auxinas a
utilizar para la inducción del tejido proembriogénico. Los explantes más utilizados
suelen ser embriones sexuales con diferentes estadios de maduración, y en menor
medida, cualquier tejido somático de la planta.

Por último, existen algunas diferencias básicas entre los embriones somáticos
y los brotes adventicios, las cuales nos permiten identificar el tipo de sistema de
regeneración en los casos en que existan dudas al respecto. A continuación se
mencionan estas diferencias:

 Los embriones somáticos son estructuras polares, en las cuales siempre son
visibles un ápice y una radícula, mientras que en la organogénesis las estructuras
formadas son unipolares, conteniendo sólo un ápice ( brote adventicio ) o raíz.
 Los embriones somáticos no tienen una conexión vascular con el explante original,
por lo que son estructuras relativamente independientes al mismo. Por su parte, los
brotes adventicios conservan usualmente su conexión con el sistema vascular del
explante inicial.
 En los embriones somáticos, las primeras hojas tienen la morfología aproximada de
los cotiledones, lo cual no sucede con los brotes adventicios.
 A nivel molecular, los embriones somáticos expresan una serie de proteínas propias
del proceso de embriogénesis cigótica, las cuales nunca aparecen en los brotes
adventicios. A estas proteínas se les considera como marcadores moleculares del
proceso de embriogénesis.

51
 TEJIDO
CALLOSO
INDUCCION
+ auxinas
MASAS DE
CELULAS
PROEMBRIO-
GENICAS

EMBRIONES
EN ESTADO
GLOBULAR

HISTO-
EMBRIONES DIFERENCIACION
EN ESTADO DE
CORAZON
- auxinas

EMBRIONES
EN ESTADO DE
TORPEDO

MADURACION

ABA
desecación
EMBRIONES
EN ESTADO
COTILEDONARIO

GERMINACION
PLANTULAS

Figura 9. Proceso de la embriogénesis somática indirecta

52
a

Figura 10. Embriogénesis somática. a. Cultivo embriogénico de Acacia farnesiana.

Notese la presencia de células grandes de forma alargada no embriogénicas, y de
células pequeñas de forma esférica que forman masas proembriogénicas en la
suspensión celular. b. Diferentes etapas del desarrollo de embriones somáticos de
Acacia farnesiana.

53
 8. CULTIVO DE MERISTEMOS, YEMAS Y APICES

A pesar de que las plantas tienen la capacidad de crecer continuamente, no

todas sus células se dividen bajo condiciones normales, por lo que el crecimiento de
una planta se debe a la presencia de un tipo especial de tejido que conserva siempre
la capacidad de dividirse. A este tipo de tejido se le da el nombre de meristemo o tejido
meristemático y está constituido por células pequeñas, no diferenciadas, con una alta
relación núcleo/citoplasma, vacuolas muy pequeñas, paredes celulares delgadas y
plastidios no diferenciados (proplastidios). Los meristemos se localizan únicamente en
ciertas zonas o puntos de crecimiento de la planta como los ápices, axilas, ápices de
la raíz, zona del cambium y felógeno.

Los meristemos apicales y axilares (contenidos dentro de las llamadas yemas),

al ser de manera natural los puntos de crecimiento en los vegetales tienen la capacidad
de formar nuevos brotes. Esa capacidad natural la mantienen cuando se establecen y
cultivan in vitro. Debido a lo anterior, el cultivo de yemas apicales o axilares es una
manera sencilla de obtener nuevos brotes, los cuales pueden enraizarse y producir así
nuevas plantas. Este sistema de propagación se basa, por lo tanto, en la formación de
nuevos brotes a partir de meristemos preexistentes, por lo que no implica fenómenos
de desdiferenciación y rediferenciación celular como los que ocurren en la
organogénesis y embriogénesis somática. La propagación por cultivo de meristemos
y yemas es un sistema de regeneración menos complejo que cuando esto se hace por
medio de organogénesis o embriogénesis somática.

A continuación se mencionan algunas características del mismo y algunas de

sus ventajas y desventajas:

 Es un sistema ideal para la propagación clonal, ya que ofrece la máxima estabilidad

genética, lo cual no sucede siempre en la organogénesis y embriogénesis somática.
 El sistema es relativamente sencillo, y es muy similar en todas las especies, por lo
que no requiere de demasiada experimentación para encontrar las condiciones
adecuadas. Sin embargo, la propagación por yemas en general es más lenta y
menos productiva que la organogénesis y la embriogénesis somática.
 El sistema de cultivo de meristemos, solo o combinado con termoterapia o
quimioterapia, nos permite la obtención rápida de plantas libres de patógenos,
incluso de virus y viroides. Esto tiene una enorme importancia sobre todo en cultivos
que se propagan vegetativamente, ya que es la única forma de obtener material
sano. Esta metodología se ha aplicado con mucho éxito en la producción de plantas
de clavel, papa y cítricos libres de virus.
 Este sistema de propagación es el ideal para ser utilizado en la conservación in vitro
de germoplasma, ya sea mediante crecimiento retardado o criopreservación. El
cultivo de yemas o meristemos facilita el transporte de material vegetal sin el acarreo
de problemas fitosanitarios.
 Entre las desventajas más importantes de la propagación mediante el cultivo de
meristemos o yemas se puede mencionar la alta sensibilidad de los tejidos a los

54
 métodos de esterilización superficial, por lo que esto se debe hacer con mucho
cuidado. Otra dificultad la presentan las plantas leñosas que producen altas
cantidades de compuestos fenólicos. Por último, este sistema de propagación es
propicio para que se presente la vitrificación en algunas especies.
 Debido al origen multicelular de los nuevos brotes, este sistema no es recomendable
para la obtención de plantas transformadas genéticamente por los métodos
convencionales; sin embargo, últimamente han aparecido trabajos de
transformación genética basados en la inoculación de meristemos apicales con
Agrobacterium tumefaciens, los cuales se dejan crecer y producir estructuras
reproductivas. En la progenie de éstas plantas ha sido posible la selección de
transformantes.

De acuerdo al tipo de explante utilizado, el cultivo de tejidos meristemáticos se

puede dividir en tres tipos básicos:

Cultivo de meristemos.

En este caso deben aislarse los meristemos mediante disección con ayuda de
un microscopio. El explante aislado es muy pequeño, usualmente de menos de 1 mm
de diámetro, y consta del domo apical del meristemo con un pequeño número de
primordios foliares. Se excluye el tejido vascular diferenciado. El aislar y trabajar con
explantes tan pequeños implica una cierta dificultad; además, el mismo tamaño del
explante reduce la probabilidad de que se establezca y prospere in vitro, y se requiere
generalmente un medio de cultivo más complejo. Sin embargo, a medida en que el
explante es de menos tamaño, tiene una mayor probabilidad de estar libre de
patógenos. El principal uso de este tipo de cultivo es la producción de plantas libres de
virus y de cualquier otro agente patógeno (Grout 1990). Para asegurar esta liberación
de patógenos, el método puede combinarse con algún tipo de quimioterapia, o en el
caso de virus, con termoterapia. Esta última consiste en incubar la planta completa o
fragmentos de ella a altas temperaturas antes de aislar el meristemo. Usualmente
estos tratamientos son 7-9 días a 40  C o de 16-168 días a 32  C. Una vez obtenidas
las plantas mediante el proceso anterior, éstas deben analizarse mediante métodos
serológicos o moleculares para confirmar la ausencia de patógenos específicos.

Cultivo de yemas axilares.

En este sistema, el tamaño del explante no es determinante ya que solo se

requiere que éste lleve una o más yemas axilares, a partir de las cuales se dará la
producción de brotes. Este es el método más sencillo para la micropropagación de
plantas, y puede ser acoplado a otros sistemas cuando se requiere incrementar de
manera segura el material. Por ejemplo, una vez obtenida una planta libre de
patógenos, esta puede propagarse por yemas y después de varios ciclos incrementar
exponencialmente el número de individuos (Evans 1990) (Fig. 12).

Cultivo de ápices.

55
 Para el cultivo de ápices, se toman explantes apicales de 4 - 10 mm de longitud,
los cuales contienen además del meristemo, varios primordios foliares así como tejido
vascular diferenciado. Este método es más sencillo que el anterior debido a la
manipulación de explantes más grandes y a la mayor probabilidad de supervivencia
de los mismos. Sin embargo, este método no es aplicable cuando se pretende obtener
plantas libres de patógenos.

En cuanto al medio de cultivo requerido para este tipo de propagación, éste

suele ser sencillo (excepto para el cultivo de meristemos en algunas especies),
pudiéndose utilizar el medio MS o B5 sólido o líquido. La adición de citocininas (0.5 -
10 mg/l), puede favorecer la brotación múltiple, es decir, que de una yema se obtengan
varios brotes. Una recomendación importante es el asegurarse de que al inocular el
explante, la yema quede en contacto con el medio, ya que de esta forma se acelera la
respuesta.

Por último, existe una variante más aparte del cultivo de meristemos y yemas,
y es el microinjerto in vitro. En este caso, el meristemo aislado no se cultiva sobre un
medio artificial sino que se injerta sobre un pequeño patrón in vitro; de esta manera se
obtienen plantas ya injertadas al sacarlas a suelo. El microinjerto se utiliza por ejemplo
para la producción de cítricos libres de patógenos (Parkinson y col. 1990).

La figura 11 resume el sistema de propagación por cultivo de meristemos o

yemas.

56
PLANTA EN SUELO
APICE

MERISTEMO

ESTERILIZACION
Y BROTACION Y
ESTABLECIMIENTO MULTIPLI-
IN VITRO CACION IN
VITRO

YEMA
AXILAR

CICLOS DE
MULTIPLICACION

BROTES
ENRAIZA- GENERADOS
MIENTO IN VITRO
IN VITRO O OBTENCION
IN VIVO DE NUEVAS
YEMAS Y
APICES

Figura 11. Sistema de propagación por cultivo de meristemos o yemas.

57
 a

b
Figura 12. Micropropagación por cultivo de yemas axilares. a. Producción de brotes
múltiples en Mammillaria candida a través del cultivo de explantes conteniendo yemas
axilares (areolas o mamilas en el caso de las cactáceas). b. Producción in vitro de
brotes múltiples a partir de yemas tomadas de un árbol adulto de Taxodium
mucronatum.

58
 9. MICROPROPAGACION

Se le llama micropropagación a la propagación asexual de plantas utilizando las

técnicas de cultivo de tejidos in vitro. Esta es una de las aplicaciones más utilizadas
de entre todas las técnicas que componen la llamada biotecnología vegetal, ello se
debe a su enorme productividad al comparársele con las técnicas tradicionales de
propagación de plantas. Las principales ventajas que ofrece la micropropagación son
las siguientes:

 Se trata de un sistema de propagación clonal, es decir que mantiene todas las

características genotípicas del material inicial seleccionado. Debido a esto es un
sistema ideal para la multiplicación masiva de plantas o variedades con
características sobresalientes.
 Debido a que se realiza todo el proceso en un laboratorio bajo ambientes
controlados, se trata de un sistema totalmente independiente de las condiciones
externas por lo que no se ve afectado por las estaciones del año, sequías, heladas,
altas temperaturas u otros factores ambientales.
 El número de plantas que se puede obtener mediante micropropagación es por su
naturaleza prácticamente ilimitado. El único límite que se puede tener es la
capacidad misma del laboratorio en que se realiza el proceso.
 El espacio que se requiere es mínimo y el tiempo en que puede realizarse el proceso
es relativamente corto.
 Las plantas que se obtienen están libres de bacterias, hongos y nemátodos
fitopatógenos, y con técnicas más específicas se pueden liberar incluso de virus y
viroides. Por este motivo, las plántulas producidas mediante sistemas de
micropropagación presentan una mayor calidad si se les compara con las obtenidas
por métodos tradicionales. Además, se tiene la ventaja de que estas plantas pueden
enviarse más fácilmente a otros países debido a que hay menos impedimentos
fitosanitarios.

Las principales desventajas que tiene la micropropagación son el costo inicial

del laboratorio y los requerimientos de personal con un nivel alto de capacitación, el
cual no siempre está disponible. En cuanto a los costos de producción, éstos no son
realmente tan elevados como podría parecer y pueden obtenerse precios bastante
competitivos sobre todo en especies de alto valor o de aquellas que son de difícil
propagación por métodos tradicionales, como por ejemplo las ornamentales, frutales y
forestales. En cuanto al problema de la capacitación del personal, esto se resolverá en
la medida en que las técnicas se incorporen a los programas de estudio de las carreras
técnicas y profesionales del área agrícola y biológica.

La micropropagación de cualquier especie vegetal consta de cinco etapas

básicas, cada una de ellas fundamental para el éxito del sistema.

Etapa 0. Selección de las plantas madre

59
 Se trata de una etapa preparativa, en la cual se seleccionan y acondicionan las
plantas madre que serán utilizadas para iniciar los cultivos in vitro. Aunque en muchas
ocasiones es subestimada, se trata de una parte fundamental para el éxito de la
micropropagación. Debe recordarse que se trata de un sistema de propagación clonal,
por lo que todas las plantas generadas tendrán las características genotipicas de la
planta madre. Si se parte de una planta elite con características deseables superiores
al promedio, las plantas generadas tendrán un alto valor. En algunas ocasiones, no
basta con elegir correctamente el material inicial, sino que se requieren ciertos
pretratamientos del mismo. El primer tipo de pretratamientos está encaminado a
disminuir la probabilidad de contaminación microbiana en la Etapa 1 (inicio del cultivo
axénico), y consiste en sanear a las plantas madre antes de la toma de los explantes.
Esto se logra transladándolas a un ambiente higiénico (invernadero, por ejemplo) y
tratando periódicamente con fungicidas por 1-4 meses. En caso de que persista el alto
índice de contaminación, una alternativa es realizar una poda severa de la planta
permitiendo que los nuevos brotes se originen en un ambiente menos contaminado.
Existe un segundo tipo de pretratamientos encaminados a cambiar el estado fisiológico
de la planta y de esta manera favorecer el establecimiento de los cultivos in vitro. Para
ello se utilizan cambios en la temperatura, iluminación, fotoperíodo, fertilización,
aplicación de reguladores del crecimiento o podas severas para rejuvenecimiento.

Etapa 1. Establecimiento de los cultivos axénicos

Esta etapa consiste básicamente en la elección del explante y la esterilización

del mismo para iniciar un cultivo axénico. La elección del explante depende mucho de
la especie y del sistema de proliferación que se aplique en la etapa 2. Para los sistemas
de propagación por yemas o meristemos, los explantes iniciales generalmente se
toman de individuos adultos. Por otra parte, para la organogénesis el tipo de explante
es variable, pudiendo ser segmentos de hoja, tallo o tejidos juveniles tomados de
plántulas. En el caso de la embriogénesis somática, los explantes suelen ser, tejidos
nucelares y embriones sexuales inmaduros. Los métodos para la esterilización de los
explantes iniciales se mencionaron anteriormente. Por último, casi siempre es de
esperarse un bajo porcentaje de establecimiento exitoso de los tejidos in vitro debido
a los problemas de adaptación y contaminación; sin embargo, no se requiere mucho
material para iniciar la etapa 2 , ya que es en ésta en donde se dará la proliferación.
Etapa 2. Multiplicación del tejido

Es en esta etapa donde se realiza verdaderamente la micropropagación,

obteniéndose un gran número de nuevos brotes a partir de cantidades mínimas de
tejido. Existen tres vías para la multiplicación in vitro: la organogénesis, la
embriogénesis somática y la multiplicación por yemas, ápices o meristemos. Las
características y ventajas de cada una de ellas se han mencionado anteriormente.
Cabe recalcar que los sistemas de organogénesis y de embriogénesis somática,
aunque pueden ser más rápidos y/o productivos que la propagación por yemas, ápices
o meristemos, son más susceptibles a la generación de variantes en las plantas
obtenidas, lo cual puede ser negativo en un esquema de propagación clonal.

60
Etapa 3. Elongación y enraizamiento

Por lo general, lo que se obtiene en la etapa 2 son pequeños brotes, en la

mayoría de los casos carentes de raíz y con poca probabilidad de adaptarse con éxito
a las condiciones ambientales externas. En la etapa 3 lo que se pretende es que los
brotes formen su sistema radical al mismo tiempo que se elonguen para facilitar su
manipulación y hacer más probable su adaptación a las condiciones ambientales
externas. El enraizamiento se puede lograr separando los brotes y transfiriéndolos a
un medio de cultivo apropiado. La formación de raíces se favorece en medios diluidos
conteniendo auxinas (ej. AIB 0.1 - 1.0 mg/l) o carbón activado (3 -5 g/l).
Alternativamente, se puede intentar el enraizamiento in vivo, transfiriendo los brotes
generados en la etapa 2 directamente al substrato previa aplicación de un enraizador
comercial, y manteniendo el ambiente con alta humedad relativa. En este caso se
incrementa la mortalidad al momento de transferir al substrato, pero se evita una etapa
completa de la micropropagación, por lo que debe analizarse la conveniencia del
enraizamiento in vivo para cada especie.

Etapa 4. Adaptación al medio externo

Las plantas generadas in vitro presentan varias características peculiares que

dificultan su adaptación al medio externo una vez concluido el período de cultivo. A
continuación se detallan las más importantes:

 La humedad relativa dentro de los recipientes de cultivo suele ser muy alta, lo que
provoca que las plantas generadas in vitro carezcan de algunos de los sistemas
normales para evitar la pérdida de agua. Por ejemplo, su cutícula esta poco
desarrollada y el mecanismo de cierre de los estomas está atrofiado. Por ello, el
proceso de adaptación al ambiente externo de una planta generada in vitro debe ser
lo más gradual posible, siendo lo más recomendable una reducción lenta de la
humedad relativa, primero en el recipiente de cultivo y luego fuera de éste para
permitir así el desarrollo paulatino de los sistemas de protección de la planta contra
la desecación. Se han probado diferentes antitranspirantes para proteger a la planta
durante este período crítico, entre ellos las soluciones de glicerol o algunas ceras
líquidas, pero los resultados no siempre han justificado el uso de estos compuestos.

 Las plantas durante su cultivo in vitro no realizan una fotosíntesis normal y sus
requerimientos de carbono son satisfechos por el medio. La anatomía de las hojas
difiere de la de las plantas que crecen in vivo, siendo éstas por lo general más
delgadas y con menor concentración de clorofilas. Es por todo ello que el paso de
las plantas generadas in vitro hacia la autotrofía debe ser gradual, exponiéndoseles
a incrementos paulatinos en la intensidad luminosa. De cualquier forma, es de
esperarse un balance negativo en la adquisición de carbono durante las primeras
semanas a partir de que se eliminó el medio de cultivo, las plantas deberán ser lo
suficientemente vigorosas para soportar esto.

61
 Por tratarse de sistemas de cultivo axénicos, las plantas no han generado
resistencias naturales contra los microorganismos potencialmente nocivos, por lo
que es recomendable trabajar durante las primeras fases de la adaptación bajo las
condiciones más higiénicas posibles. Asimismo, se recomienda eliminar cualquier
remanente del medio de cultivo que pudiera quedar adherido a la planta, ya que
este por su alto contenido de sacarosa podría favorecer el crecimiento de estos
microorganismos.

Una evidencia para determinar el momento en que la adaptación puede

considerarse exitosa, es la aparición de hojas nuevas después de la transferencia al
substrato. En este momento es cuando deberá reducirse la humedad e incrementarse
la luz. La adaptación de las plantas generadas in vitro a las condiciones externas es
un factor determinante para la costeabilidad de un sistema de micropropagación, ya
que de nada sirve un sistema de proliferación muy productivo, si el porcentaje de
plantas que sobrevivirán a la adaptación es bajo. Existen en el mercado recipientes de
cultivo cuyas características permiten un cierto intercambio gaseoso con el ambiente
externo y disminuyen la diferencia entre la humedad relativa interna y la externa. Con
esto se puede acortar el período de adaptación de las plantas a las condiciones
externas.

Micropropagación: Consideraciones económicas

Dado que la micropropagación ha pasado de ser una herramienta utilizada en

la investigación a un proceso productivo con un potencial económico muy amplio, es
necesario tomar en cuenta otras consideraciones además de las meramente científicas
cuando se desea aplicarcon fines comerciales. Muchas veces no basta tener un
sistema de micropropagación muy productivo, sino que hay que tomar en cuenta otro
tipo de factores como los siguientes (Zimmerman 1991):

 ¿Cómo se producen actualmente las plántulas de la especie que nos interesa

micropropagar?, ¿dónde se localizan los centro de producción, cuál es el costo de
producción y cuál el margen de ganancia bajo los sistemas tradicionales de
propagación?. No siempre los sistemas de micropropagación pueden competir con
éxito con los sistemas tradicionales.
 ¿Cuál es el mercado potencial de la especie que se desea micropropagar ?, ¿qué
porcentaje del mismo está cubierto por los sistemas tradicionales de propagación?.
¿Puede la micropropagación competir en este mercado utilizando algunas de sus
ventajas como lo serían la producción fuera de la temporada normal, el bajar los
precios o introducir nuevas variedades ?.
 En cuanto a las variedades, ¿hay regulaciones mediante patentes ?, ¿con qué
frecuencia aparecen en el mercado nuevas variedades y de dónde provienen
estas?, ¿puede el sistema de micropropagación adaptarse a la multiplicación de
nuevas variedades al ritmo que lo exige el mercado ?

Por otra parte, se sabe que la mano de obra representa entre el 60 y el 80% del
costo final de las plantas micropropagadas, y también que se debe contar con personal

62
capacitado dedicado a la investigación y desarrollo de los sistemas de
micropropagación, así como de la resolución de los problemas que se presenten
durante la producción (contaminación, vitrificación, pérdida de vigor, etc.).

La micropropagación de plantas es en la actualidad una industria de gran

importancia en varios países del mundo, habiendo desplazado en muchos casos a los
sistemas tradicionales de producción de plántulas. En Europa occidental para el año
de 1988 se produjeron 216.46 millones de plantas mediante sistemas de
micropropagación, destacando los laboratorios instalados en Holanda, Francia, Italia,
Bélgica, Alemania, España e Inglaterra. En cuanto al tipo de plantas, las más
importantes fueron:

Ornamentales de maceta 92.33 millones

Flores para corte 37.84 millones
Frutales 19.42 millones
Ornamentales de bulbo 13.16 millones
Orquídeas 5.28 millones
Especies forestales 1.29 millones
(Zimmerman 1991)

En cuanto a los países de Europa oriental, destaca la industria de

micropropagación establecida en Polonia, aunque con volúmenes de producción
menores a los antes mencionados. Para los E.U.A., se dispone de datos del año de
1985, cuando se produjeron unos 65 millones de plantas mediante la
micropropagación, destacando las ornamentales, forestales, frutales y orquídeas. En
Asia se producen entre 65 y 86 millones de plantas al año mediante el sistema
mencionado, de las cuales unos 38 millones son orquídeas, destacando Japón,
Tailandia, Singapur y Malasia (Zimmerman 1991). Se sabe también de la existencia
de una industria emergente de micropropagación de plantas en algunos países de
América Latina.

En México, la industria de la micropropagación se concentra en plantas

ornamentales y algunos cultivos hortícolas, entre los que destaca la papa. La
producción de propagulos de papa a base de mini y microtubérculos en México se
inicia en algunas dependencias como la Universidad Autónoma Chapingo, el Colegio
de Posgraduados, el Programa de Papa del Instituto Nacional de Investigaciones
Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) y la Delegación del Centro Internacional de
la Papa en México. Posteriormente se ha extendido la validación de las técnicas de
micropropagación de papa a otras universidades del país y, lo más importante, es que
esta metodología ha sido asimilada por algunos productores que en distintas partes de
la República manejan sus propios sistemas de producción de minitubérculos y
distribuyen sus excedentes entre productores que no cuentan con sus propios
laboratorios de micropropagación. Los datos del número de laboratorios e
invernaderos, así como de la producción de microtubérculos de papa se presentan en
las tablas 6 (Datos proporcionados por la Confederación Nacional de Productores de
Papa de la República Mexicana).

63
Tabla 6. Laboratorios e invernaderos en operación en México para laproducción de
plántulas y microtubérculos de papa.

Año Laboratorios Invernaderos

1988 2 2
1989 - 1
1990 2 2
1991 1 2
1992 1 3
1993 3 3
1994 1 3
1995 - 1
Total 10 17

Tabla 7. Producción de plantas micropropagadas y microtubérculos de papa en

laboratorios de cultivo de tejidos vegetales e invernaderos.

Año Plantas Plantas Micro-tubérculos Micro-tubérculos:

micropropagadas micropropagadas: acumulado
acumulado
88-89 315 000 315 000 1 625 000 1 625 000
90-91 323 000 638 000 2 548 000 4 173 000
92-93 832 000 1 470 000 4 530 000 8 703 000
94-95 216 000 1 686 000 512 000 9 215 000

Tabla 8. Ubicación y superficie (m2) de los laboratorios e invernaderos dedicados a la

micropropagación de papa en México.

Entidad Superficie de Laboratorios Superficie de invernaderos

Estado de México 943 5 030
Chihuahua 900 3 202
Guanajuato 254 3 963
Baja California 100 1 200
Coahuila-Nuevo León --- 8 100
Sinaloa --- 2 500
Total 2 197 23 995

En cuanto al futuro de la industria de la micropropagación, en los países

desarrollados la tendencia es hacía la automatización y a la mayor especialización de
los laboratorios en la producción de una o algunas cuantas especies. Están en
desarrollo sistemas de embriogénesis somática a gran escala e incluso sistemas de
producción de semillas artificiales. En los países menos desarrollados, el futuro de esta
industria podría estar ligado a la producción y explotación de especies locales de gran

64
potencial, sin descuidar el importante papel de estos sistemas en la propagación de
especies amenazadas permitiendo su explotación sin poner en peligro a la especie.

En la figura 13 se presenta un esquema general de un sistema de

micropropagación, y en las figuras 14 y 15 algunos aspectos concretos de este
proceso.

SELECCION DE LA ESPECIE A
TRABAJAR

PRETRATAMIENTOS

ELECCION DE LAS PLANTAS

MADRE.
PLANTAS ELITE
ETAPA 0

ESTABLECIMIENTO DE LOS
CULTIVOS AXENICOS
ELECCION Y ESTERILIZACION ETAPA 1
DEL EXPLANTE

CICLOS DE MULTIPLICACION
DE ACUERDO AL NUMERO DE
PLANTAS DESEADAS

MULTIPLICACION IN VITRO
ETAPA 2

ELONGACION Y
ENRAIZAMIENTO
ETAPA 3
ADAPTACION A SUELO
ETAPA 4
DISTRIBUCION Y
COMERCIALIZACION

65
Figura 13. Esquema general de un sistema de micropropagación.

a b
A

d
c
A

Figura 14. Etapa 2 de la Micropropagación. a. Producción de brotes en un cultivo in

vitro de Agave lechuguilla. b. Producción de brotes en un cultivo in vitro de Anthurium
andreanum. c. Masas de brotes de Allium tuberosum generados in vitro. d.
Proliferación masiva in vitro de protocormos de la orquídea Oncidium sp. Cada
protocormo se convertirá en una nueva planta en la etapa 3 de la micropropagación.

66
 A B
A

Figura 15. Etapas 3 y 4 de la Micropropagación. a. Elongación y enraizamiento de

plantas de la orquídea Oncidium sp. b. Plantas micropropagadas de la orquídea
Oncidium sp. creciendo in vivo sobre substrato. c. Brotes de Cephalocereus senilis
generados y enraizados in vitro, listos para ser transferidos a suelo. d. Brotes de Allium
tuberosum generados y enraizados in vitro, listos para transferirse a suelo.

67
 10. CULTIVO DE CELULAS EN SUSPENSION

Se le denomina cultivo de células en suspensión al cultivo in vitro de células

vegetales aisladas o en pequeños agregados, distribuidas en un medio nutritivo
líquido y en constante movimiento, las cuales presentan una alta tasa de división
celular y una homogeneidad relativamente alta. Los cultivos celulares se han utilizado
como sistemas modelo para estudiar distintos procesos en la ciencia vegetal básica y
aplicada. Entre ellos destacan las investigaciones sobre metabolismo secundario y/o
producción de los metabolitos secundarios (Alfermann y Petersen 1995, Ochoa-Alejo
y Gómez-Peralta 1993), aspectos bioquímicos del metabolismo básico o primario
(Shintani y Ohlorogge 1995), diferenciación de organelos (Gillot y col. 1991), aspectos
moleculares y bioquímicos de las interacciones planta/patógeno (Gotthardt y Grambow
1992), metabolismo de nutrientes (Carrol y col. 1992), respiración celular (Nagano y
Ashihara 1993), absorción y efecto de los RCV y herbicidas (Ochoa-Alejo y Crocomo
1987, Delbarre y col. 1996), aspectos ultraestructurales de la diferenciación celular
(Figueiredo y Pais 1994), expresión genética (Cuzzoni y col. 1995), mecanismos de
tolerancia a diferentes tipos de estrés (Robertson y col 1995), selección de células
resistentes a factores ambientales (Santos-Díaz y Ochoa-Alejo 1994), respuestas
celulares a metales tóxicos (Wollgiehn y Neumaan 1995), estudios sobre pared celular
(Itoh y Ogawa 1993), y como fuente para el aislamiento y purificación de enzimas
(Murphy y Auh 1996). Lo anterior se debe a que los cultivos celulares ofrecen sistemas
adecuados para diferentes procesos, ya que nos permiten disponer de grandes
poblaciones de células relativamente homogéneas creciendo en condiciones
perfectamente controladas. Además, estas células son susceptibles de recibir de
manera rápida y uniforme cualquier tipo de estímulo externo que se aplique y cuyo
efecto se desee estudiar; asimismo, la falta de clorofilas y carotenos en la mayoría de
las suspensiones celulares es de gran utilidad para el aislamiento y purificación de
enzimas de origen vegetal. Por otra parte, el cultivo in vitro de células en suspensión
tiene también aplicaciones prácticas directas en ciertos sistemas de embriogénesis
somática.

El comportamiento de las células vegetales cultivadas en medios líquidos tiene

algunas semejanzas con el cultivo de microorganismos, de hecho en los primeros
experimentos que se realizaron para intentar crecer las células vegetales se emplearon
las técnicas básicas del cultivo de microorganismos. Sin embargo, las células
vegetales presentan diferencias notables cuando se les compara con las células
microbianas. En la tabla 9 se resumen algunas de las diferencias más importantes.

68
Tabla 9. Diferencias básicas entre células microbianas y células vegetales cultivadas
en suspensión.

Característica Células microbianas Células vegetales

Tamaño 1-5 m3 Mayores de 105 m3

Formación de agregados Frecuente Muy frecuente

celulares
Tiempo de generación Usualmente menor a 1 h 24-150 h

Densidad del inóculo 0.5-1% del volumen total 5-20% del volumen total

Tolerancia al estrés Alta Baja

causado por la agitación
Contenido de agua Alrededor del 75% Alrededor del 90%

Consumo de oxígeno 5-90 mmol l-1 h-1 1-4 mmol l-1 h-1

Producto Frecuentemente Frecuentemente

extracelular intracelular
Complejidad del medio de Baja Alta o muy alta
cultivo
Costo aproximado del U.S. $ 6 m3 U.S. $ 50 m3
medio de cultivo
Modificada de Taticek y col. 1991

El uso de medios líquidos para cultivar suspensiones celulares tiene varias

ventajas en comparación con los medios semisólidos. Cuando el tejido calloso se hace
crecer sobre un medio semisólido, no todas las células se encuentran expuestas
uniformemente al medio de cultivo; por ello, se forman gradientes de disponibilidad de
nutrientes y de gases en el tejido, lo cual puede conducir a que se presentes
alteraciones en el crecimiento y en el metabolismo. El propio agente gelificante puede
liberar algunas impurezas tóxicas al medio nutritivo o también el tejido en ocasiones
produce ciertos metabolitos tóxicos que se acumulan en la matriz gelificante y afectan
al tejido vegetal.

En teoría, el cultivo de células en suspensión puede iniciarse a partir de

cualquier explante inoculado en medio líquido con agitación; sin embargo, hay una
mayor probabilidad de éxito y rapidez en la obtención del cultivo si se parte de tejido
calloso; por lo tanto, los cultivos de células en suspensión generalmente se inician
transfiriendo fragmentos de tejido calloso a matraces Erlenmeyer con medio nutritivo,
y colocando éstos en un agitador rotatorio para facilitar la dispersión celular y la
oxigenación del medio. A manera de ejemplo, podemos mencionar que para establecer

69
cultivos en suspensión de chile (Capsicum annum L.) se inoculan fragmentos de 5 g
de tejido calloso en 50 ml de medio líquido contenidos en matraces de 250 ml y se
incuban bajo agitación (120 rpm), a 25 C por 1-3 semanas (Salgado-Garciglia y
Ochoa-Alejo 1990). Los cultivos celulares deben agitarse o someterse a aireación
forzada para permitir un intercambio gaseoso adecuado, pues la producción de etanol
y/o de etileno por los cultivos podrían privar de oxígeno a las células y afectar su
crecimiento y comportamiento (Perata y Alpi 1991, Mirjalili y Linden 1995). En general,
un rango de velocidad rotatoria de 40 a 200 rpm puede ser conveniente para los
cultivos celulares mantenidos en matraces Erlenmeyer de 250 ml de capacidad. Para
ello, un agitador con movimiento orbital de 2 a 4 cm es el adecuado. Por otra parte, las
suspensiones celulares que se utilizan para la producción de metabolitos secundarios
no necesariamente tienen que cultivarse en sistemas de agitación; el uso de bolsas
fabricadas con materiales que permiten un buen intercambio gaseoso ha dado
excelentes resultados para incrementar la producción de los metabolitos secundarios
(Hamade y col. 1994, Fukui y Tanaka 1995). El volumen del medio líquido y el tamaño
del recipiente son factores muy importantes para obtener una adecuada aireación (el
medio de cultivo debe ocupar el 20% del volumen del matraz). El rango de
temperaturas de incubación para los cultivos celulares es el mismo que se recomienda
para otros sistemas in vitro (25-28 C). las suspensiones celulares no requieren
iluminación o fotoperíodos específicos, excepto cuando se desea producir metabolitos
cuya síntesis es inducida por la luz y/o para suspensiones celulares fotoautotróficas.
Estas últimas son sistemas muy útiles para el estudio de las vías metabólicas
asociadas a los cloroplastos o para investigar la relación entre el crecimiento celular y
el desarrollo de estos organelos.

Después de la inoculación del tejido calloso en el medio líquido agitado, éste

inicia un período de fragmentación en pequeños agregados que producen células
libres y nuevos grupos de células; sin embargo, debe tenerse siempre presente que
es muy difícil o imposible establecer un cultivo en suspensión compuesto totalmente
de células individuales. Por lo que respecta al crecimiento del cultivo, éste suele
mostrar un comportamiento sigmoide, mostrando las 5 fases características del
crecimiento (Fig. 16). Esta fases son:

 Fase inicial de reposo (fase lag). Período comprendido entre el inicio del cultivo y el
momento en que se inicia la división celular acelerada. Su duración depende de
varios factores como la edad y cantidad del inoculo y la calidad del medio de cultivo.
Las características de esta fase son: Poca o nula división celular por lo que la
densidad se mantiene constante, alta actividad de síntesis de proteínas y las células
mantienen una alta cantidad de citoplasma en relación al volumen de las vacuolas.
De manera general puede decirse que se trata de una fase de adaptación antes de
la división acelerada de las células.
 Fase logarítmica (fase log). Aumento exponencial en el número de células causado
por división celular acelerada. Por lo general tiene una corta duración (3-4
generaciones, aunque esto es variable).
 Fase linear. Fase de incremento linear en la población de células. Se incrementa el
peso fresco y seco de las células debido al crecimiento de las mismas.

70
 Fase de desaceleración progresiva. Desaceleración gradual en la tasa de división
celular debido al agotamiento del medio y acumulación de desechos y restos
celulares.
 Fase estacionaria. Ya no hay división ni crecimiento celular. Células muy
vacuoladas y frágiles.

Fase de
desaceleración
progresiva

Fase
Fase lag estacionaria

DENSIDAD Fase linear

CELULAR Fase log

TIEMPO

Figura 16. Cinética de crecimiento de un cultivo in vitro de células vegetales en

suspensión.

Los cultivos de células en suspensión usualmente requieren subcultivos más

frecuentes que los cultivos de tejido calloso; por ello, las suspensiones celulares deben
subcultivarse antes de que entren en la fase estacionaria, es decir, durante la fase
linear o la fase de desaceleración progresiva, ya que después la viabilidad celular del
cultivo disminuye drásticamente.

El subcultivo implica la transferencia de un inóculo adecuado de la suspensión

a medio nutritivo fresco, ya sea utilizando pipetas y/o jeringas estériles, o en su defecto
simplemente vaciando una parte de la suspensión en el medio nuevo en condiciones
asépticas. Las células vegetales en cultivo requieren un inóculo mínimo para poder
crecer satisfactoriamente (Manoharan y Gnanam 1992). Un inóculo apropiado para las
suspensiones celulares de chile (Capsicum annum L.) es el equivalente a 5 mg de
peso seco por cada ml de medio de cultivo (Salgado-Garciglia y Ochoa-Alejo 1990).
En general, la fase lag del crecimiento se incrementa a medida que la cantidad del
inóculo disminuye; sin embargo, es posible hacer crecer cultivos a bajas densidades
celulares utilizando medio condicionado. El medio condicionado se prepara al hacer
crecer células vegetales con densidades de biomasa adecuadas por determinado
tiempo, para luego eliminarlas y utilizar el medio nutritivo para otro cultivo.

71
Aparentemente las células liberan compuestos desconocidos al medio líquido, los
cuales promueven la división y el crecimiento celular a densidades celulares
subóptimas (Teasdale y Richards 1991). Los medios condicionados contienen factores
que no parecen ser específicos para cada especie vegetal, ya que el medio
condicionado de una especie ayuda al crecimiento de células de otras especies
distintas (condicionamiento cruzado) (Steinbrenner y col. 1989).En ciertos cultivos, la
estimulación del crecimiento por un medio condicionado puede ser mimetizada por la
poliamina denominada espermidina, pero no por otras poliaminas (Manoharan y
Gnanam 1992). Por otro lado, existen reportes en la literatura que indican que el efecto
del medio condicionado en algunos otros cultivos no puede ser substituido por una
gran diversidad de substancias tales como auxinas, citocininas, poliaminas y vitaminas
(Teasdale y Richards 1991). La mayoría de los estudios para dilucidar la naturaleza
química del(los) farctor(es) involucrados en este fenómeno, sugieren que son
compuestos de tipo oligosacárido (Schroder y Knoop 1995).

La velocidad de crecimiento de un cultivo de células en suspensión depende de

la densidad inicial del inóculo, de la duración en cada caso de la fase lag o de reposo
y de la tasa de multiplicación del cultivo. Los dos últimos factores dependen del
genotipo de las líneas celulares, del medio nutritivo y de las condiciones de incubación.
Existen diferentes técnicas para medir el crecimiento de las suspensiones celulares,
algunas de ellas son de tipo destructivo y otras son no-destructivas; cada una varia en
complejidad y en la información que proporciona (Ryu y col. 1990, Olofsdotter 1993).
Ya que ninguno de los métodos para medir crecimiento en las suspensiones celulares
es cien por ciento infalible, es recomendable medir este parámetro utilizando dos o
más técnicas al mismo tiempo. A continuación se discuten brevemente las más
comunes.

 Volumen del paquete celular. Este método se basa en determinar el volumen celular
en relación al volumen total del cultivo. Para esto se debe tomar una muestra del
cultivo y llenar con ella un tubo de centrífuga graduado, anotando el volumen total.
Esta muestra deberá centrifugarse por 5 min a 200 g para sedimentar las células.
Finalmente se determina el volumen celular sedimentado y se expresa este como
porcentaje del volumen total o como ml de paquete celular. Este es uno de los
métodos no destructivos más sencillos y por lo tanto más utilizados para monitorear
el crecimiento de una suspensión celular.

 Número de células por unidad de volumen. Este método se basa en la

determinación del número de células por unidad de volumen. Para ello, se toma una
muestra del cultivo y se realiza un conteo celular con ayuda de un hemocitometro.
Para que este método resulte confiable, debe utilizarse el valor promedio de varias
determinaciones independientes. Los hemocitometros más comunes (0.1 mm de
profundidad) tienen un volumen en cada cuadro de 0.1 mm3, por lo que el promedio
obtenido de los conteos deberá multiplicarse por 10 000 para obtener el número de
células por ml en el cultivo original. En caso de resultar necesario el cultivo puede
diluirse, en cuyo caso el valor final deberá multiplicarse además por el factor de
dilución. Sin embargo, como las suspensiones celulares no están constituidas por
células vegetales individuales, sino que en su mayoría se encuentran en forma de

72
 agregados celulares de tamaño variable, es recomendable realizar una
disgregación previa. En estos casos se puede adicionar un volumen de la
suspensión celular a dos volúmenes de una solución de trióxido de cromo al 8%
(p/v) y calentar a 70 C por –15 min. Después de enfriar la mezcla, ésta se agita
vigorosamente para disgregar los grupos de células antes de realizar el conteo.
Alternativamente, se pueden utilizar tratamientos enzimáticos para separar los
agregados celulares, tales como pectinasa al 0.25% (v/v).

 Peso fresco y peso seco. El crecimiento también se puede evaluar determinando el

peso de la biomasa producida. En este caso se filtra un volumen conocido de medio
para obtener las células contenidas en él, y se determina el peso fresco de las
mismas. Es indispensable pesar previamente los filtros en que se va a llevar a cabo
la determinación. Además, en la determinación del peso fresco, el tiempo para
retirar el exceso de medio de cultivo debe ser homogéneo para todas las muestras.
Para la determinación del peso seco, los filtros con las células se mantienen a 95
C durante 5-8 hpara retirar la humedad contenida en ellas. El resultado se expresa
como peso fresco y/o peso seco de biomasa por unidad de volumen.

 Conductividad eléctrica del medio. Se sabe que la conductividad del medio es

inversamente proporcional al peso fresco de las células contenidas en él; esto
debido a la utilización de los nitratos contenidos en el medio por parte de las células
que reduce la conductividad del mismo. Este es el método más sencillo, pero se
requiere de hacer una calibración para cada tipo de cultivo utilizando algún otro de
los métodos mencionados.

 Contenido de proteína y ADN. El método se basa en el incremento de la proteína

total o del ADN por unidad de volumen a medida que el número de células se
incrementa. Para estimar la proteína total, se colectan las células en un filtro de fibra
de vidrio y se lavan dos veces con etanol 70% hirviendo. El material vegetal se seca
con acetona y enseguida se coloca el filtro en una solución de NaOH 1 M y se
calienta a 85 C por 90 min. Se filtra la mezcla y la proteína hidrolizada se cuantifica
en el filtrado por alguno de los métodos que existen para ello. Para la determinación
del contenido de ADN en las suspensiones, existe una gran variedad de métodos.
estos varían desde la simple extracción con ácido perclórico hasta técnicas de
partición en solventes y precipitación. La cuantificación del ADN se hace por
espectrofotometría.

 Viabilidad celular. Los métodos descritos anteriormente miden la biomasa celular;

sin embargo, en algunos casos se requiere cuantificar más que el número total de
células, el número o proporción de células viables presentes en un cultivo. Las
técnicas para medir esta viabilidad celular pueden ser agrupadas dentro de tres
categorías. 1. Observaciones de las corrientes citoplasmáticas. 2. Mediciones de la
integridad de las membranas, tales como liberación de electrolitos, plasmólisis y
exclusión o retención de colorantes. 3. Mediciones de actividad bioquímica, tales
como síntesis de proteínas, reducción de sales de tetrazolio, síntesis de ADN y

73
 ARN, contenido de ATP y tinción con diacetato de fluoresceína. De éstas técnicas,
solo las observaciones de corrientes citoplásmicas es no destructiva.

Sincronización del crecimiento celular

Como se ha mencionado anteriormente, los cultivos de células en suspensión

son un sistema modelo adecuado para un gran número de estudios relacionados con
la bioquímica y fisiología celular. Esto se debe a que nos dan la posibilidad de contar
con poblaciones relativamente homogéneas de células creciendo bajo condiciones
controladas. Sin embargo, en un cultivo en suspensión normal no hay homogeneidad
en cuanto a la fase del ciclo celular en que se encuentra cada célula, lo cual puede
requerirse para cierto tipo de estudios más sofisticados, tales como investigaciones
sobre aspectos fisiológicos y genéticos de la división celular, entre otros. Para este
caso se utilizan las llamadas técnicas de sincronización celular, que se basan en inhibir
específicamente el cambio de una fase del ciclo celular a otra, con el fin de sincronizar
luego el ciclo celular de todas las células del cultivo a partir de este punto. El ciclo
celular puede dividirse a grandes razgos en interfase y mitosis. A su vez, la primera
etapa puede subdividirse en tres fases: la G1 o fase presintética, la fase S o de síntesis
de ADN, y la fase G2 o postsintética. De manera semejante, la mitosis se puede
separar en cuatro fases: profase, metafase, anafase y telofase. La mitosis es precedida
por la fase G2 y seguida por la fase G1. Para sincronizar una suspensión celular
existen métodos físicos y químicos. En cuanto a los métodos físicos, la sincronización
puede realizarse con base en propiedades físicas tales como el tamaño de las células
individuales o de los agregados. Entre los métodos químicos destaca el uso de
inhibidores que bloquean temporalmente la progresión de eventos en el ciclo celular
(inhibidores de la síntesis de ADN), tales como la 5-fluorodesoxiuridina, exceso de
timidina, hidroxiurea e inhibidores de la mitosis como la colchicina. También es común
el uso de medios de cultivo carentes de algún compuesto esencial para el crecimiento
de las suspensiones, lo cual puede sincronizar al cultivo en una fase estacionaria.
Posteriormente, el compuesto esencial se le agrega al cultivo para que las células
reanuden su crecimiento en forma sincronizada. Asimismo, la combinación de varios
métodos a la vez también es recomendable en ciertos cultivos.

Sistemas de cultivo

El cultivo de las células vegetales en suspensión, dependiendo del inóculo y de

la forma de suministrar el medio de cultivo fresco, se puede dividir en el denominado
sistema cerrado, en donde una vez hecha la inoculación, ya no hay entrada ni salida
de ningún elemento, por lo que al agotarse alguno de los nutrientes o al acumularse
metabolitos que llegan a concentraciones tóxicas, se debe proceder al subcultivo a
medio nutritivo fresco. El segundo sistema es el abierto, en donde por un lado puede
haber un aporte continúo de medio de cultivo nuevo, y por el otro una colecta continua
de la suspensión.

74
Plaqueo de suspensiones celulares

A partir de una suspensión celular es factible obtener de nuevo tejido calloso, y

en algunas especies, regenerar plantas completas a partir del mismo, ya sea por
organogénesis o embriogénesis somática. Para este fin la suspensión celular se
plaquea en medio sólido, lo cual permite la generación primeramente de pequeñas
colonias de células, cada una de las cuales origina luego un fragmento de tejido
calloso. En ocasiones resulta importante conocer la eficiencia de plaqueo (EP) de
dichas suspensiones, para lo cual se utiliza la siguiente relación.

EP = Número final de colonias obtenidas X 100

Número de células inoculadas

Estas características, junto con la variabilidad genética observada en los

cultivos celulares y la posibilidad de someter enormes poblaciones celulares a una
presión de selección, ofrecen alternativas para el aislamiento de líneas celulares
mutantes o la regeneración de variantes somaclonales con características
bioquímicas, genéticas, agronómicas o industriales deseables.

En la figura 17 se muestra el aspecto de las células cultivadas en suspensión.

75
 a

Figura 17. Cultivos de células en suspensión. a. Cultivo de células en suspensión de

Pinus cembroides. b. Cultivo de células en suspensión de Taxodium mucronatum.

76
 11. CULTIVO DE RAICES

Las raíces son órganos muy importantes para la supervivencia de la planta,

ya que realizan funciones vitales para ella como la absorción y transporte de agua y
de nutrientes. Desde un punto de vista antropocéntrico, las raíces de las plantas han
sido valiosas económicamente como fuentes de alimento, medicinas, venenos, entre
otros. En nuestros días, a cualquier ser humano le resulta familiar y común una
zanahoria, un betabel, un nabo o un rábano, ejemplos básicos de raíces cultivadas
desde épocas remotas. El cultivo de raíces aisladas in vitro fue uno de los primeros
logros importantes dentro del cultivo de tejidos vegetales, alcanzado por primera vez
por White en 1934, quien cultivó exitosamente raíces de jitomate en condiciones
completamente artificiales. Las líneas radiculares originales obtenidas por White se
hicieron crecer durante 25 años en un medio líquido definido químicamente, y fueron
de hecho los primeros cultivos in vitro de órganos de plantas (Dodds y Roberts 1982).

El cultivo in vitro de raíces es un sistema de gran interés para el estudio de los

procesos metabólicos que se llevan a cabo en estos órganos y que se relacionan con
el metabolismo de carbohidratos, vitaminas, reguladores del crecimiento y absorción y
translocación de nutrientes (Croes y col. 1994, Oksman-Caldentey y col. 1994, Rhodes
y col. 1994). Asimismo, este tipo de cultivos se han utilizado en estudios de
diferenciación y desarrollo de las raíces y en la interacción de éstas con otros
organismos como Rhizobium y nemátodos parásitos. Otra aplicación muy interesante
del cultivo de raíces es el estudio de la síntesis de una infinidad de compuestos
secundarios de interés que son producidos por este tejido, así como de la posible
producción masiva in vitro de los mismos mediante cultivos de raíces a gran escala
(Flores y col. 1987, Toivonen 1993).

La respuesta de las raíces al cultivo in vitro varía depende de factores como el

genotipo, el medio de cultivo usado y las condiciones ambientales del cultivo. Roberts
y Street (1955) han clasificado a los cultivos de raíces dentro de tres clases,
dependiendo de su comportamiento hacia las auxinas aplicadas exógenamente. En un
grupo, que incluye a las de jitomate, la adición de auxinas tiene un efecto inhibitorio
sobre el crecimiento o bien no tiene efecto alguno. En el segundo grupo, las auxinas
estimulan el crecimiento cuando se añaden en las concentraciones adecuadas; y en
el último grupo, se encuentran todos los cultivos radiculares que son enteramente
dependientes de una fuente externa de auxinas para poder crecer. Posteriormente,
Butcher y Street (1964) compilaron una gran lista con todos los cultivos de raíces
publicados, y concluyeron que las auxinas si eran necesarias para mantener un
crecimiento adecuado de los tejidos radiculares. Por otra parte, se ha observado
también variación en cuanto al tiempo en que las raíces pueden ser mantenidas
creciendo in vitro. Con respecto a lo anterior, se definen tres grupos de especies:

1. Raíces que pueden desarrollarse indefinidamente in vitro, requiriendo únicamente

del medio y de los subcultivos apropiados. Las raíces de jitomate, Datura y otras
especies muestran este tipo de comportamiento.

77
2. Raíces que crecen y se desarrollan in vitro durante períodos variables de tiempo,
pero que no se ha logrado que lo hagan de manera indefinida, por lo que en todos los
casos tarde o temprano se presenta una disminución paulatina en la tasa de
crecimiento, se inhibe la formación de raíces laterales y el cultivo finalmente muere.
Este comportamiento se ha visto en raíces de algunas leguminosas y cereales.
3. Raíces que hasta el momento no se ha logrado que prosperen in vitro, ni siquiera
por períodos limitados de tiempo. A este grupo pertenecen muchas especies leñosas.

En cuanto al medio nutritivo para cultivar raíces in vitro, se han probado varios
con diferente grado de éxito, pero los más utilizados son los derivados del medio
original de White, aun cuando hay especies que responden igual o mejor al medio MS
o al B5. La sacarosa es la principal fuente de carbono utilizada; sin embargo, algunos
cultivos de monocotiledóneas responden muy bien a la adición de glucosa. Los niveles
de azúcar entre 1.5 a 2% (p/v) son adecuados, ya que concentraciones mayores
ocasionan alteraciones metabólicas de la raíz (Dodds y Roberts 1982). Es más
frecuente el uso de medio líquido, ya sea agitado o estacionario, aunque en algunos
casos puede utilizarse el medio de cultivo semisólido. En general, debe tenerse mucho
cuidado con el suministro de reguladores del crecimiento exógenos, pues algunos de
ellos (auxinas combinadas con citocininas) pueden inducir una rápida
desdiferenciación de las raíces para convertirse en suspensiones celulares (Rhodes y
col. 1994). En ciertos casos, se ha observado que las giberelinas fortalecen el
crecimiento en forma substancial en algunos cultivos (Subroto y Doran 1994).

Una variante del cultivo de raíces que ha tomado una enorme importancia
recientemente es el cultivo de raíces transformadas por Agrobacterium rhizogenes.
Esta bacteria gram-negativa es un patógeno natural de muchas especies vegetales
pertenecientes al grupo de las dicotiledoneas, en las cuales causa un trastorno
conocido como “raíz pilosa”. Este se caracteriza por un crecimiento descontrolado de
la raíz y un incremento notable en la producción de pelos radicales. Las raíces pilosas
producen ciertos metabolitos específicos denominados opinas (agropina, manopina y
cucumopina), los cuales son secretados al suelo en donde son utilizados como fuente
de nitrógeno y carbono por Agrobacterium rhizogenes (White y Sinkar 1987). La
inducción de la rizogénesis y la formación de opinas, son una consecuencia de la
transferencia e integración en las células vegetales de un segmento de ADN
bacteriano, proveniente de un megaplásmido de más de 200 kb denominado plásmido
Ri. (Binns y Thomashow 1988). Solamente una región definida del plásmido Ri es
insertada en el genoma de las células de la planta; esta transferencia esá mediada en
parte por factores genéticos que no se transfieren, y que son codificados por los genes
vir del plásmido bacteriano o por el cromosoma bacteriano. El ADN transferido
contiene entre otros, genes implicados en la síntesis de auxinas o bien en la
sensibilidad de los tejidos transformados a las mismas; por ejemplo, la sensibilidad de
los ápices radiculares o protoplastos transformados de Lotus corniculatus a las auxinas
exógenas es 100 o 1000 veces mayor con respecto a los tejidos sin transformar (Shen
y col. 1988). Esta alteración en la sensibilidad hacia las auxinas causa una pérdida del
desarrollo normal de las raíces, ocasionando los síntomas típicos de las raíces pilosas.
Las cepas de Agrobacterium rhizogenes y los plásmidos que portan, se han clasificado
en base al tipo de auxina que producen (Tabla 10).

78
Tabla 10. Tipos de cepas de Agrobacterium rhizogenes y ADN que transfieren a las
células vegetales.

Tipo de cepa Ejemplos ADN transferido

TL TR
Agropina LBA9402 + +
A4 + +
15934 + +
HRI + +
Manopina 8196 + -
Cucumopina 2659 + -

(Petit y col. 1983, Rhodes y col. 1990)

En las cepas del tipo agropina, se transfieren dos secciones de ADN (T L y TR),
mientras que en las cepas del tipo manopina o cucumopina, solamente se transfiere
una sección (Binns y Thomashow 1988). El amplio rango de hospederos de las cepas
tipo agropina se ha atribuido a la presencia adicional del T R que contiene los genes
implicados en la biosíntesis de auxinas, lo cual induce la formación de raíces en las
células adyacentes a la infección (Filetici y col. 1987). Cuando se va a establecer un
cultivo de raíces pilosas, la transformación se lleva a cabo en condiciones asépticas
sobre explantes o fragmentos vegetales. Para ello, los tejidos se incuban con una
suspensión viable y densa de Agrobacterium rhizogenes. También se ha intentado el
cocultivo de la bacteria con protoplastos vegetales, con resultados prometedores (Wei
y col. 1986, Yoshikawa y Furuya 1987). Después de un período de incubación de 1-4
semanas, las raíces emergen del sitio de la infección y ya pueden ser disectadas del
explante e incubadas en un medio nutritivo libre de reguladores del crecimiento, pero
con antibióticos para eliminar a Agrobacterium rhizogenes.

Los protocolos para el establecimiento de raíces pilosas han sido establecidos

y descritos en detalle por Hamill y col. (1986, 1987) y por Rhodes y col. (1987).
Frecuentemente pueden surgir dos tipos de problemas al tratar de establecer los
cultivos de raíces pilosas; uno se relaciona a la dificultad de transformar ciertas
especies vegetales, y el otro problema se refiere específicamente a la complicación
que se presenta al momento de retirar del tejido las raíces transformadas para intentar
establecer los cultivos propiamente dichos. El rango común de hospederos de
Agrobacteriun rhizogenes está limitado a las plantas dicotiledóneas (De Cleene y De
Ley 1981), aunque aún dentro de este grupo existen especies recalcitrantes
(principalmente especies leñosas) que son difíciles de transformar. Por fortuna, se
puede incrementar el rango de hospederos de distintas cepas bacterianas al introducir
copias adicionales de los genes activos de virulencia o realizando una doble
transformación del material vegetal (Phythoud y col. 1987, Jaziri y col. 1994).

79
 La característica más importante de las raíces transformadas por Agrobacterium
rhizogenes es su mayor tasa de crecimiento con respecto a las raíces normales y su
independencia completa de reguladores exógenos para crecer. El mayor crecimiento
resulta de la mayor formación de raíces laterales, de su alta velocidad de extensión
linear, del incremento secundario en el diámetro como consecuencia de la expansión
y diferenciación celular, de la profusión de los pelos radicales y la ausencia de
geotropismo (Hamill y col. 1997). La velocidad de crecimiento de los cultivos in vitro de
raíces transformadas varía ampliamente dependiendo de la especie vegetal (Hilton y
col. 1988). Las condiciones de cultivo también influyen sobre esta característica
(Yonemitsu y col. 1990) Otra ventaja que ofrecen las raíces transformadas es que
mediante manipulaciones moleculares del plásmido Ri, puede transferirse otro tipo de
información genética que sea de interés agronómico o industrial.

Recientemente, el cultivo de raíces transformadas ha tomado importancia sobre

todo en el campo del estudio y producción de metabolitos secundarios de interés.
Como ya se mencionó, los cultivos de raíces se establecieron desde 1934 por White,
pero estos sistemas de cultivo no fueron aprovechados debido principalmente a su
pobre tasa de crecimiento. Sin embargo, existen reportes posteriores acerca de su
utilización para estudios de producción de algunos metabolitos secundarios; por
ejemplo, Dawson (1942), reportó por primera vez que las raíces de tabaco cultivadas
in vitro eran capaces de acumular nicotina. El incremento en los niveles de nicotina se
correlacionó con el incremento del tejido radicular, medido este como longitud de la
raíz, número de ramificaciones y acumulación de peso seco (Solt 1957). Por lo tanto,
en este sistema in vitro de órganos vegetales aislados, el crecimiento y la expresión
de una vía biosintética del metabolismo secundario eran compatibles. Con el
descubrimiento de las raíces transformadas, la desventaja des escaso crecimiento fue
superada. Por otro lado, se ha descrito en repetidas ocasiones que la capacidad
biosintética de las raíces también se mantiene en las raíces transformadas, lo cual las
hace atractivas como sistemas para el estudio y producción de aquellos metabolitos
secundarios que se sintetizan y acumulan específicamente en las raíces (Tabla 11).

Tabla 11. Ventajas y limitantes de la utilización de raíces transformadas para la

producción de metabolitos secundarios.

Ventajas 1. Estabilidad genética y bioquímica

2. Crecimiento rápido
3. Capacidad biosintética similar a las raíces de la planta
completa
4. Cultivo en fermentadores, sin pérdida de las propiedades
anteriores
5. Posibilidad de manipulación genética
Limitantes 1. Rango de hospederos de Agrobacterium rhizogenes limitado
2. Se requiere que la biosíntesis del metabolito buscado se lleve a
cabo en la raíz
Rhodes y col. 1990

80
 Los protocolos de transformación de tejidos vegetales mediante la técnica de
infección por Agrobacterium rhizogenes es utilizable para un amplio número de
especies vegetales productoras de metabolitos con importancia industrial (Robins y
col. 1994, Vázquez-Flota y col. 1994). Los cultivos de raíces transformadas presentan
ciertas características que los hacen apropiados para cultivarse en grandes
fermentadores y producir varios metabolitos secundarios a nivel comercial
(Scheidegger 1990).

Los trabajos futuros en el cultivo in vitro de raíces transformadas deberán estar

basados en el conocimiento de la genética de Agrobacterium rhizogenes, y en la
bioquímica y genética de los organismos vegetales para poder apmpliar el rango de
plantas susceptibles de ser transformadas, y para incrementar tanto las tasas de
crecimiento de los cultivos como la producción de susbstancias útiles para el hombre.

La figura 18 muestra aspectos de las raíces transformadas cultivadas in vitro.

81
 a

Figura 18. Cultivo de raíces transformadas. a. Aparición de raíces pilosas sobre un

segmento de tallo de limón mexicano (Citrus aurantifolia) inoculado in vitro con
Agrobacterium rhizogenes. b. Cultivo en medio líquido (izquierda) y sólido (derecha)
de raíces transformadas de limón mexicano (Citrus aurantifolia).

82
 12. PRODUCCION IN VITRO DE METABOLITOS SECUNDARIOS

La vida humana desde sus orígenes, en común con el resto del reino animal, ha
estado ¡íntimamente asociada a la vida vegetal, ya que el hombre obtiene de las
plantas múltiples satisfactores para su sobrevivencia (Phillipson 1990). Las plantas
le han brindado al hombre la gran mayoría de sus alimentos, as¡ como muchas
materias primas indispensables para la industria como la madera, fibras y
combustibles, entre otros. En lo relacionado a la energía, actualmente más del 15 %
de las necesidades energéticas mundiales se satisfacen mediante la biomasa
derivada de plantas en forma de madera, celulosa, alcoholes, gomas y hules (Hall
1979).

Por otra parte, las plantas aportan otro tipo de compuestos, que si bien tienen
una aplicación más restringida resultan indispensables para un sinnúmero de procesos
igualmente importantes para el bienestar humano. Estas sustancias tienen una
importancia trascendental para la vida diaria de los seres humanos, pues a pesar de
los grandes avances en la síntesis de compuestos orgánicos, en la actualidad todavía
el 25 % de los fármacos prescritos en los Estados Unidos de Norteamérica se
obtienen directamente de plantas cultivadas en el campo o de plantas que crecen en
forma silvestre y que se colectan en las selvas, desiertos, bosques y otros
ecosistemas (Fowler 1983, Curtin 1983). Del mismo modo, las plantas son la materia
prima industrial necesaria para la extracción de substancias utilizadas para la
elaboración de fármacos, colorantes, fragancias y saborizantes. El potencial que
ofrecen los vegetales es enorme, puesto que de las cerca de 300,000 especies de
plantas vasculares que se conocen, sólo entre el 1 y 5 % de ellas se han investigado
para la producción comercial de productos (Ouellete y Cheremisinoff 1985). Además,
cada año se reportan en la literatura científica unos 1, 500 nuevos productos obtenidos
de los vegetales, de los cuales más del 20 % presentan una actividad biológica
importante (Mantell y col. 1985). La inmensa mayoría de los compuestos que
pertenecen a los grupos antes mencionados provienen del llamado metabolismo
secundario que tiene lugar en casi todos los organismos vivos, incluyendo a las
plantas. A diferencia del metabolismo primario, las rutas del metabolismo secundario
y los productos de las mismas, están restringidas en la naturaleza a un pequeño
número de especies o subespecies relacionadas; en consecuencia, son una
manifestación de la individualidad del organismo mismo que los produce. Los
metabolitos secundarios se sintetizan y acumulan únicamente en determinadas etapas
del desarrollo y de la diferenciación celular (Bell 1980, Gros y col. 1985, Gottlieb 1990).
Es posible que algunos de estos metabolitos no sean esenciales para el organismo
que los produce, pero en general confieren ventajas ecológicas pues se ha observado
que actúan como repelentes o atrayentes de insectos, como antimicrobianos, como
protectores de las células vegetales ante factores abióticos como la luz
ultravioleta, o también en mecanismos de dominio de ciertos nichos ecológicos
(alelopatia). El metabolismo secundario celular presenta cuatro etapas bien
definidas: biosíntesis, transporte intra e intercelular, acumulación en diferentes
estructuras receptoras y biodegradación (Wink 1990). Tradicionalmente, la utilización

83
de los compuestos secundarios ha estado frecuentemente limitada debido al lento
crecimiento vegetal que presentan las plantas productoras; por ejemplo, las especies
de Coptis requieren 5 a 6 años de desarrollo antes que puedan utilizarse para la
extracción de berberina (Becker y Saverwein 1990). De igual forma, para aislar la
shikonina de las ra¡ces de Lithospermum erythrorhizon, la planta necesita crecer de 5
a 7 años para que este metabolito represente el 1 a 2 % de la biomasa, concentración
necesaria para hacer factible y económicamente viable la extracción del pigmento
(Curtin 1983). Asimismo, se requiere esperar hasta 20 años para que de la corteza
del árbol Cinchona ledgeriana se puedan extraer niveles apropiados de quinina
(MacQueen 1988). Otro de los factores que limitan la producción de metabolitos
secundarios es el hecho de que una gran cantidad de ellos son generados por las
plantas en muy bajas concentraciones (0.0005 %), lo que ocasiona que sea
indispensable 'procesar grandes cantidades del material vegetal para aislar pocos
gramos o algunos cuantos miligramos del metabolito buscado; por ejemplo, se
requieren más de 200 Kg de hojas de Catharantus roseus para producir 1 g de
alcaloides tipo vinca (MacQueen 1988) o 7 Kg de corteza seca de Taxus brevifolia para
obtener 1 g de taxol (agente anticancerígeno) (Stojckigty col. 1995). Un problema
adicional que se presenta para la producción de compuestos naturales de plantas es
que algunos metabolitos secundarios tienen una distribución taxonómica tan estrecha
o específica que hace que sólo se puedan obtener de una o de un número muy
limitado de especies, muchas de las cuales no han sido domesticadas por lo que se
depende de poblaciones silvestres no siempre abundantes o accesibles. Lo anterior
hace que estos productos alcancen precios considerables. En la Tabla 12 se dan
algunos ejemplos de diferentes grupos de compuestos secundarios utilizados en
diversas industrias.

84
Tabla 12. Usos, mercado y precios de algunos metabolitos secundarios utilizados en
diferentes industrias.

COMPUESTO USO PRECIO MERCADO

US $ POR kg MILLONES DE DOLARES

Mentol saborizante, 30 85-90 (mundial)

fragancia

Quinina saborizante, 500 5-10 (E.U.A.)

fármaco
antimalárico
Piretrinas insecticidas 300 20 (E.U.A.)

Codeína sedante 17 000 50 (E.U.A.)

Ajmalicina fármaco para 37 500 5 (mundial)

problemas
circulatorios
Digitalis fármaco para 3 000 20-55 (E.U.A.)
desórdenes
cardiacos
Vinblastina y fármacos 20 000 (g) 18-20 (E.U.A.)
vincristina antileucémicos

Taxol fármaco 600 000 ---

anticancerígeno

(Pearce 1988, Curtin 1983, Scragg y col. 1995)

Dado el enorme interés económico y científico que ofrecen estos

compuestos secundarios, y considerando la gran variabilidad en el abasto del material
vegetal para efectuar la extracción de ellos, desde hace ya algún tiempo una cantidad
considerable de empresarios, industriales y científicos relacionados con esta área, se
han dedicado a explorar formas alternativas para la producción de compuestos
naturales de plantas; entre esas opciones, el uso del cultivo de células, tejidos y
órganos vegetales in vitro en condiciones asépticas ha tenido gran aceptación (Fowler
1983). En los años 50 apareció por primera vez una solicitud de patente por
Routien y Nickel en los E.U.A., en la que daban a conocer que era posible hacer crecer
células vegetales bajo condiciones sumergidas en medios nutritivos, y que esas
células podrían servir para la producción de metabolitos secundarios y otros
compuestos de origen vegetal benéficos para el hombre. Antes de que transcurrieran

85
25 años, se publicó un listado con más de 50 grupos de productos naturales
elaborados por este sistema. En la Tabla 13 se presentan algunos ejemplos de
metabolitos secundarios producidos por cultivo de tejidos vegetales.

Tabla 13. Tipo o usos de algunos metabolitos secundarios producidos por cultivo de
tejidos vegetales.

 Alcaloides  Reguladores de Crecimiento

 Alergénicos Vegetales
 Antraquinonas  Inmunocitoqu¡micos
 Agentes antileucémicos  Insecticidas
 Agentes antimicrobiales  Látex
 Agentes antitumorales  L¡pidos
 Benzopironas  Naftoquinonas
 Benzoquinonas  Ac. nucleicos y derivados
 Carbohidratos  Opioides
 Glicósidos cardiacos  Acidos orgánicos
 Condimentos  Péptidos
 Diantronas  Pigmentos
 Emulsificantes de alimentos  Polisacáridos
 Enzimas (Isoenzimas)  Proteínas
 Inhibidores enzimáticos  Esteroides
 Etileno  Saponinas y sapogeninas
 Flavonoides  Azúcares
 Fragancias  Edulcorantes
 Furanocromonas  Inhibidores virales de plantas
 Furanocumarinas  Vitaminas

(Nickell 1980, Fowler 1983, Teutonico y Knorr 1984, Mantell y col. 1985).

Sin embargo, los primeros trabajos no tuvieron el éxito deseado y no fue sino
hasta hace relativamente poco tiempo cuando se logró la producción in vitro de
manera eficiente de algunos metabolitos (Zenk 1977, Tabata 1978, Walters y Eilert
1983, Di Cosmo y Towers 1984). De la misma forma, también existen más de 30
ejemplos reportados en la literatura en donde se muestra que el rendimiento y la
productividad de ciertos metabolitos secundarios producidos por las células vegetales
cultivadas in vitro, es igual o superior a la cantidad que se han encontrado en las
plantas crecidas en condiciones naturales (Phillipson 1990). En la Tabla 14 se
resumen ejemplos en los que se ha logrado un sistema eficiente de producción in
vitro de compuestos secundarios (Constabel 1987, Endress 1994)

86
Tabla 14. Ejemplos de sistema eficiente de producción in vitro de compuestos
secundarios.

ESPECIE METABOLITO A B A/B AUTORES

Dioscorea deltoidea diosgenina 2 2 1 Kaul y Staba

1968
Coffea arabica cafeína 1.6 1.6 1 Frischknecth
1977
Coptis japonica berberina 7 7 1 Fukui 1982

Macleaya cordata protopina 0.4 0.32 1.25 Koblitz 1975

Catharanthus roseus ajmalicina 1 0.3 3 Zenk 1977

Coleus blumei ac. 15 3.6 5 Razzaque y Ellis

rosmarinico 1977
Panax ginseng gingsenoides 27 4.5 6 Furuga 1983

Lithospermum chiconina 14 1.5 9.3 Fujita y Tabata

erythrorhizon 1983

Morinda citrifolia antraquinonas 18 2.5 8 Zenk 1975

Nicotiana tabacum nicotina 2.5 0.7 3.6 Czygan 1984

Nicotiana tabacum ubiquinona 0.18 0.003 60 Matsumoto et al.

10 1981
Cassia tora antraquinonas 6 0.6 10 Tabata et al.
1975

Catharanthus roseus catarantina 0.24 0.002 77 Smith 1987

A. Producción del metabolito en el cultivo in vitro expresada como % del peso seco
B. Producción del metabolito en la planta completa expresada como % del peso seco

Una ventaja excepcional del cultivo de tejidos vegetales en cuanto a la

producción de sustancias naturales, es el descubrimiento de que las células vegetales
cultivadas in vitro son capaces de llegar a sintetizar y acumular productos secundarios
totalmente desconocidos, los cuales nunca se había reportado que estuvieran
presentes en la planta de la cual se derivaron. Esta característica única ha sido
observada en repetidas ocasiones desde la detección de las lactonas
bisabonolenoides (panicúlidos) en callos de Andrographis paniculata por Allison y
col. (1968). Para 1989, Ruyter y Stockigt contabilizaron más de 70 compuestos
totalmente desconocidos. Hasta la fecha se han descrito entre 140 a 150

87
metabolitos secundarios producidos por los cultivos de tejidos vegetales pero que no
se han detectado en las plantas completas.

La producción in vitro de compuestos secundarios se ha investigado con el fin

de tener modelos adecuados y controlables para el estudio de la biosíntesis de
diferentes tipos de compuestos, incluyendo sus rutas metabólicas, las enzimas
implicadas, los mecanismos de control de las mismas y los mecanismos regulatorios
del metabolismo secundario. En este sentido, los resultados obtenidos de
investigaciones cinéticas en suspensiones celulares muestran básicamente la
presencia de tres patrones de crecimiento celular y acumulación de productos
naturales conforme transcurre el tiempo de cultivo (Crocomo y col. 1981, Barz y col.
1990) (Figura 19).

TIEMPO (DIAS)

Figura 19. Patrones básicos de acumulación de productos secundarios en

relación al crecimiento (cuadros llenos) de los cultivos de tejidos vegetales.
Producto transitorio al crecimiento (A), producto acumulado durante el
crecimiento (B), y degradación del producto en el crecimiento (C). Modificado
de Crocomo et al. (1981), y Barz et al. (1990).

Alternativamente, los cultivos in vitro se han utilizado para intentar producir a

gran escala diferentes metabolitos. Sin embargo, es necesario contar con un
conocimiento profundo de los mecanismos que controlan su síntesis y su acumulación
para tener un mayor grado de control sobre la producción. Se ha manifestado en
diferentes trabajos que bajo el actual sistema tecnológico, solamente aquellos
productos secundarios con un precio igual o mayor a $1, 000 dólares por kilogramo o
que presenten una elevadísima demanda son susceptibles de producirse por cultivo
de tejidos vegetales en forma rentable (Curtin 1983, Oullette y Cheremisinoff 1985,
Staba 1985). Para 1982, solamente se había logrado la producción comercial de un

88
solo tipo de metabolito secundario mediante las técnicas in vitro (Fujita et al. 1982).
En la actualidad, únicamente existen cuatro productos de valor comercial que se
obtienen a nivel industrial por cultivo in vitro de células y órganos de plantas
superiores: la shikonina, la berberina, la purpurina y las ra¡ces del gingseng para la
producción de saponinas (Becker y Saverwein 1990, Alfermann y Petersen 1995,
Stockig y col. 1995). ¿Cuáles son las razones o los problemas que existen para la
insuficiente aplicación práctica de estas técnicas?. Se han analizado los diferentes
factores implicados; sin embargo, el principal factor y probablemente el de mayor
peso, es que la mayoría de los cultivos vegetales de especies económicamente más
importantes (por la presencia de metabolitos secundarios) no producen altos
rendimientos. Debido a ello, no se justifica el enorme costo de inversión y operación
para la tecnología de fermentación a gran escala (Collin 1987). Los bajos rendimientos
en la producción metabolitos secundarios interesantes encontrados en los
cultivos vegetales in vitro, motivaron a diversos científicos a ocuparse del estudio de
los posibles factores físicos y químicos que podrían estar influyendo y/o regulando la
producción de los metabolitos secundarios. Entre los factores estudiados se pueden
mencionar a las condiciones nutricionales y del medio ambiente en las que son
cultivadas las células vegetales. Algunas de las estrategias mediante las cuales se
puede incrementar la producción de metabolitos secundarios en los cultivos in
vitro son:

 Manipulación del medio de cultivo y de las condiciones ambientales. En

ocasiones un cambio o incremento de la fuente de carbono puede dar como
resultado un incremento en la síntesis y acumulación del metabolito de
interés. Lo mismo puede suceder si se altera la fuente de nitrógeno o se modifican
los niveles de fósforo o de algunos otros macro y micronutrientes. Por
otra parte, la producción in vitro de metabolitos secundarios también se puede
ver alterada por el tipo, concentración y combinación de los reguladores del
crecimiento presentes en el medio. Asimismo, las condiciones de luz y/o
temperatura pueden tener una profunda influencia sobre la biosíntesis y
acumulación de los metabolitos secundarios.

 Selección de líneas altamente Productoras. Los sistemas de cultivo in vitro

permiten, mediante procedimientos sencillos de selección, la obtención de líneas
celulares, de tejidos u de órganos que muestran una mayor producción del
metabolito de interés con respecto al material original. Se ha demostrado desde
1959 (Tabata y col. 1978) que el rendimiento de productos secundarios puede
incrementarse por medio de la selección de clonas con alto rendimiento
fitoquímico. La selección de clonas altamente productoras tiene como objetivo
práctico incrementar los rendimientos o la productividad de un metabolito
secundario, lo cual implica que los cultivos de tejidos vegetales se consideran
heterogéneos en cuanto a la uniformidad celular. El requerimiento mínimo y
básico de un sistema de selección es que debe ser rápido, económicamente
accesible y ser capaz de discernir preliminarmente entre un gran número de
muestras celulares (Collin 1987). En ese sentido, se han obtenido avances
significativos en aquellos sistemas celulares que muestran acumulación de
pigmentos, tales como antocianinas, betacianinas y safroninas (Curtin 1983). Es

89
 posible identificar y seleccionar fácilmente aquellas células individuales o pequeños
grupos de células que presentan el color más intenso e iniciar a partir de ellas un
cultivo in vitro. Desafortunadamente los metabolitos secundarios con mayor valor
económico y de mayor demanda por sus aplicaciones en la industria
qu¡micofarmacéutica no son pigmentados; por ello, deben emplearse otros
métodos de selección (Berl¡n 1990), tales como el radioinmunoensayo, la
fluorometría en el caso de ciertos metabolitos fluorescentes o, incluso, el
aislamiento de mutantes resistentes a un agente físico y/o químico de naturaleza
tóxica. Las líneas resistentes seleccionadas in vitro, denominadas variantes
celulares (Terzi y Sung 1986, Skirvin y col. 1994), poseen una característica
específica de selección, lo cual les confiere la resistencia a un agente selectivo. La
principal ventaja de utilizar agentes tóxicos para la selección es que la gran mayoría
de las células silvestres se mueren en un determinado período, quedando
solamente las variantes deseadas (Berl¡n 1990). Entre los agentes tóxicos más
utilizados se encuentran la luz UV de onda corta (Quesnel y Ellis 1989) y análogos
de aminoácidos (Salgado-Garciglia y Ochoa-Alejo 1990).

 Incitación celular. Los cultivos celulares y de órganos in vitro tienen la

capacidad de producir compuestos secundarios de manera espontánea; sin
embargo, también son capaces de sintetizar, bajo ciertas condiciones
específicas de cultivo, otros metabolitos secundarios (ejemplo, fitoalexinas) que
normalmente están ausentes en los cultivos. Las fitoalexinas (substancias de
defensa) se sintetizan rápidamente (8-72 h) en respuesta a la estimulación
provocada por distintas sustancias y/o factores físicos denominados en su conjunto
como incitadores. Estos factores se clasifican en dos grandes grupos: los de tipo
abiótico y los de origen biótico. De acuerdo a la revisión efectuada por Eiler (1987),
los incitadores bióticos se clasifican en cuatro grandes clases: a) incitadores
producidos directamente por un agente patógeno y reconocidos por la célula
vegetal; b) incitadores generados por acciones directas del organismo patógeno
sobre la pared celular vegetal; e) incitadores elaborados por la acción de enzimas
vegetales sobre la pared celular microbiana; y d) incitadores endógenos
constitutivos generados y/o liberados por la célula vegetal en respuesta a varios
estímulos. Los incitadores de origen abiótico comprenden factores y substancias
muy diversas, tales como carbón activado (Fukui y col. 1984), radiaciones gamma
(Dubery 1992). estrés osmótico (Kochs et al. 1987, Zhang y col. 1995), luz UV
(Jones 1984), cambios de pH del medio de cultivo (Wink 1985), sales de metales
pesados (Grosskopf et al. 1991, Rouxel y col. 1991), estrés oxidativo (Berglund y
Ohlsson 1993), entre otros. Los incitadores bióticos y abióticos también promueven
la inducción y la formación de metabolitos secundarios que no presentan actividad
de fitoalexinas (Ciddi y col. 1995). Esto ha conducido a investigar la
posibilidad de emplear incitadores para intentar incrementar los rendimientos de
los productos naturales en los cultivos vegetales in vitro.

 Inmovilización celular. La inmovilización de células vegetales se ha

desarrollado recientemente como un método para aumentar la producción de
metabolitos secundarios. El principio de esta metodología se basa en
manipular el ambiente físico de las células mediante su inmovilización en una

90
matriz inerte para restringir el crecimiento celular. Rosevear (1984) la ha definido
como una técnica in vitro que confina o atrapa a células o protoplastos
(microbianos, animales o vegetales) dentro de un sistema fijo, lo que evita que el
material biológico entre en la fase móvil del sistema. La fase móvil es la
responsable de proporcionar a las células el medio nutritivo y/o el sustrato, y
también de acarrear los productos generados y/o modificados por las propias
células. En general, la técnica ha mejorado notablemente la eficiencia de
producción de algunos metabolitos secundarios, gracias a las ventajas que
presenta sobre otros sistemas de cultivo de células in vitro (Yeoman y col. 1990).
Un amplio rango de células vegetales se han inmovilizado en forma exitosa en una
gama diversa de soportes (Tabla 15).

91
Tabla 15. Metabolitos secundarios obtenido en sistemas celulares vegetales
inmovilizados en diferentes tipos de matrices.

ESPECIE VEGETAL SOPORTE PRODUCTO,

Catharanthus roseus Alginato de calcio, Isómeros de Ajmalicina

agarosa, carragenano,
agar, gelatina, poliacrilamida,
Hypol 3000.
Digitalis lanata Alginato de calcio Digoxina

Glycine max Fibras huecas Fenólicos

Capsicum frutescens Alginato de calcio y poliuretano Capsaicinoides

reticulado

Solanum aviculare Polifenileneoxido Esteroides

Amaranthus tricolor Gel de quitosana Oxalato

Daucus carota Alginato de calcio Digoxina

Petunia hybrida Fibras huecas Pigmentos

(Knorr y col. 1985, Yeoman 1987)

 Cultivo de órganos. Cuando se produce la desdiferenciación celular del tejido

vegetal cultivado in vitro, con el fin de producir callos o suspensiones celulares,
usualmente se acompaña de una aparente pérdida en la capacidad para sintetizar
y/o acumular compuestos secundarios, y se discuten varias causas probables que

92
 pudieran estar ocasionando este fenómeno observado en los cultivos de tejidos
vegetales (Charlwood y col. 1990). Por otra parte, el proceso contrario, es decir la
diferenciación celular del "tejido" desorganizado, a menudo conduce a la parcial
o total restauración de la capacidad para sintetizar y acumular sustancias
secundarias, y es prometedor biotecnológicamente en el sentido de que la
biosíntesis, transporte y almacenamiento de los productos secundarios se
efectúa en forma adecuada. Asimismo, algunos tejidos especializados como
raíces, plántulas derivadas de embriones somáticos y brotes elongados son
capaces de sintetizar y acumular productos naturales en cantidades iguales o
superiores a las reportadas en los sistemas naturales de cultivo (Flores y col. 1987,
Charlwood y col. 1990, Berglund y Ohlsson 1995).

 Cultivos celulares en dos etapas. Una de las técnicas que se han intentado
con mayor regularidad es la producción de biomasa celular en un medio
denominado de "crecimiento", y una vez alcanzada la cantidad de material
celular requerida se reemplaza el medio nutritivo con otro medio de cultivo limitante
del crecimiento celular llamado medio de “producción". La restricción de
crecimiento por lo general se consigue reduciendo los niveles de auxinas y
citocininas, o por la falta de algunos nutrientes específicos como fosfato, nitrato y
amonio, e incluso también por la adición de altas concentraciones de otras
substancias nutritivas como la sacarosa (Threlfall y Whitehead 1988).
Definitivamente quien ha utilizado esta técnica con mayor éxito, es la empresa
japonesa Mitsui Petrochemical Industries, pues produce y comercializa
actualmente tres metabolitos secundarios generados por cultivos vegetales in vitro
(Fujita 1988, Alfermann y Petersen 1995).

 Redirección del transporte de productos secundarios. Las células vegetales in vitro

pueden acumular los metabolitos secundarios en ciertos lugares de
almacenamiento en forma intracelular o, alternativamente, los productos pueden
excretarse al medio de cultivo. Se han utilizado 2 estrategias generales para
recuperar los metabolitos secundarios producidos por estos cultivos: la
permeabilización y el cultivo en dos fases. La primera estrategia se emplea casi
exclusivamente en los cultivos vegetales que mantienen en el interior de las células
los metabolitos secundarios de interés. Distintos agentes químicos y físicos se han
empleado para permear la membrana plasmática y el tonoplasto; entre esos
métodos encontramos el uso de DSMO, cloroformo, tritón X-100, SDS,
fenetilalcohol, hexadeciltrimetilamonio, ultrasonido y pulsos de campos eléctricos
(Brodelius y Pedersen 1993, Brodelius 1988, Kilby y Hunter 1990, Pu y col. 1989,
Brodelius y col. 1988). Sin embargo, el empleo de casi todos los agentes utilizados
para permear ocasionan una disminución gradual de la viabilidad celular en mayor
o menor grado con la consiguiente pérdida del rendimiento fitoquímico. La segunda
manipulación es utilizada en cultivos in vitro en donde la acumulación del
metabolito secundario puede ser tóxica para el mismo cultivo (Charlwood y Brown
1988), y una forma de evitar la toxicidad podría ser la desaparición rápida y eficiente
de esas sustancias de la fase acuosa del cultivo. Dicha estrategia es la adición de
una segunda fase o fase de extracción adicional al sistema vegetal, con el fin de
suministrar un sitio artificial para el almacenamiento del metabolito secundario

93
 (Constabel 1988, Beirderbeck y Knoop 1987, Kim y Chang 1990). En principio,
esto permite mantener la maquinaria de transporte intracelular intacta, y ajusta el
equilibrio global de transporte hacia la secreción (Brodelius y Pedersen 1993).
Estos cultivos se componen de una fase acuosa en donde se encuentran
contenidas las células vegetales y los nutrientes, y de una segunda fase líquida o
sólida, orgánica o polar, la cual es la receptora de los metabolitos secundarios
producidos por las células (Byun y col. 1990, Strobel y col. 1991). Este sistema ha
permitido obtener rendimientos notables en la producción de metabolitos
secundarios, sobre todo cuando se ha utilizado en combinación con otros sistemas
de inducción, como son la incitación celular y la adición directa de precursores
biosintéticos (Brodelius y Pedersen 1993).

 Adición de Precursores biosintéticos. El razonamiento básico en que se

sustenta la adición directa de precursores para obtener altos rendimientos de los
metabolitos, es que los intermediarios biosintéticos del producto pueden estar
ausentes dentro de la célula o, en caso de que se encuentren presentes, las
concentraciones son muy bajas impidiendo la síntesis eficiente del producto final;
incluso, aunque estuvieran los precursores en las cantidades adecuadas, existe la
posibilidad de que se encuentren separados espacialmente
(compartamentalizados) de las enzimas de la ruta metabólica biosintética (Holden
y col. 1988). La principal contribución de este tipo de manipulación de los cultivos
in vitro es posiblemente que permite conocer las enzimas involucradas y los
factores que controlan la síntesis, transporte, acumulación y degradación de los
metabolitos secundarios (Shann y Blum 1987 a b, Fry 1984, Edwards y col. 1990,
Margna y col. 1989, Johnson y col. 1990, Rasmussen y col. 1995).

 Biotransformación. Recientemente se ha desarrollado un sistema con el fin de

obtener una mayor producción de compuestos valiosos in vitro. Este sistema recibe
el nombre de biotransformación y es una atractiva metodología para usarse en
la biotecnología vegetal. La biotransformación consiste en la conversión
enzimática de precursores adicionados exógenamente, por los cultivos
vegetales in vitro. Estas biotransformaciones pueden efectuarse en una sola
etapa (mediada por la acción de una sola enzima) o en múltiples etapas (mediadas
por la acción de dos o más enzimas). Se han utilizado como sistemas de
biotransformación cultivos de callos, suspensiones celulares, protoplastos y células
inmovilizadas (Phillipson 1990). Los substratos adicionados a los cultivos pueden
ser naturales o sintéticos y los productos generados pueden ser substancias
conocidas o totalmente nuevas. Las velocidades de conversión son r pidas y
eficientes. Si el precursor es más barato que el producto, y si el proceso puede
mantenerse de manera continua, la explotación comercial es posible. Sin
embargo, se pueden presentar dos tipos de problemas: primero, esta metodología
sólo se puede llevar a cabo cuando el producto es más caro que el sustrato; y
segundo, solo si el producto no puede metabolizarse a otro compuesto antes de
que sea posible su recuperación. Las conversiones enzimáticas que se han
reportado en los cultivos de tejidos vegetales incluyen, esterificaciones,
epoxidaciones, hidroxilaciones, glucosilaciones, hidrólisis, metilaciones,
desmetilaciones, isomerizaciones, deshidrogenaciones y oxidaciones

94
 (Yeoman y col. 1990, Scigelov y col. 1995). Algunos ejemplos de sistemas de
biotransformación exitosos se muestran en la Tabla 16.

Tabla 16. Biotransformación de substratos en productos por cultivos in vitro de

diferentes especies vegetales.

CULTIVO SUBSTRATO PRODUCTO

Catharanthus roseus Anhidrovinblastina Vinblastina
Catharanthus roseus Cumarina 7-Hidroxicumarina
Stevia rebaudiana Esteviol Esteviobiosido
Digitalis lanata Digitoxina Digoxina
Datura inoxia Hidroquinona Arbutina
Cannabis sativa Geraniol Citral, nerol
Mentha spp. Pulegona Isomenthona
Papaver somniferum (-)-Codeinona (-)-Codeina
Aconitum japonicum Acido fenilacético Beta-glucósido
(Phillipson 1990)

 Manipulación genética de la ruta biosintética. Las técnicas actuales de

ingeniería genética nos dan la posibilidad de manipular los genes de las
enzimas implicadas en las distintas rutas biosintéticas del metabolismo
secundario (Hashimoto y Yamada 1994, Atanassova y col. 1995, Douglas
1996). Esto se ha logrado ya con las enzimas que participan en la síntesis de
pigmentos en flores lográndose un cambio en el color de las mismas (Que y col.
1998 Davies y col. 1998). De igual forma, se han introducidogenes bacterianos que
codifican a enzimas de la ruta de los carotenos en otros organismos que
normalmente no producen estos metabolitos secundarios (Misawa y col. 1991). La
manipulación genética de las células vegetales ha sido útil también para localizar
los sitios celulares en donde se encuentran las enzimas del metabolismo
secundario (Schmid y Amrhein 1995). Sin duda, esta será la mejor alternativa para
incrementar la síntesis de metabolitos deseados; sin embargo, para lograr esto se
requiere un mayor conocimiento a nivel molecular de las rutas biosintéticas
implicadas.

Cada una de las estrategias descritas para aumentar la producción de

metabolitos secundarios en cultivo de tejidos vegetales, tiene sus ventajas y
desventajas. De hecho, estas metodologías se han utilizado en forma individual o en
combinación (van Uden y col. 1990, Kreis y coll. 1990), resultando en acumulaciones
positivas de varios metabolitos secundarios. En resumen, la conclusión podría
ser la que describe Scragg (1995): "Hasta la fecha, no existe un método universal
para generar un incremento significativo en los rendimientos del metabolismo
secundario. Esto, probablemente deber esperar a que tengamos una comprensión
más clara de las vías metabólicas involucradas, así como de los factores esenciales
que las controlan, para que finalmente tengamos ese método de aplicación
universal".

95
 13. AISLAMIENTO Y CULTIVO DE PROTOPLASTOS

Se da el nombre de protoplastos a las células vegetales carentes de pared

celular (Fig. 21). Estos pueden obtenerse por métodos físicos o enzimáticos a partir de
casi cualquier tejido vegetal y son susceptibles de ser cultivados in vitro. En muchas
especies es posible regenerar plantas completas a partir de uno solo de ellos. El
aislamiento y cultivo de protoplastos tiene varias aplicaciones dentro del campo de la
biotecnología vegetal. Estas células vegetales, por carecer de pared celular, pueden
tomar organelos u otro tipo de partículas extrañas como virus mediante procedimientos
relativamente sencillos, lo cual los convierte en modelos de estudio para varios
procesos biológicos. Esta misma propiedad les permite recibir fácilmente información
genética en forma de ADN desnudo por medio de procesos como la microinyección y
la electroporación. De hecho, los protoplastos fueron uno de los primeros modelos
utilizados para el estudio de la transformación genética en células vegetales. Dadas
sus características, los protoplastos son sistemas ideales para el estudio de la síntesis
y deposición de los componentes de la pared celular. Por último, el cultivo de
protoplastos es hasta el momento el único sistema seguro para regenerar plantas
completas partiendo de una sola célula, lo cual los convierte en un ejemplo claro del
fenómeno de totipotencialidad celular.

Los protoplastos son también el punto de partida para la obtención de los

llamados híbridos somáticos. Estos se originan de la fusión de dos protoplastos
obtenidos de diferentes individuos (de la misma especie, de especies distintas o
incluso de géneros diferentes), los cuales producen una célula híbrida a partir de la
cual en ocasiones es posible regenerar una planta completa. El hecho de carecer de
pared celular así como la plasticidad de su membrana plasmática permiten la fusión
de dos o más protoplastos. La fusión de protoplastos no se da de manera espontanea
debido a que éstos tienen una carga superficial de membrana negativa, por lo que
tienden a repelerse. Sin embargo, al colocar los protoplastos en medios que alteren
las propiedades de las superficies de sus membranas, por ejemplo medios con alta
concentración de calcio y de polietilenglicol, es factible inducir la fusión de estas células
desprovistas de pared. En ocasiones, la fusión de los protoplastos va seguida de la
fusión de los núcleos, y es en este caso cuando se obtienen los verdaderos híbridos
somáticos. En una variante de esta técnica, los núcleos de una de las poblaciones de
protoplastos a fusionar se inactivan mediante rayos X o rayos gama, por lo que las
células híbridas que se obtienen contienen el núcleo de una línea celular y el
citoplasma mezclado de ambas (con la consecuente mezcla de los genomas de
mitocondrias y plastidios). A este tipo de híbridos citoplásmicos se les da el nombre
de cíbridos. La técnica de fusión de protoplastos fue una de las más prometedoras en
su momento; sin embargo, fue desplazada por las técnicas de ingeniería genética
antes de que llegara a consolidarse. Puede afirmarse que, salvo ciertas excepciones,
la técnica de fusión de protoplastos ha perdido mucha de su importancia debido al
surgimiento de métodos alternativos más precisos para la transferencia de material
genético.

96
AISLAMIENTO DE PROTOPLASTOS

Existen dos métodos diferentes para la obtención de protoplastos a partir de

tejidos vegetales. El primero de ellos es el método físico, el cual se compone de dos
pasos. Inicialmente las células son colocadas en una solución hipertónica (sacarosa,
glucosa, sorbitol o manitol al 8-20% por 10-30 min) con la finalidad de inducir la
plasmólisis, obligando así a que el protoplasto se separe al menos parcialmente de la
pared celular. En un segundo paso, el tejido es macerado suavemente para permitir la
liberación de los protoplastos. A pesar de ser sencillo, este método ha dejado de
utilizarse debido al pobre rendimiento y al hecho de que un gran número de células se
rompen durante el proceso, lo cual disminuye la proporción de células viables y
contamina la suspensión resultante con un sinnúmero de restos celulares que pueden
afectar los resultados experimentales.

El segundo método para el aislamiento de protoplastos es el enzimático. Este

se basa en la degradación enzimática de los componentes de la pared celular, lo cual
permite obtener protoplastos sin causar un daño físico al tejido. Las enzimas que se
utilizan para este fin pertenecen a tres grupos diferentes: celulasas, hemicelulasas y
pectinasas. Por lo general se utilizan mezclas de al menos dos de los tipos
mencionados. En la tabla 17 se presentan las enzimas más utilizadas para el
aislamiento de protoplastos así como el organismo del cual se obtienen (Endress
1994).

Tabla 17. Enzimas más utilizadas para el aislamiento de protoplastos y el organismo

del cual se obtienen.
ENZIMA ORGANISMO FUENTE

Celulasa R-10 Trichoderma viride

Meicelasa-P Trichoderma viride
Hemicelulasa H-2125 Rhizopus sp.
Macerozima R-10 Rhizopus sp.
Pectinasa Aspergillus niger
Pectoliasa Y-23 Aspergillus japonicum
Pectinol Aspergillus sp.
Zymoliasa Arthobacter luteus
Driselasa Irpex lactes
Para el aislamiento de protoplastos mediante el método enzimático también es
recomendable un primer paso de plasmólisis del tejido, la cual suele realizarse en
medio de cultivo que contiene manitol (se recomienda para muchos casos el medio
CPW, ver tabla 18). Después de la plasmólisis se procede al tratamiento enzimático,
que consiste en poner el tejido en contacto con la mezcla enzimática preparada en el
mismo medio donde se realizó la plasmólisis. Debido a la carencia de pared celular los
protoplastos se lisan muy fácilmente en medios hipotónicos, por lo que se debe ajustar
la presión osmótica utilizando siempre un compuesto como el manitol que actúe como
osmoprotector.

97
 Las cantidades de enzimas a utilizar varían según el método particular o el tipo
de tejido de donde se obtienen los protoplastos. Los rangos recomendados son:
pectinasas 0.1-1.0 %, celulasas 1.0- 10.0 % y hemicelulasas 0.1-1.0%. La incubación
del tejido con las enzimas se realiza usualmente a 28 C por 3-18 horas. Una vez
terminada la digestión, el medio con los protoplastos se filtra a través de una gasa para
eliminar los restos celulares y luego se centrifuga a 100 xg por 1 min, con lo cual los
protoplastos deben quedar en el fondo del tubo. El medio con enzimas se elimina por
decantación y se substituye con medio fresco sin enzimas (por ejemplo CPW9M o
CPW13M) con la finalidad de lavar los protoplastos. Este proceso puede repetirse unas
tres veces. Finalmente los protoplastos se resuspenden en un medio con 21% de
sacarosa (CPW21S) y se centrifugan a 200 xg por 1 min. En este caso los protoplastos
deben flotar en la parte superior del tubo, de donde pueden ser tomados para ser
cultivados. Se sabe que la síntesis de la nueva pared celular comienza en cuanto se
retira la solución enzimática. Este método de aislamiento funciona para la obtención
de protoplastos a partir de hojas de un gran número de especies, pero también se
puede partir de tejido calloso o incluso de suspensiones celulares. Una vez aislados
los protoplastos, éstos pueden ser cuantificados con ayuda de un hemocitómetro,
teñidos con diacetato de fluoresceina para medir su viabilidad y/o con calcofluor para
monitorear la síntesis de pared celular.

Tabla 18. Composición del medio CPW para el aislamiento y cultivo de protoplastos.

KH2PO4 27.2 mg/l

KNO3 101.0 mg/l
CaCl2 - 2H2O 1480.0 mg/l
MgS O4 - 7H2O 246.0 mg/l
KI 0.16 mg/l
CuS O4 - 5H2O 0.025 mg/l

pH 5.8

CPW13M: CPW + 13% manitol

CPW9M: CPW + 9% manitol
CPW21S: CPW + 21% sacarosa

(Power y Davey 1990)

98
CULTIVO DE PROTOPLASTOS

Una vez aislados, los protoplastos pueden ser cultivados en medio sólido,
líquido o líquido sobre sólido. Si el medio es el adecuado, primeramente comienza la
síntesis de la nueva pared celular y luego comienza la división, originándose de cada
protoplasto un microcallo que al crecer da lugar al tejido calloso. En algunas especies
es posible regenerar plantas completas a partir de este tejido calloso, ya sea por la vía
de la organogénesis o de la embriogénesis somática. Para las primeras fases del
cultivo se puede utilizar un medio basado en el MS, con 3% de sacarosa, 2 mg/l de
ANA y 0.5 mg/l de BA y 9-13% de manitol como osmoprotector. Este medio se adapta
a un buen número de especies; sin embargo, algunas requieren medios de cultivo más
complejos o de diferentes concentraciones y/o combinaciones de reguladores del
crecimiento.

99
 Hoja Asepsia del tejido

Células en suspensión

Tejido calloso Solución de plasmólisis

CPW13M
CPW9M
10 - 30 min

Mezcla enzimática en CPW13M

o CPW9M
3 - 18 horas a 28 C.
Agitación muy suave o estático

Filtrado para eliminar

restos celulares de
tamaño grande

Lavados para eliminar las enzimas

Determinación del número, viabilidad Centrifugación, eliminar
y/o síntesis de pared celular en los sobrenadante y substituir por
protoplastos medio fresco (varios ciclos ).

Resuspensión en CPW21S
Cultivo de los protoplastos Centrifugación y colecta de los
protoplastos (deben flotar sobre el
medio)

Figura 20. Procedimiento para el aislamiento y cultivo de protoplastos.

100
Figura 21. Protoplastos de chile (Capsicum annum cv. Tampiqueño 74, tipo serrano).
Los protoplastos fueron preparados por digestión enzimática de segmentos de tejido
de cotiledones de plántulas de 15 días, obtenidas por germinación de semillas en
condiciones asépticas. La digestión se llevó a cabo con una mezcla de celulasa al 2%
y macerozima al 0.5%, en presencia de manitol 0.5 M, pH 5.6, a 29 C durante 14
horas.

101
 14. CULTIVO DE ANTERAS Y MICROSPORAS Y GENERACION DE PLANTAS
HAPLOIDES Y DIHAPLOIDES

Una de las aplicaciones más interesantes del cultivo de tejidos vegetales lo es

sin duda la generación de plantas haploides mediante el cultivo de anteras o
microsporas. Los primeros experimentos que se realizaron en este campo datan de
1950, cuando se realizó el primer cultivo exitoso de granos de polen en un medio
artificial. En dicho trabajo se cultivó polen de varias gimnospermas, lográndose en
algunos casos su desarrollo in vitro hasta formar pequeños fragmentos de tejido
calloso. Sin embargo, fue hasta 1967 cuando Guha y Maheshwari obtuvieron las
primeras plantas haploides generadas mediante el cultivo de anteras. Esto se logró
cultivando anteras de Datura inoxia. Desde entonces se ha logrado el cultivo exitoso
de anteras y polen, generándose tejidos o plantas haploides en unas 200 especies
vegetales, la mayoría de ellas solanáceas o gramíneas. La vía para la regeneración
de plantas completas en estos sistemas es a través de la producción de embriones
directamente a partir de las microsporas (células precursoras del polen) o bien
después de una fase intermedia de tejido calloso. A este tipo de regeneración se le
aplica también el nombre de androgénesis.

Entre las aplicaciones de las plantas haploides generadas in vitro destacan las
siguientes:

 Estudios de genética cuantitativa e interacciones génicas, los cuales resultan muy

difíciles en plantas diploides debido a los fenómenos de dominancia y recesividad,
así como el resto de interacciones que pueden ocurrir entre alelos.
 Estimación del número de genes que participan en las características poligénicas,
sin tener la interferencia causada por la presencia de diferentes copias de un mismo
gen.
 Producción de líneas isogénicas para ser utilizadas en programas de
fitomejoramiento.

Es sin duda en el último punto, la producción de líneas isogénicas, en donde se

encuentra el mayor potencial de este tipo de cultivo. Una línea isogénica es aquella
que es homocigota para todas sus características, eso significa que el fenotipo
observado corresponde al genotipo. Estas líneas isogénicas tienen una enorme
utilidad en los programas de fitomejoramiento ya que todas sus características
genéticas son visibles dado que no hay dominancia ni otro tipo de interacciones entre
alelos, por lo que las características de su progenie son perfectamente predecibles.
Por métodos tradicionales de fitomejoramiento, la obtención de una línea isogénica
puede tomar cuando menos 5 o 6 generaciones. Mediante la generación de plantas
haploides por medio de androgénesis seguida por una diploidización, pueden
obtenerse líneas isogénicas en un período de tiempo muy corto, con las siguientes
ventajas (Snape 1989):

102
 Ahorro de tiempo desde la obtención de materiales selectos hasta su
comercialización.
 Incremento de la eficiencia de selección con relación a las prácticas convencionales
debido al incremento de la variación genética aditiva.
 Ausencia de variación dentro de la segregación de familias.
 Ausencia de variabilidad debida a dominancia.
 Disminución en los efectos de variación debida al medio ambiente.

Esta técnica es cada día más utilizada en especies autógamas de cereales de

grano pequeño, de las que se obtienen plantas haploides y doble haploides
(dihaploides) fértiles, que permiten la generación de l¡neas dihaploides en número
suficientes para integrarlos a los programas de fitomejoramiento. En esencia, el
método de obtención de líneas dihaploides es un método para la fijación de
gametos recombinantes provenientes de progenitores heterocigotos, directamente
como líneas homocigóticas fértiles en una sola generación, lo cual no puede lograrse
con ninguna otra técnica. Esta característica especial trae consecuencias
genéticas positivas que deben ser aprovechadas por los fitomejoradores (Snape
1989).

La aplicación práctica de los sistemas dihaploides depende del sistema de

mejoramiento de un cultivo específico y se tienen que separar en dos grandes grupos:
los dihaploides producidos en especies autógamas, y los dihaploides producidos en
especies alógamas.

El sistema de generación de líneas dihaploides tiene su máximo potencial con

cultivos de especies autógamas, para cuyo mejoramiento genético se utiliza el sistema
de pedigrí, en el que las plantas F1S producidas por hibridación artificial entre
progenitores previamente seleccionados, originan F 2S cuyos individuos son
productos recombinantes de los genomas de los progenitores; pero son, por supuesto,
altamente heterocigóticos y se requiere una serie de autopolinizaciones sucesivas y
selecciones cuidadosas hasta fijar finalmente después de 6 o 7 ciclos (que pueden ser
años), algunas características de interés en forma homocigótica.
La liberación de variedades nuevas por estas técnicas tradicionales es muy tardada,
mientras que por el sistema de generación de dihaploides se cultivan las anteras o
microsporas de híbridos F, y a más tardar en 6 meses se tiene un conjunto
de líneas dihaploides homocigóticas, totalmente uniformes en todas sus
características, que son seleccionadas por el mejorador en función de las
características heredadas de los progenitores programados.

A pesar de las ventajas que acaban de describirse para la obtención de líneas

dihaploides, es conveniente señalar dos desventajas: la primera es que se fija una
muestra completamente aleatoria de gametos, por
lo que solo una pequeña proporción de las líneas formadas llenará las expectativas
de recombinación genética de las características de los progenitores. La
segunda desventaja se deriva al utilizar plantas F1 en las que sólo existió una ronda
de recombinación entre los genomas parentales, aunque esto se puede remediar

103
empleando anteras y/o microsporas de plantas F2 o F3 con la ventaja de que se pueden
seleccionar plantas donadoras que muestren algunas de las características deseadas.

La producción de líneas dihaploides en especies alógamas tiene un impacto

menor para el fitomejoramiento; sin embargo, se puede utilizar el sistema de
dihaploides en esquemas de selección recurrente que requieren un conjunto de ciclos
hasta lograr variedades sintéticas. En cada ciclo en donde los
dihaploides son producidos de una muestra aleatoria de progenitores, se
identifica a los mejores, los cuales proveerán la semilla para la siguiente generación.
Otro uso que puede tener el sistema de generación de dihaploides en especies
alógamas es cuando la polinización cruzada trae como consecuencia
autoincompatibilidad, originando una fuerte restricción para la obtención de h¡bridos F1
en tales cultivares, por lo que el sistema de dihaploides puede proveer una solución
rápida y novedosa para este sistema.

FACTORES QUE INTERVIENEN EN LA GENERACION DE DIHAPLOIDES

En general, las microsporas formadas al final de la meiosis están genéticamente

programadas para una diferenciación terminal que origina tubos polínicos y gametos.
Sin embargo, se ha observado que las microsporas de algunas especies tienen la
capacidad de iniciar una ruta alterna de desarrollo que consiste en una
continua división celular y crecimiento (Revnolds y Kitto 1992), lo que origina el
fenómeno conocido como androgénesis del polen. La androgénesis puede seguir dos
rutas: en la primera, las microsporas producen estructuras similares a embriones
que se desarrollan en un proceso similar al de la embriogénesis cigótica; en la
segunda, a partir de la división celular continua de las microsporas se forman callos
que subsecuentemente regeneran plantas (Heberle-Bors 1985).

La diferenciación hacia la formación de granos de polen comienza con una fase

de determinación reversible que comprende toda la meiosis y por lo mismo, las
microsporas pueden seguir la ruta de la formación de gametos o pueden adquirir
competencia para iniciar un desarrollo esporofítico. El proceso de competencia hacia
la formación de un esporofito comienza en la fase temprana de la microspora, la cual
pasa por la primera mitosis del polen, que puede ocurrir 7 días después de
la formación de la microspora, y, durante ese lapso puede suceder que algunos
factores del medio ambiente de la microspora (como la acción de un regulador del
crecimiento o un choque térmico) causen la no expresión de los genes que conducen
al proceso de la gametogénesis. Si esto sucediera entonces la microspora regresa a
la programación normal de célula de un esporofito cuya característica en el instante de
la primera mitosis del polen es tener dos núcleos separados uno del otro solo por una
fina membrana compartiendo el mismo citoplasma (Heberle-Bors y Reinert 1981). Si
los dos núcleos se fusionan y siguen el proceso de multiplicación celular, el embrión o
los callos embriogénicos darán lugar a plantas dihaploides. Sin embargo, puede
ocurrir la multiplicación de células haploides en cualquiera de las etapas mitóticas
subsecuentes a la formación de la microspora (Figura 22), y si ese fuera el caso, la
planta sería haploide. Cuando se trabaja con anteras o microsporas se recomienda
que se cultiven cuando en las observaciones de muestras al microscopio se observen

104
células jóvenes. as características adicionales de las células que mejor responden
desarrollando embriogénesis son: una gran vacuola en expansión y un
núcleo que aún está inmerso en el citoplasma celular sin tocar la membrana de la
misma, que es cuando los cromosomas están en el proceso de la primera división
mitótica del proceso de formación de polen. Cuando ya no es visible la vacuola, se
observan dos o tres núcleos, el diámetro de la célula se ve aumentado y tal vez se
observen en la superficie exterior de la célula los pliegues característicos
del polen maduro, en cuyo caso, no podrán regenerarse plantas.

Desde que se inició la regeneración de plantas a partir del cultivo de anteras, se

observó que un porcentaje de ellas era haploide (infértiles), y otro porcentaje era
dihaploide (fértiles), lo cual depende de las especies y cultivares. Los dihaploides
obtenidos directamente de las plantas regeneradas van del 30 al 60% y los
porcentajes de plantas haploides del 40 al 70% (Alemanno y Guiderdoni 1994).
Lo más frecuente es que el porcentaje de dihaploides obtenidos por los
fitomejoradores no rebase el 40% de las plantas regeneradas. Varios
investigadores se han dado a la tarja de incrementar el número de plantas dihaploides
recuperadas por medio de diferentes tratamientos como es el incrementar la
concentración de manitol en el medio de cultivo (Cistue y col. 1994). Sin embargo, el
tratamiento con colchicina parece ser el más frecuentemente utilizado para
incrementar el número de plantas dihaploides regeneradas (Barnabás y col. 1991,
Alemanno y Guiderdoni 1994, Ghaemi y col. 1994, Ouyang y col. 1994).
Tanto al momento de obtener las plantas haploides como al diploidizarlas, es
recomendable hacer estudios del cariotipo para confirmar su estado de ploidía.

Para la obtención de plantas haploides pueden utilizarse como explantes las

anteras completas o bien las microsporas aisladas. Los factores que determinan la
respuesta de estos tejidos así como la eventual regeneración de plantas a partir de
ellos son los siguientes (Endress 1994, Croughan 1995):

1. Estado fisiológico y edad de la planta donadora de las anteras o microsporas. Se

sabe que para que este tipo de cultivo prospere las plantas madre deben ser lo más
vigorosas que sea posible y estar libres de cualquier tipo de estrés ambiental o
problema fitopatológico. De hecho se recomienda fertilizar las plantas antes y
durante el desarrollo de los botones florales para que el estado de las anteras sea
el adecuado.
2. Estado de desarrollo del polen al momento de iniciar el cultivo. La etapa de
desarrollo en que se encuentren los granos de polen es determinante para la
respuesta de los mismos al cultivo in vitro, ya que salvo en muy raras ocasiones el
polen maduro no responde al cultivo, por lo que debe ser colectado en cierto estadio
de desarrollo antes de su maduración. Aunque esto puede variar según la especie,
por lo general el polen colectado durante la primera división mitótica de las
microsporas uninucleadas es el que tiene una mayor capacidad de desarrollo in
vitro. El estadio de desarrollo del polen puede ser verificado mediante una tinción
del mismo con acetocarmín y una observación al microscopio.
3. Pretratamientos. Se sabe que los pretratamientos aplicados sobre el botón floral
pueden en muchos casos ser determinantes para el éxito del cultivo. El

105
 pretratamiento más recomendable es con frío, es decir, colocar los botones a 5-8
C por 7-10 días. Este tratamiento con frío tiene un efecto sincronizador en el
desarrollo del polen lo cual resulta benéfico al momento de obtener el cultivo.
Además, se cree que el frío detiene el desarrollo permitiendo que al volver a la
temperatura óptima, las microesporas tomen otra vía morfogénica formando
embriones o callo en lugar de granos de polen.
4. Medio de cultivo. A diferencia de la gran mayoría de los sistemas de cultivo in vitro,
el medio de cultivo, así como los reguladores del crecimiento no parecen tener una
influencia tan determinante en el establecimiento del cultivo de anteras y en el
desarrollo de los embriones. De hecho se ha logrado incluso la regeneración de
embriones a partir de anteras cultivadas en un medio consistente en agua destilada
con sacarosa y fierro quelado. En la mayoría de las dicotiledoneas susceptibles a la
androgénesis, esta se logra en un medio basal (por ejemplo Nitsch y Nitsch, MS o
B5 ) carente de reguladores del crecimiento, los cuales en algunos casos pueden
tener incluso efectos inhibitorios. Por el contrario, las gramíneas suelen requerir de
medios mucho más complejos, enriquecidos con aminoácidos, vitaminas, auxinas y
citocininas, así como altas concentraciones de sacarosa (por ejemplo 6% para trigo
y arroz y hasta 12% para maíz).

Por lo que respecta a la eficiencia de estos sistemas de regeneración de plantas

vía androgénesis, esta por lo general es alta. En el caso de tabaco se sabe que entre
el 1 y el 2% de los granos de polen contenidos en las anteras cultivadas producen
plantas haploides. En apariencia no se trata de un porcentaje muy alto, pero se debe
considerar que en una antera hay aproximadamente 40 000 granos de polen, lo cual
daría una producción de entre 400 y 800 plantas haploides por antera. Además, hay
que considerar que un solo botón floral contiene varias anteras.

Otra posible vía para la generación de plantas haploides es el cultivo de óvulos

no fecundados; sin embargo ésto parece ser mucho más complicado que el cultivo de
anteras o microsporas y no se tienen reportes exitosos de regeneración de plantas por
este sistema. Los óvulos fecundados sí han sido cultivados en varias ocasiones, pero
éstos no generan plantas haploides.

En la figura 23 se muestra el proceso general para la obtención de plantas

haploides y en la 24 un aspecto de las estructuras embrionarias obtenidas al cultivar
anteras de trigo.

106
Figura 22. Esquema general de las divisiones de la meiosis y de las dos divisiones
mitóticas de una microspora para formar un grano de polen.

107
 Botones florales en el estadio de desarrollo adecuado

Pretratamiento a
5-8 C por 7-10 días

Asepsia

Disección y remoción de las anteras

Verificación del estadio de desarrollo

del polen mediante tinción con
acetocarmín

Inoculación de anteras completas Maceración para liberar el polen

e inoculación de polen aislado

Tejido calloso

Embriones

Plantas
haploides o
dihaploides

Figura 23. Proceso general para la obtención de plantas haploides o dihaploides.

108
Figura 24. Estructuras embrionarias desarrolladas a partir de anteras de trigo
cultivadas in vitro. a. antera con estructuras embriogénicas globulares emergiendo de
su interior. b. desarrollo de callos embriogénicos a partir de estructuras globulares
procedentes de las anteras.

109
 15. VARIABILIDAD GENETICA DE LAS PLANTAS GENERADAS IN VITRO

Debido a sus enormes ventajas, los sistemas de cultivo in vitro de tejidos

vegetales se han convertido en una herramienta indispensable para el campo de la
investigación en biología vegetal, así como para el mejoramiento y multiplicación
masiva de un sinnúmero de plantas de interés. Sin embargo, se sabe que ciertos tipos
de cultivos in vitro tienen un efecto desestabilizante en el genoma de las células que
puede dar como resultado la variación genética o citogenética de las plantas
generadas a partir de éstas. La inestabilidad aparentemente se presenta sobre todo
en los procesos de mantenimiento y duplicación del ADN así como en la mitosis misma.
Este tipo de variación que se presenta en las plantas regeneradas in vitro, llamada
variación somaclonal, puede ser considerada como un fenómeno negativo si se
presenta dentro de los esquemas de propagación masiva de plantas en los cuales se
pretende mantener el genotipo exacto de los individuos elegidos como progenitores.
En ocasiones, esta variación acumulada durante varios ciclos de subcultivo le resta a
los tejidos la capacidad de regeneración de plantas completas a partir de ellos. Por
fortuna, esta variación somaclonal no se presenta con la misma frecuencia en todos
los sistemas de cultivo in vitro y en algunos de ellos es prácticamente inexistente. Por
lo general, la variación somaclonal es mucho más frecuente en cultivos compuestos
por células o tejidos desdiferenciados, como las células en suspensión o el tejido
calloso. En estos casos, la variación se va acumulando con el tiempo, lo cual significa
que puede ser mucho mayor en los cultivos que se han mantenido por tiempo
considerable in vitro. Por otra parte, la variación somaclonal está prácticamente
ausente cuando se cultivan estructuras organizadas como meristemos y yemas, por lo
que puede considerarse que éstos son los sistemas ideales para la propagación clonal
sin aparición de variantes.

Si bien la variación somaclonal puede ser un fenómeno negativo en algunos

casos, ésta puede también ser utilizada como vía para la obtención de variantes que
pueden ser utilizadas en esquemas de fitomejoramiento. En estos casos, la variación
somaclonal no solo es deseable sino que incluso puede ser acelerada mediante la
utilización de mutágenos y selección de las variantes buscadas.

En cuanto a los mecanismos que desencadenan la aparición de la variación

somaclonal, éstos aun no están claros. Se sabe que la variación puede presentarse
en tres niveles diferentes, como se resume en la tabla 19 (Gould 1986).

Tabla 19. Niveles en los que se puede presentar la variación somaclonal en los cultivos
in vitro.

110
 Tipo de variación Causas posibles

1. Variación a nivel citogenético

Poliploidía Replicación de los cromosomas sin

Aneuploidía
Deleciones
Inversiones
Alteraciones cromosómicas
(cromosomas dicéntricos o telocéntricos)
Intercambios o translocaciones
Incremento en la heterocromatina
2. Variación a nivel genético
división celular.
Aparición de husos mitóticos multipolares,
migración errónea de los cromosomas
durante la mitosis.
Rompimiento parcial de los cromosomas
con pérdida de los fragmentos
desprendidos.
Rompimiento y reunión en posición
invertida de fragmentos en un
cromosoma.
Rearreglos cromosómicos
Rompimiento y reunión de fragmentos
entre dos o más cromosomas no
homólogos
Amplificación de secuencias repetidas de
ADN.

Mutaciones puntuales Alteraciones en la secuencia de bases del

ADN.
Alteración de características poligénicas Cambios en la posición de los genes,
inserciones.
Mutaciones en genes citoplásmicos Alteraciones en el genoma de
mitocondrias y plastidios.
3. Variación epigenética

Cambios en la expresión genética Alteración en los sistemas de metilación

del ADN (?). Adaptaciones fisiológicas.
4. Variación debida a otras causas

Mayor vigor en plantas generadas in vitro Eliminación de virus y otros patógenos.

En cuanto a la frecuencia en que se presenta la variación somaclonal en los cultivos

susceptibles a ella, esta suele ser variable y depende de factores como la fuente del
explante cultivado in vitro, el genotipo, el grado de organización del tejido, los
componentes del medio (sobre todo reguladores del crecimiento), la edad del cultivo y
la tasa de crecimiento del mismo.

111
 Actualmente se cuenta con varios estudios acerca de la frecuencia de variación
en algunas especies. A manera de ejemplo, se presentan datos de algunas de ellas
en las tablas 20 y 21.

Tabla 20. Variación causada por el cultivo in vitro en plantas de trigo. Se encontraron
las siguientes clonas variantes con respecto a la planta progenitora (Larkin 1986).

Característica cv. Millewa cv. Warigal cv. Yaqui

50E
+ - + - + -

No de granos por espiga 2 1 0 2 31 3

Peso del grano 1 6 1 7 33 9

Producción de grano 6 5 0 16 31 8

Producción de biomasa 14 2 0 4 62 5

+. Indica el No. de clonas estadísticamente superiores al progenitor

-. Indica el No. de clonas estadísticamente inferiores al progenitor

Tabla 21. Frecuencia de aparición de alteraciones citogenéticas atribuibles al cultivo

in vitro en algunos cultivares de avena y maíz (Benzion et al. 1986).

ALTERACION Avena cv. Avena cv. Maíz Maíz Maíz

Tippecano Lodi (Benzion (Lee (Rhodes
e (McCog 1984) 1984) 1986)
(McCog 1982)
1982)
POLIPLOIDIA 2.5% 5.9% 1.6% 0.7% 14.4%

ANEUPLOIDIA 0% 0.4% 5.4%

MONOSOMIA 2.5% 5.9%
TRISOMIA 0.6% 1%
INTERCAMBIOS 3.7% 7.5% 6.2% 16.9% 12.5%
INVERSIONES 0.3% 0.2% 0.3% 0.4% 0%
DELECIONES ND ND 3.6% 22.1% 14%

TELOCENTRICOS 20.6% 23.8% ND ND ND

ND: Dato no determinado en el estudio

112
 Como se ha comentado, el fenómeno de variación somaclonal no siempre se
considera negativo, y por el contrario, en muchas ocasiones es una herramienta
importante para la obtención de variantes que muestren características superiores a
los progenitores. Mediante este tipo de variación combinada con esquemas adecuados
de selección, ha sido posible obtener líneas con mayor resistencia a herbicidas, a
sales, a sequía, a temperaturas extremas, a patógenos (toxinas), entre otros.

Con relación a la selección de variantes, ésta puede ser de dos tipos diferentes:

Selección positiva. En este caso se busca aplicar una presión de selección que permita
la supervivencia únicamente de las variantes deseadas. Por ejemplo, tratar con NaCl
para aislar líneas resistentes a sal, o con herbicidas para aislar líneas resistentes a los
mismos.

Selección negativa. Se utiliza para aislar variantes que no sean capaces de crecer bajo
ciertas condiciones; por ejemplo, mutantes auxótrofas incapaces de crecer en
un medio mínimo. Para lograr esto, se hace un cultivo en un medio mínimo y se
trata este con algún agente que elimine a las células que están creciendo activamente.
Por ejemplo, se sabe que el arseniato mata a las células activas sin dañar a las
quiescentes, o bien la 5-bromodesoxiuridina (BUdR) actúa como análogo de la timina
intercalándose en el ADN de las células activas haciéndolo fotolábil. La aplicación de
luz a las células activas tratadas con BUdR las mata por inactivación del ADN.

Finalmente, cuando lo que se busca es precisamente la variabilidad in vitro, ésta

puede acelerarse con el uso de mutágenos físicos o químicos aplicados al cultivo antes
de regenerar las plantas. Entre los mutágenos físicos que se pueden utilizar están las
radiaciones UV, X o . Entre los mutágenos químicos más utilizados están el
etilmetanosulfonato (EMS) y el metilmetanosulfonato (MMS). Estos agentes añaden
grupos etilo o metilo a la guanina induciendo errores de apareamiento de las cadenas
de ADN. Otros mutágenos químicos son la nitrosoguanidina (NTG) y la etilnitrosourea
(ENU). A pesar de que efectivamente se pueden obtener mutantes por los medios
físicos y químicos señalados, es conveniente hacer notar que hasta ahora no se ha
desarrollado un sistema para lograr mutagénesis dirigida hacia un determinado
cromosoma, y mucho menos hacia un segmento específico de ADN que contenga los
genes de interés. Por otro lado, el número de mutantes generados por estos sistemas
es muy elevado y en una gran proporción las mutaciones generadas no mejoran las
características deseadas; por lo mismo, frecuentemente este tipo de trabajos
consumen mucho tiempo y los resultados no son seguros.

113
 16. APLICACIONES DEL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES PARA LA
CONSERVACION DE GERMOPLASMA

Sin duda, uno de los problemas más serios que enfrenta actualmente la
humanidad es la rápida desaparición de especies animales y vegetales debido al mal
uso que desde hace mucho tiempo se les ha dado a los recursos naturales, así como
a las presiones derivadas de la sobrepoblación en la mayoría de las regiones del
planeta. En el caso de las especies vegetales basta mencionar el gran número de
especies que se pierden debido a la tala y destrucción de los bosques tropicales o
incluso de diversas especies que habitan en zonas desérticas aparentemente poco
atractivas para la explotación humana. Este problema ya se percibía desde principios
de siglo, cuando Vavilov (1920) definió los diferentes centros de diversidad genética
en el planeta e hizo énfasis en la necesidad de conservar el germoplasma vegetal.

Actualmente la conservación del germoplasma vegetal debe verse como una

actividad que nos permita preservar nuestro patrimonio de la biodiversidad.
Primeramente, es necesaria la conservación de especies silvestres amenazadas,
muchas de las cuales aun no son conocidas en cuanto a sus propiedades y posible
aprovechamiento. Por otra parte, se requiere un esfuerzo importante para conservar
aquellos genotipos de plantas cultivadas que actualmente se ven amenazados al
haberse dejado de utilizar por haber sido substituidas por variedades mejoradas. De
hecho, las tendencias actuales del fitomejoramiento, como la selección sobre la base
de la uniformidad y para fines muy definidos, han llevado a la pérdida de una cantidad
considerable de germoplasma vegetal. Las plantas cultivadas se pueden agrupar de
acuerdo a su uso como germoplasma en los siguientes tipos:

1. Cultivares modernos. Genotipos muy productivos, adaptados a regiones de

reducida extensión y características ecológicas bien delimitadas, generalmente
vulnerables ante las plagas o cambios ambientales. Actualmente no están
amenazadas, pero pueden ser substituidos en cualquier momento.
2. Cultivares caducos. Genotipos que ya no son utilizados por haber sido desplazados
por otros mejorados.
3. Cepas reproductoras. Genotipos que nunca llegaron a utilizarse de manera
intensiva pero que sirvieron de progenitores de los cultivares modernos.
4. Razas locales o cultivares criollos. Selecciones locales de especies cultivadas en
muchas regiones. Fuerte tendencia a substituirlos por cultivares modernos.
5. Formas silvestres de especies cultivadas.
6. Especies silvestres relacionadas con las cultivadas.

De los tipos anteriores, a excepción del primer grupo, todos están en peligro
inmediato de desaparecer o ya han desaparecido. Por ejemplo, a principios de siglo
se cultivaban en la India unos 30, 000 genotipos diferentes de arroz, mientras que en
la actualidad se cultivan alrededor de 50 variedades. En Turquía existían unas 100
variedades de betabel, pero actualmente solo se cultiva una importada de Alemania.
En Grecia se han perdido el 95% de las variedades de trigo. En Sudáfrica se han

114
substituido todas las variedades locales de sorgo por una importada de Texas. En
Latinoamérica se han perdido la mayoría de los cultivares criollos de maíz y otras
especies al ser substituidos por variedades mejoradas. El hecho de que un cultivar sea
substituido por otro puede considerarse como normal o incluso benéfico, ya que las
nuevas variedades presentan muchas ventajas, pero lo que debe evitarse es la pérdida
total de la variabilidad genética existente cuando se substituyen los materiales criollos
con las variedades mejoradas. Por citar solo un ejemplo, Zea diploperennis, especie
silvestre relacionada con el maíz, es resistente a 4 de las 7 principales plagas que
dañan a este cultivo, por lo que tiene un enorme interés para el mejoramiento del maíz.
Sin embargo esta especie ya se había dado por extinta en 1920 y afortunadamente
fue redescubierta en 1978. De haberse perdido, se habría perdido una fuente
insustituible de genes para el mejoramiento del maíz cultivado.

Es clara la enorme importancia que para el futuro de la humanidad tiene la

conservación del germoplasma vegetal. Por desgracia esto no resulta tan sencillo,
pues muchos países no cuentan con los recursos o el interés para hacerlo. Las formas
tradicionales para la conservación del germoplasma incluyen las reservas naturales,
los parques o los bancos de germoplasma mantenidos en el terreno. Esto se refiere a
la conservación de los ecosistemas intactos para mantener a las especies vegetales
que habitan en ellos. Sin embargo, es bien sabido que este tipo de acciones no siempre
es posible y muchas veces las reservas naturales están sujetas a los cambios políticos,
económicos o sociales que se presentan en la nación encargada de mantenerlas. En
relación a la conservación de germoplasma de especies cultivadas, no es posible
obligar a los campesinos a mantener cultivares que muchas veces resultan inferiores
a los nuevos. Por ello se hace necesario el establecimiento de sistemas de
preservación de germoplasma como las colecciones en campo y los jardines
botánicos, sin embargo su capacidad es muy limitada y su importancia está orientada
a la educación más que a la conservación. Una alternativa para la conservación la
constituyen los llamados bancos de semillas. Estos presentan muchas ventajas y una
capacidad mucho mayor en cuanto al número de especies que se pueden conservar.
Sin embargo este sistema no es aplicable a las especies de reproducción vegetativa y
tampoco a aquellas especies que producen semillas recalcitrantes (Semillas que
pierden rápidamente su viabilidad y por lo tanto no pueden ser almacenadas, son la
mayoría de las especies tropicales). Por último, las semillas pueden estar infectadas
por virus y transmitirlos a las plantas generadas a partir de ellas. A pesar de todas
estas desventajas, los bancos de semillas son actualmente el principal sistema para la
conservación de germoplasma vegetal.

Una de las disciplinas que está aportando nuevas alternativas para la

conservación del germoplasma vegetal, es la biotecnología. La generación de nuevas
variedades mejoradas implica la búsqueda de los genes adecuados, que pueden
existir en algunas variedades cultivada o en plantas silvestres, pero si estas fuentes
de genes ya no existen, se habrá perdido para siempre la posibilidad de transferir sus
características a otras plantas. Hasta ahora ha sido posible combinar genes ya
existentes o transferirlos a grupos taxonómicamente muy alejados. Se han podido
mutar o aun multiplicar genes in vitro, pero hasta el momento no se han fabricado
genes artificiales que confieran a una planta resistencia o le den cualquier tipo de

115
propiedad deseable. Para la producción de plantas mejoradas debe disponerse de
genes naturales. De hecho, ya en 1981 James Murray afirmaba que “la importancia de
la diversidad genética para el futuro de la ingeniería genética es absolutamente
definitiva, pudiendo ésta constituirse en el recurso limitante para el avance de esta
área”. Lo anterior demuestra la importancia de la conservación del germoplasma como
fuente potencial de genes útiles. Por otro lado, debe considerarse con la misma
importancia, el sinnúmero de posibilidades que ofrecen las especies y cultivares
actualmente amenazados en el área de la producción de compuestos naturales de
interés en diversas áreas de la actividad humana.

Los biotecnólogos vegetales no solo se han preocupado por el problema de la

conservación del germoplasma, sino que han establecido alternativas prometedoras
para contribuir a solucionarlo. En ese sentido, se han desarrollado los siguientes
sistemas de conservación in vitro de germoplasma vegetal.

1. Conservación a corto plazo. Consisten simplemente en conservar el material in vitro

y mantenerlo mediante subcultivos normales. De esta forma, pueden mantenerse
especies o variedades por tiempo indefinido, pero con el inconveniente del subcultivo
frecuente ( de 15 días a un máximo de 3 meses ). Este sistema no se utiliza mucho
para la conservación en sí del germoplasma, pero sí para su propagación masiva.

2. Conservación a mediano plazo. También conocido como almacenamiento en

condiciones de crecimiento mínimo. Este método consiste en mantener el material in
vitro de tal manera que se retarde su crecimiento con la finalidad de incrementar lo
más posible el tiempo entre subcultivos. El crecimiento retardado puede lograrse
utilizando uno de los siguientes métodos (Grout 1995):

 Incubación a baja temperatura. Normalmente entre 1 y 10 C para plantas cuyo

crecimiento óptimo se da entre 20 y 27 C.
 Utilización de medios pobres en nutrientes
 Utilización de osmóticos para reducir la disponibilidad de agua. Generalmente se
utiliza manitol o sacarosa en concentraciones de 3 a 6%.
 Utilización de inhibidores del crecimiento como ácido abscísico (5-50 mg/l), Cycocel
(2-10 mg/l) o ácido N-dimetilaminosuccinamico (5-50 mg/l).

Puede utilizarse uno de los métodos anteriores o una combinación de varios. Al

momento de requerirse el material, éste únicamente tiene que ser transferido a un
medio de proliferación para obtener un gran número de plantas en poco tiempo. El
método más adecuado depende de la especie y el tejido a conservar. Algunos
ejemplos de estos sistemas se presentan en la tabla 22 (Grout 1995).

116
Tabla 22. Ejemplos de sistemas de conservación de germoplasma in vitro mediante
almacenamiento en condiciones de crecimiento mínimo.

ESPECIE INCUBACION TIEMPO DE REFERENCIA

C SUBCULTIVO
SEMANAS
Trifolium repens 5 40 Bhojwani 1981

Vitis rupestris 4-12 24 Withers 1982

Vitis rupestris 9.5 26 Barlass y Skeene 1983

Allium porrum 7 24 Dore 1988

Eucalyptus citriodera 10 36 Mascarhenas y

Agrawal 1991
Coffea arabica 20 26 Bertrand-Desbrunais
1992
Malus domestica 4 52 Lundergen y Janick
1979
Ipomoea batatas 22 52 Alan 1979

Musa spp. 5 56 Banerjee y Delanghe

1985
Pyrus communis 4 72 Wanas et al. 1986

Fragaria spp. 4 60 Reed 1991

Colocasia esculentum 9 156 Zandvoort y Staritsky

1986
Xanthomoas spp. 13 156 Zandvoort y Staritsky
1986

3. Conservación a largo plazo. En este caso se utiliza el método llamado

criopreservación, que consiste en conservar los tejidos congelados a temperaturas
extremadamente bajas (usualmente – 196 C, temperatura del nitrógeno líquido) por
tiempo indefinido. La criopreservación es un proceso mucho más delicado que los
anteriores y se encuentra aun en fase de investigación. De manera general, la técnica
es la siguiente (Grout 1995 b):

1. Preacondicionamiento de los explantes (usualmente meristemos, tejido calloso o

suspensiones celulares) mediante incubación a bajas temperaturas.

117
2. Adaptación a la presencia del crioprotector (substancia utilizada para proteger las
estructuras celulares durante el proceso de congelación y el de descongelación;
uno de los más utilizados es el dimetilsulfóxido o DMSO).

3. Congelación. Puede ser gradual, en una sola etapa o en varias etapas. La etapa
final es la colocación en nitrógeno líquido (- 196 C).

4. Almacenamiento en nitrógeno líquido por tiempo indefinido.

5. Descongelación. Suele ser el paso crítico. Gradual o en varios pasos.

6. Análisis de la viabilidad del tejido.

7. Proliferación y regeneración de plantas. Análisis genético.

El proceso de criopreservación se ha llevado a cabo con éxito en meristemos

de manzano, clavel, chícharo, cacahuate, papa, fresa y jitomate, entre otros. Sin duda,
en un futuro próximo éste será el sistema más apropiado para la conservación de
germoplasma vegetal.

En general, las ventajas de la conservación in vitro de germoplasma vegetal son

las siguientes:

 Altos índices de multiplicación. A partir de poco material almacenado puede

generarse un número ilimitado de plantas en relativamente poco tiempo.
 Los costos de mantenimiento son realmente muy bajos debido a que el
mantenimiento requerido es mínimo.
 El material almacenado está completamente libre de patógenos.
 Los bancos de germoplasma in vitro no pueden ser afectados por fenómenos
ambientales.
 El espacio que se requiere es mínimo.
 El material puede intercambiarse incluso a grandes distancias de manera muy fácil
y sin restricciones fitosanitarias.
 La variación genética del material es mínima si se elige el sistema de cultivo
adecuado (meristemos o yemas).

Por último, además de los sistemas de conservación in vitro de germoplasma,

las técnicas de cultivo in vitro nos permiten el rescate de especies amenazadas o de
las cuales queden muy pocos individuos vivos. Esto se logra mediante los sistemas de
propagación masiva a partir de un solo individuo o una pequeña parte del mismo, para
generar un gran número de nuevas plantas.

La figura 25 presenta un esquema general del proceso de rescate y

conservación in vitro de especies amenazadas.

118
OBTENCION DE MUESTRAS DE LA PRETRATAMIENTOS
ESPECIE DESEADA SANEAMIENTO

INICIO DEL CULTIVO IN VITRO

MULTIPLICACION IN VITRO

BANCO DE GENES EN EL TERRENO

UTILIZACION RACIONAL DE LA ESPECIE

ESTABLECIMIENTO Y MANTENIMIENTO DE UN
BANCO DE GERMOPLASMA IN VITRO

CRIOPRESERVACION

Figura 25. Esquema general del proceso de rescate y conservación in vitro de

especies amenazadas.

119
 17. TRANSFORMACION GENETICA DE PLANTAS

El reciente surgimiento de las técnicas de ingeniería genética de plantas ha

abierto una gama muy amplia y prometedora de posibilidades para el mejoramiento
genético de las especies cultivadas por el hombre, creando lo que se supone será una
nueva revolución en la agricultura. El nacimiento de estas técnicas ha sido posible
gracias a dos hechos fundamentales. Primeramente el desarrollo de la llamada
tecnología del ADN recombinante que nos da la posibilidad de aislar, manipular y
transferir genes, y por otro lado, el avance de los sistemas de cultivo de tejidos
vegetales discutidos antes que nos da la posibilidad de controlar hasta cierto punto los
procesos morfogeneticos in vitro y regenerar plantas completas partiendo de una sola
célula. La transformación genética de plantas consiste en introducir al genoma de
éstas nueva información genética que les confiera características diferentes. La fuente
de esta nueva información puede ser cualquier organismo vivo por lo que no existen
barreras taxonómicas cuando se utiliza esta metodología, siendo el único requisito el
que la información a introducir este colocada bajo el control de señales reguladoras
reconocibles por la planta. Esta metodología a pasado ya de ser utilizada únicamente
con fines de investigación a tener una aplicación práctica inmediata en la agricultura.
De hecho entre 1986 y 1993 se realizaron 1025 pruebas de campo en 32 países con
38 especies de plantas genéticamente modificadas con 200 diferentes características
modificadas por ingeniería genética (Goy y Duesing 1995 ).

El proceso que se sigue para obtener una planta transgénica consta de dos
fases: primeramente se introduce la información genética a una o varias células
mediante sistemas que se discutirán más adelante, y posteriormente se regenera una
planta completa a partir de cada célula transformada. De acuerdo a esto, la
recuperación de plantas transformadas depende de la frecuencia de introducción de
los nuevos genes a las células vegetales, y de la capacidad de estas células para
formar plantas completas bajo los sistemas de cultivo in vitro. El objetivo final de esta
técnica desde un punto de vista práctico, es la introducción de nueva información que
le confiera ventajas a la planta, y por lo tanto, la haga más productiva. Sin embargo, al
introducir esta nueva información, o bien durante las fases previas que se requieren
para el desarrollo de los sistemas de transformación, es muy conveniente la
introducción simultánea de genes que produzcan fenotipos claramente identificables
en las plantas transformadas para ser utilizados a manera de marcadores. Estos genes
(llamados marcadores de selección) suelen codificar para enzimas que confieren
resistencia a algún antibiótico o herbicida que normalmente mata o retarda el
desarrollo de tejidos no transformados, por lo que resulta relativamente sencillo
seleccionar aquellos tejidos que han sido transformados. Otro tipo de genes llamados
reporteros, producen actividades enzimáticas específicas en los tejidos transformados
que son fácilmente detectables y cuantificables. De los dos tipos de genes antes
mencionados, los más utilizados en la transformación genética de plantas son los
siguientes:

120
 aacC3 y aacC4. Gentamicina acetiltransferasas. Genes bacterianos (Serratia
marcescens, Klebsiella pneumoniae) que confieren resistencia a gentamicina
(Hayford et al. 1988).
 ble. Resistencia a bleomicina (Dandekar 1992).
 bxn. Gen bacteriano (Klebsiella azaenae) de la bromoxinil nitrilasa que confiere
resistencia al herbicida bromoxinil (Stalker et al. 1988).
 cat. Cloranfenicol acetiltransferasa, resistencia a cloranfenicol y actividad
enzimática detectable (Dandekar 1992).
 dhfr. Dihidrofolato reductasa, confiere resistencia a este compuesto (Dandekar
1992).
 gfp. “Green Fluorescent Protein”. Proteína verde fluorescente. Gen aislado de la
medusa Aequorea victoria. Esta proteína y otras muy similares presentes en otros
Cnidarios tienen la particularidad de emitir fluorescencia al ser excitadas con luz de
alrededor de 470 nm. Debido a ello su presencia puede detectarse directamente in
vivo sin necesidad de substrato (Niedz et al. 1995, Prasher 1995). Esta proteína
podría tener dos aplicaciones muy interesantes en la transformación genética de
plantas. La primera sería el monitoreo de la expresión genética y la localización de
proteínas dentro de la célula con una alta resolución. La segunda aplicación sería
la utilización del gen gfp como un marcador genético fácilmente detectable en
plantas vivas (Haseloff y Amos 1995).
 gus. -glucuronidasa. Actividad enzimática detectable por ensayos fluorométricos e
histoquímicos. Gen aislado a partir de Escherichia coli (Jefferson et al. 1987).
 hpt. Higromicina fosfotransferasa, gen bacteriano (Escherichia coli, aph IV) que
confiere resistencia a higromicina (Waldron et al. 1985).
 lac. -galactosidasa. Actividad enzimática detectable (Dandekar 1992).
 luc. Luciferasa de luciérnaga. Actividad enzimática detectable (Dandekar 1992).
 nptII. Neomicina fosfotransferasa II, Gen aislado del Tn5 que confiere resistencia a
kanamicina y otros compuestos similares (G418, paromomicina y neomicina).
Actividad enzimática detectable (Bevan et al. 1983).
 psbA. Proteína QB, gen aislado del cloroplasto de Amaranthus hybridus. Confiere
resistencia al herbicida atrazina (Cheung et al. 1988).
 lux. Luciferasa bacteriana. Actividad enzimática detectable (Dandekar 1992).
 nos. Nopalina sintetasa. Actividad enzimática detectable (Dandekar 1992).
 ocs. Octopina sintetasa. Actividad enzimática detectable (Dandekar 1992).
 stp. Estreptomicina fosfotransferasa, gen aislado del Tn5 que confiere resistencia a
estreptomicina (Jones et al. 1987).
 tfdA. Gen de la 2,4-D monooxigenasa, aislado de la bacteria Alcaligenes eutrophus.
Confiere resistencia al herbicida 2,4-D (Lyon et al. 1989).

Recientemente se han desarrollado sistemas alternativos interesantes de

selección positiva; en este caso la selección no se basa en la eliminación de las células
no transformadas al aplicar un agente selectivo, sino que se dan las condiciones para
que únicamente las células que han adquirido el gen foráneo puedan desarrollarse. Un
ejemplo de esta selección positiva es la selección de células transformadas con gus
mediante la aplicación de una citocinina conjugada con un glucurónido. Las células
transformadas son las únicas con la capacidad de hidrolizar este conjugado y por lo

121
tanto de liberar la citocinina que les permita desarrollarse in vitro (Joersbo y Okkels
1996).

Por lo que respecta a los sistemas de transformación genética, hasta el

momento se han desarrollado varios con diferentes grados de eficiencia. Estos
pertenecen básicamente a dos tipos, aquellos que se valen de procesos biológicos
para la introducción del ADN y aquellos que lo hacen por medios meramente físicos.
A continuación se dan más detalles de los sistemas más utilizados:

Sistemas biológicos.

A. Agrobacterium tumefaciens

A. tumefaciens es una bacteria fitopatógena aerobia Gram negativa que causa

el trastorno conocido como “agalla de la corona” que afecta a muchas especies
de dicotiledoneas. Esta enfermedad se caracteriza por la producción de tumores en el
tejido vegetal atacado. De manera natural, el mecanismo de patogenicidad de esta
bacteria se basa en la transferencia de información genética al genoma de la planta
infectada. Esta información se localiza en un megaplasmido (alrededor de 200 Kb)
llamado plásmido Ti (inductor de tumores) dentro del cual se encuentra una región
conocida como ADN-T (ADN transferible) que es el que se inserta y expresa en el
genoma de la planta. Los productos de la expresión de este ADN en la planta son
enzimas involucradas en la biosíntesis de auxinas, citocininas y opinas. Entre estos
genes se pueden mencionar al iaaM y al iiaH que codifican para la triptofano
monooxigenasa y para la indolacetamida hidrolasa, respectivamente, enzimas que
convierten el triptofano en ácido Indolacético. Un tercer gen, el ipt, codifica para la
isopentenil transferasa que participa en la síntesis de citocininas. Las auxinas y
citocininas, al ser sobreproducidas alteran el patrón de crecimiento del tejido
produciéndose así los tumores que son el síntoma característico del ataque de esta
bacteria. Por su parte, las opinas sintetizadas por la planta infectada le sirven a la
bacteria como fuente de carbono y de nitrógeno. Además de estos genes, el ADN-T
contiene las llamadas secuencias borde, que son secuencias de 25 pb muy similares
entre sí (repeticiones directas imperfectas), que delimitan al ADN-T y son
imprescindibles para su transferencia. Estos bordes son los únicos elementos en cis
que se requieren para la transferencia del ADN-T al genoma de la planta (Klee y
Rogers 1989, Zupan y Zambrysky 1995). A diferencia de otros elementos genéticos
móviles, el ADN-T no codifica por si mismo a los productos que permiten su
transferencia, éstos están codificados por otra región del mismo plásmido Ti, llamada
región vir o de virulencia. La región vir contiene 6 operones, y los genes dentro de la
misma poseen un sistema de regulación muy fino y solo se expresan en presencia de
compuestos excretados por células vegetales heridas. Los compuestos fenólicos
producidos por la célula vegetal herida como la acetosiringona, ácido sinapínico o
ácido caféico atraen por quimiotaxis a la bacteria y luego inducen la expresión de los
genes vir. Para la quimiotaxis se requieren concentraciones del orden de 10 -7 M,
mientras que para la inducción de genes son necesarias concentraciones de 10 -5
M. Dentro de esta región vir se encuentran los genes vir A, vir G, vir B, vir C, vir D y
vir E. Los genes vir A y vir G están involucrados en la regulación del resto de los genes

122
vir. El gen vir A codifica para un receptor sensible a los compuestos fenólicos
producidos por la planta y se clasifica como un “sensor-transmisor” con propiedades
de proteína cinasa. La interacción de los compuestos fenólicos con el producto de virA
da como resultado la autofosforilación de este último. Este receptor es un homodímero
en su estado funcional. El producto de vir G es un regulador transcripcional positivo
para el resto de los genes, clasificado como un “receptor-efector”, el cual al ser
fosforilado por vir A activa la transcripción del resto de los genes vir. Por otro lado, los
productos de vir D ( vir D1 y vir D2 ) son nucleasas sitio específicas que reconocen las
secuencias bordes del ADN-T y producen rupturas de una de las cadenas en estos
puntos, generando un ADN de cadena sencilla. Por su parte, el producto de vir C se
une a la secuencia “overdrive”, que es una secuencia que se encuentra hacia afuera
del borde derecho y es necesaria para la correcta transferencia del ADN-T y
aparentemente contribuye al procesamiento del ADN que se transfiere. Por último, el
producto de vir E es una proteína que se une y protege al ADN de cadena sencilla que
es transferido al genoma vegetal. El llamado complejo T formado por la cadena sencilla
del ADN-T y los productos de vir D1, vir D2 y vir E tiene un diámetro aproximado de 2
nm, lo cual facilita su posible transferencia a través de canales membranales. El
producto de vir B forma un poro en la membrana por donde pasa el ADN al ser
transferido de la bacteria a la célula vegetal. Por otro lado, se han encontrado posibles
péptidos señal para localización nuclear en los productos de vir D2 y vir E, lo cual
podría explicar la forma en que el complejo T entra al núcleo una vez localizado en la
célula vegetal. El mecanismo mediante el cual el ADN-T se integra al genoma vegetal
aun es desconocido, pero se postula que existe algún tipo de recombinación ilegítima
que produce un corte en una de las cadenas del ADN vegetal, en el cual se integraría
el ADN-T. Posteriormente los sistemas de reparación de la célula eliminan la otra
cadena del ADN vegetal y fijarían definitivamente al ADN-T. Además de los genes vir
presentes en el plásmido Ti, se han identificado algunos factores de virulencia
localizados en el cromosoma. Este sistema de transferencia muestra relación
evolutiva con otros que producen intermediarios de ADN de cadena sencilla, como por
ejemplo los sistemas de recombinación bacteriana (Klee y Rogers 1989, Winans 1992,
Zupan y Zambrysky 1995, Herrera-Estrella et al. 1997, Zupan y Zambrysky 1997).

La virulencia de una cepa determinada de Agrobacterium tumefaciens sobre un

tejido vegetal está determinada por factores genéticos inherentes a la propia cepa y
por factores fisiológicos que surgen de la interacción de ésta con el tejido. Los factores
genéticos se refieren básicamente a las características de la región vir, mientras que
los fisiológicos tienen que ver con las señales moleculares producidas por el tejido
vegetal y la respuesta a ellas por parte de la bacteria. Una característica muy
importante del ADN-T es que sus genes pueden ser deletados y substituidos por otros
sin que esto afecte al sistema de transferencia. De esta forma se construyen los
llamados plásmidos desarmados, los cuales no inducen la aparición de tumores pero
sí permiten la transferencia de otras características deseables. Existen dos tipos
fundamentales de vectores para transformación con A. tumefaciens; el primero de ellos
lo constituyen los llamados vectores cointegrativos, en los que la información genética
a introducir a la planta se cointegra al plásmido Ti, por lo que el ADN-T y la región vir
se encuentran en un mismo megaplásmido. El otro tipo de vectores son los llamados
binarios, en los cuales los productos de la región vir actúan en trans, ya que el ADN-T

123
se encuentra en un plásmido y la región vir en otro ya sea silvestre o desarmado (Klee
y Rogers 1989). La forma en la que se realiza la transformación genética mediante
este sistema es cocultivando a los explantes vegetales con una cepa de A. tumefaciens
modificada de acuerdo a las características que se quieran introducir. Después de este
cocultivo se procede a la regeneración de plantas a partir de los tejidos vegetales
presuntamente transformados. Usualmente al tiempo de la regeneración se aplica una
presión de selección de acuerdo a los marcadores utilizados para favorecer el
desarrollo de los tejidos transformados en detrimento de los que no lo están.

La eficiencia de transformación mediante este sistema varia de acuerdo a la

especie vegetal y a la cepa bacteriana utilizada, pero en general depende de los
siguientes factores:

 Habilidad de la cepa bacteriana para transformar a las células vegetales puestas en

cocultivo.
 Eficiencia del sistema de selección para las células transformadas.
 Eficiencia del sistema de cultivo in vitro que permita la regeneración de plantas a
partir de las células transformadas.
 Estabilidad del nuevo ADN incorporado al genoma vegetal (Dandekar 1992).

B. Agrobacterium rhizogenes

Se trata de otra bacteria cuyo mecanismo de patogenicidad está basado en la

transferencia de genes al genoma de la planta infectada. En este caso el trastorno que
produce es conocido como raíz pilosa, llamado así debido a que las raíces de la planta
atacada toman este aspecto, además de proliferar de una manera desorganizada. Esta
bacteria posee un plásmido llamado Ri que se asemeja aunque no completamente al
plásmido Ti de A. tumefaciens. Una diferencia importante es que las raíces pilosas
son capaces de regenerar plantas fértiles sin que sea necesaria ninguna modificación
en el ADN-T, lo cual es prácticamente imposible partiendo de tumores producidos por
cepas silvestres de A. tumefaciens (Tempe 1989). Las cepas de A. rhizogenes se
clasifican de acuerdo al tipo de opina que producen, por lo que hay cepas tipo
manopina, cucumopina y agropina. Los plásmidos Ri de los primeros dos tipos
contienen un ADN-T único, mientras que los tipo agropina llevan dos regiones de ADN-
T, llamadas ADN-Tr y ADN-Tl). El ADN-Tr lleva el gen para la biosíntesis de agropina
y dos genes para la sobreproducción de auxinas (aux 1 y aux 2). Por su parte, el ADN-
Tl contiene 18 marcos de lectura abierta, de los cuales el 10, 11, 12 y 15 corresponden
a los llamados genes rol A, B, C y D. Estos genes son los responsables del fenotipo
Ri en las plantas que los contienen. Se ha tratado de caracterizar la función precisa de
cada uno de estos genes mediante estudios realizados transformando plantas con
genes rol individuales. Se ha visto que el gen rol A es responsable de la producción de
hojas rizadas, favorece los entrenudos cortos y alteraciones en la síntesis de
poliaminas. Se desconoce el mecanismo de acción de su producto. Por su parte, se
ha visto que el gen rol B es el más crítico para la inducción de las raíces pilosas. Se
asume que su mecanismo de acción tiene que ver con una alteración en la

124
“sensibilidad” a las auxinas en las plantas transformadas. El producto de rol B tiene la
capacidad de liberar auxinas conjugadas a glucósidos (actividad de indoxil--
glucosidasa). La expresión del gen rol B bajo el control de su propio promotor se da de
manera preferencial en los ápices y regiones de mayor división celular en la raíz. En
órganos maduros la expresión de rol B se da en el tejido vascular. El producto del gen
rol C tiene un efecto tipo citocinina en las plantas transformadas, disminuyendo la
dominancia apical y produciendo entrenudos cortos. Se ha visto que el producto de rol
C hidroliza conjugados de citocininas con glucósidos (citocinina--glucosidasa). La
expresión del gen rol C bajo el control de su propio promotor se da preferencialmente
en floema. Por último, se ha visto que el gen rol D induce la floración temprana en
tabaco, aun cuando los transcritos se localizan en la raíz. El mecanismo de acción de
su producto se desconoce. La transformación con A. rhizogenes se utiliza para la
generación de las llamadas raíces transformadas, las cuales son fáciles de cultivar in
vitro y son utilizadas sobre todo para el estudio y producción de metabolitos
secundarios. Sin embargo, como se ha mencionado, es posible regenerar plantas
partiendo de cultivos de raíces transformadas. Estas plantas en ocasiones muestran
un fenotipo peculiar, llamado síndrome de la raíz pilosa o fenotipo Ri que afecta la
forma, crecimiento, capacidad de enraizamiento, floración y fertilidad de la planta.
Algunas de las plantas regeneradas que llevan los genes rol de A. rhizogenes se
caracterizan por presentar entrenudos cortos, dominancia apical reducida y hojas
arrugadas; sin embargo, otras plantas regeneradas a partir de raíces transformadas
tienen un genotipo completamente normal. Las alteraciones fenotípicas causadas por
los genes rol de las cepas silvestres de A. rhizogenes no son necesariamente
negativas desde el punto de vista agronómico o de productividad vegetal. De hecho,
se considera actualmente que los genes rol podrían tener un papel importante en el
mejoramiento de varias especies vegetales. Por ejemplo, estos genes podrían
incrementar notablemente la capacidad de enraizamiento de muchas especies
recalcitrantes o bien producir plantas con sistemas radicales más fuertes y
abundantes. Por otro lado, en la parte aérea de estas plantas se puede lograr una
menor dominancia apical con entrenudos más cortos. Otra posibilidad es la que dan
las llamadas plantas quiméricas o combinadas. En este caso la planta transformada
con los genes rol puede servir como patrón para injertar sobre ella otro genotipo sin
que éste se vea afectado por la actividad de los genes rol, ya que esta no es
translocable. Otra posibilidad es la utilización de genes rol individuales con promotores
tejido específicos con la finalidad de alterar únicamente ciertas características de la
planta sin efectos nocivos colaterales (Tempe 1989, van der Salm 1996).

C. Virus

Se trata de otro sistema biológico natural para la transferencia de material

genético en plantas. Desde hace tiempo se ha mencionado la posibilidad de utilizar
virus como vehículos de transferencia de genes de interés; sin embargo, se ha
avanzado poco en este sentido si se compara con otras técnicas como las basadas en
Agrobacterium o algunos métodos físicos. El poco avance en este sentido se debe a
algunos problemas que se presentan con este sistema, como por ejemplo el hecho de
que la inmensa mayoría de los virus vegetales son de ARN lo que dificulta

125
notablemente su utilización como vectores de transformación. A pesar de lo anterior,
subsiste la investigación tendiente a la utilización de algunos virus para la transferencia
de genes a plantas, como es por ejemplo el caso del Virus del Mosaico de la Coliflor
(CaMV) y el Virus del Enanismo del Trigo (WDV). El primero pertenece al grupo de los
Caulimovirus y su genoma es de ADN de doble cadena, mientras que el segundo
pertenece al grupo de los Geminivirus y su genoma esta constituido por ADN circular
de cadena sencilla (Groenenborn y Matzeit 1989).

Sistemas físicos.

A. Transformación de protoplastos

Los protoplastos vegetales son células ideales para la introducción de ADN

extraño, ya que la remoción de la pared celular elimina la mayor barrera que impide la
entrada de la nueva información genética. Por otro lado, al tratarse de células
individuales y al poder cultivarse en altas densidades se facilita enormemente el
proceso de selección. Desgraciadamente, la obtención y manipulación de protoplastos
son muy complicadas y en muchas especies se carece de sistemas para la
regeneración de plantas completas a partir de ellos, siendo esto la principal limitante
para la transformación genética. En cuanto a la introducción de ADN extraño en
protoplastos, ésta puede hacerse de diferentes maneras. La más sencilla es aquella
que utiliza tratamientos químicos para introducir el ADN y que es un derivado de las
técnicas antes desarrolladas para la transformación de bacterias y células animales.
El método más común es el que se basa en un tratamiento con polietilenglicol que
altera las propiedades de la membrana causando una permeabilización reversible que
permite la entrada del ADN mediante un mecanismo aun desconocido (Maas y Werr
1989, Songstad et al. 1995). Este sistema de transformación se ha utilizado con éxito
en algunas especies, pero actualmente es poco utilizado debido a la aparición de
sistemas más eficientes y a la dificultad para trabajar con protoplastos. Otro método
para la transformación de protoplastos es la electroporación, basado en una
permeabilización reversible de la membrana causada por la aplicación de un impulso
eléctrico muy fuerte y de muy corta duración. Esta técnica es por lo general más
eficiente que la primera, pero al igual que ésta tiene la desventaja de que la expresión
de los genes introducidos suele ser transitoria ya que la frecuencia de integración al
genoma es muy baja (Songstad et al. 1995). Un tercer método, más complicado que
los anteriores para la introducción de ADN a protoplastos, es la microinyección, con el
cual aunque hay algunos reportes de éxito, se ha trabajado muy poco debido a las
dificultades que implica (Aly y Owens 1987).

B. Transformación mediante bombardeo con microproyectiles o biobalística

Esta técnica se basa en bombardear al tejido vegetal con microproyectiles de

oro o de tungsteno cubiertos con el ADN a introducir y acelerados a alta velocidad de
tal manera que penetren la pared celular y eventualmente lleguen al núcleo, todo esto

126
sin llegar a matar a la célula bombardeada. El primer sistema de bombardeo surgió en
1987 y utilizaba un cartucho de pistola calibre 22 para acelerar partículas de tungsteno
cubiertas con ADN (Klein et al. 1987). Un año después se utilizo esta técnica para la
transformación genética en tabaco (Klein et al. 1988) y posteriormente en células de
maíz (Klein et al. 1989). Una de las mayores ventajas de este sistema es que no está
restringido a un rango de hospederos naturales como Agrobacterium, por lo que con
su uso fue posible la transformación de monocotiledoneas como el maíz. Actualmente
se han desarrollado sistemas de bombardeo que difieren del primer modelo y que
resultan más adecuados. Primeramente se han reemplazado los gases producto de la
combustión de la pólvora por helio a alta presión como sistema para acelerar las
partículas (Russell-Kikkert 1993). Por otro lado, existe otro tipo de diseño basado en
el mecanismo de un rifle de aire que tiene la ventaja de ser de bajo costo y ha
demostrado ser eficiente en la transformación de gramíneas (Oard 1993). Por último,
una tercera modificación consiste en la utilización de una corriente de helio para la
introducción del ADN mediante la acción de un solenoide y una serie de válvulas que
regulan el flujo (Vain et al. 1993).

C. Métodos alternativos para la transformación de plantas

Además de los métodos antes mencionados, que son sin duda los más
utilizados, existen algunos sistemas alternativos que si bien se han utilizado menos,
resultan interesantes. El primero de ellos es la transformación mediante el uso de fibras
de carburo de silicona. El método es muy sencillo y consiste en agitar en vortex una
mezcla del ADN a introducir, fibras de carburo de silicona y las células vegetales a
transformar. Durante la agitación, las fibras causan heridas en las células por las
cuales se introduce el ADN. Se trata en apariencia de un sistema sencillo y poco
costoso que esta aun en fase de desarrollo (Kaeppler et al. 1990, Songstad et al. 1995).
Otra forma sencilla de introducir ADN en células vegetales podría ser la ultrasonicación
de tejidos inmersos en un amortiguador que contenga los plásmidos a introducir.
Zhang y col. (1991) afirman haber obtenido una frecuencia de transformación de 22%
utilizando este método con segmentos de hoja de tabaco. Otro sistema de
transformación interesante es la electroporación no de protoplastos, sino de células o
tejidos intactos como por ejemplo polen, segmentos de hoja, embriones y tejido
calloso. Hay varias publicaciones que se refieren a este sistema pero solo tres en
donde se obtiene transformación estable. La primera es la de Li et al. (1991) quienes
obtuvieron plantas transgénicas de arroz electroporando embriones, la segunda de
D’Halluin et al (1992) quienes produjeron plantas transgénicas de maíz mediante el
mismo proceso, y la tercera de Chowria et al. (1993) quienes obtuvieron plantas de
Pisum sativum y Lens culinaris genéticamente transformadas después de electroporar
yemas laterales. Otro método de transformación alternativo es la introducción de ADN
en los tejidos mediante electroforesis desarrollado por Ahokas (1989), el cual no se ha
extendido a pesar de que hay algunos reportes que confirman su éxito.

De todos los métodos mencionados, sin duda los más utilizados son la
transformación con Agrobacterium y el bombardeo con partículas. Uno de los factores
que limitan la aplicación de ambos sistemas es la necesidad de regenerar el tejido
transformado mediante organogénesis o embriogénesis somática, lo cual con algunas

127
especies es al menos hasta el momento muy difícil. Una alternativa es la
transformación de meristemos, los cuales resultan sencillos de regenerar en
prácticamente todas las especies. La principal desventaja es la producción de
quimeras debido a que las plantas formadas no tienen un origen unicelular.
Recientemente ha habido reportes exitosos de producción de plantas transgénicas
mediante la transformación de meristemos de maíz después de la infección con
Agrobacterium (Gould et al. 1991) y de caña de azúcar mediante bombardeo con
microproyectiles (Gambley et al. 1993).

Como se ha visto, es posible mediante el uso de diferentes estrategias la

introducción de genes extraños en el genoma de una planta y la regeneración de
plantas completas que expresen y sean capaces de transmitir a la progenie las
características adquiridas. Para el desarrollo de los sistemas de transformación suelen
utilizarse, como se mencionó antes, los llamados genes marcadores y/o reporteros que
permitan detectar de una manera sencilla el evento de transformación. Sin embargo,
cuando se habla de aplicaciones prácticas de esta tecnología, es necesario buscar
genes que confieran características deseables y hagan más productivo un cultivo. Para
el caso de los frutales, que son el motivo de este trabajo, las características que se
podrían manipular mediante la transformación genética son las siguientes:

1. Resistencia a virus. Actualmente una de las aplicaciones más estudiadas de la

Ingeniería Genética de Plantas es la generación de plantas transgénicas resistentes
a virus, para lo cual existen varias estrategias, algunas ya probadas y otras más
bajo estudio. Sin duda, el sistema que ha dado mejores resultados hasta el
momento es la protección cruzada por Ingeniería Genética, basada en la inserción
en el genoma de la planta del gen que codifica para la proteína de la cápside del
virus contra el que se desea dar protección. Con esta metodología se han logrado
obtener plantas resistentes a virus fitopatógenos como TMV, AIMV, TSV, CMV y
PVX (Hemenway et al. 1989).

2. Resistencia a insectos. Bacillus thuringiensis es una bacteria del suelo que produce
una proteína insecticida que ha sido utilizada por muchos años como un pesticida
biológico seguro contra varias plagas de insectos. Con el desarrollo de la Ingeniería
Genética de Plantas fue posible aislar e insertar en el genoma de diferentes plantas
este tipo de proteínas insecticidas dando como resultado plantas resistentes en
mayor o menor medida al ataque de ciertos grupos de insectos, lo cual es sin duda
alguna una característica agronómica de gran valor (Vaeck et al. 1989). Por otro
lado, se ha explorado también la posibilidad de utilizar algunas proteínas inhibidoras
de proteasas y amilasas presentes en algunas semillas para conferir resistencia
contra el ataque de insectos.

3. Resistencia a hongos. Otra posibilidad que ofrece la manipulación genética en

plantas es el conferir resistencia ante el ataque de hongos; para esto se ha visto la
posibilidad de utilizar genes como el de la quitinasa o la glucano endo-1,3--
glucosidasa, cuyos productos actúan sobre las paredes celulares de los hongos.
Por otro lado, está la posibilidad de la manipulación de la síntesis de fitoalexinas,

128
 aunque esto puede ser más complicado debido al número de genes implicados (
Weising et al. 1988).

4. Resistencia a herbicidas. Actualmente se encuentra muy extendido el uso de

herbicidas en el control de las malezas que compiten con las plantas cultivadas; sin
embargo, estos pesticidas suelen dañar también en mayor o menor medida a estas
últimas. Una de las aplicaciones más explotadas de la Ingeniería Genética de
Plantas lo ha sido sin duda la inserción de genes que confieren resistencia a
herbicidas, lo cual permitirá al agricultor un mejor sistema para el control de malezas
sin dañar con esto al cultivo. En este sentido, se han generado plantas resistentes
y/o se han estudiado los mecanismos de resistencia a glifosato, sulfonilureas,
imidazolinonas, fosfinotricina, bromoxinilo y triazina (Padgette et al. 1989).

5. Cambios en la calidad y fisiología de maduración del fruto. La calidad nutricional de

los frutos o semillas, es otra propiedad que puede ser modificada mediante
Ingeniería Genética. En este caso la estrategia más obvia es la inserción de genes
que codifican para proteínas de alto valor nutritivo y que puedan compensar de
algún modo las deficiencias en cuanto aminoácidos esenciales de la planta en
cuestión. Otras características también pueden ser manipuladas, como por ejemplo
el contenido y balance de ácidos grasos o azúcares. Otro aspecto de gran interés
es la manipulación de la fisiología de maduración del fruto que puede lograrse
alterando las vías metabólicas del etileno o bien las enzimas involucradas en
procesos asociados como por ejemplo las que tienen que ver con el ablandamiento
del fruto. La finalidad de alterar esta fisiología de la maduración es evitar las inmensa
pérdidas causadas por la sobremaduración de los frutos.

6. Tamaño, forma y arquitectura de la planta. En el caso de los frutales, el tamaño,

forma y arquitectura general de la planta son características de una enorme
importancia para la producción. De manera tradicional, estas características se han
controlado hasta cierto punto mediante las podas y el uso de patrones definidos
para los injertos. Sin embargo, se ha visto que hay genes como los iaaH e iaaM de
Agrobacterium tumefaciens que son capaces de modificar el balance hormonal en
los tejidos, y por lo tanto, podrían ser utilizados para cambiar el hábito de crecimiento
de las plantas. Ya se han aislado genes de este tipo y se ha demostrado que son
capaces de modificar la morfología de plantas transformadas con ellos (Smigock y
Owens 1989). Los genes rol B y rol C de Agrobacterium rhizogenes se han
estudiado también como posibles candidatos para ser aplicados en la manipulación
de la arquitectura de la planta (Schmulling et al. 1988) e incluso ya se han utilizado
para incrementar la habilidad de enraizamiento en Actinidia deliciosa (Rugini et al.
1991). La figura 26 muestra el efecto de la inserción de los genes rol en plantas
transgénicas de limón mexicano.. Además de los genes anteriores, de origen
bacteriano, ya se han identificado en las propias plantas algunos genes que
controlan ciertos hábitos de crecimiento; por ejemplo, el gen dw que confiere el
fenotipo enano en algunos frutales (Hanche 1986). Otra posibilidad la constituye la
manipulación de los genes que codifican para los fitocromos vegetales. Por ejemplo,
la expresión del gen phyA de una monocotiledonea en una dicotiledonea, produce
un cambio notable en el fenotipo de ésta. Se reduce la longitud de los entrenudos,

129
 y por tanto, la altura de la planta; se incrementa la concentración de clorofila,
produciendo hojas de color verde más obscuro; se reduce la dominancia apical
produciéndose plantas más ramificadas y se retarda la senescencia de las hojas.
Este fenotipo se puede interpretar como una exageración del fenotipo que adquieren
las plantas que reciben una mayor cantidad de luz con respecto al de las que crecen
en la sombra (McCown 1997).

7. Control del período juvenil. Una de las dificultades más grandes que enfrenta el
cultivo de frutales es el largo período juvenil, que puede llegar a varios años, durante
el cual la producción es nula. Una de las líneas de investigación más interesantes
en lo referente a la manipulación genética de estas plantas será el estudio y
manipulación de los genes que controlan la duración de esta fase del crecimiento.
Por desgracia hay muy pocas investigaciones en este campo, pero ya se ha
identificado un gen presuntamente implicado con el control del período juvenil en
durazno (Hanche 1986).

8. Alteración del metabolismo respiratorio. La alteración del metabolismo respiratorio

de una planta puede afectar notablemente muchas de sus características así como
su productividad. Holmberg y col. (1997) encontraron que plantas transgénicas de
tabaco que expresan el gen de la hemoglobina de Vitreoscilla (VHb) muestran una
tasa de crecimiento 80-100% mayor que las plantas control. Además, el tiempo
requerido para la germinación y para completar el ciclo de vida hasta llegar a
floración se reduce significativamente. Asimismo, las plantas transgénicas tienen un
contenido 30-40% mayor de clorofila y 34% mayor de nicotina con respecto a los
controles. La expresión de la VHb también ocasionó una distribución alterada de los
metabolitos secundarios en las plantas transformadas.

9. Alteración de la resistencia al estrés ambiental. El estrés ambiental es sin duda uno

de los factores que más limitan la producción agrícola. Recientemente se ha
vislumbrado la posibilidad de alterar la resistencia al estrés ambiental de las plantas
cultivadas mediante la inserción de genes específicos. Por ejemplo, Roxas et al.
(1997) encontraron que la sobreexpresión en plántulas de tabaco de una enzima
con actividad de glutatión S-transferasa y glutatión peroxidasa incrementa
significativamente su resistencia tanto a las heladas como al exceso de sales. Este
fenómeno lo atribuyen al incremento en la tasa de oxidación del glutatión durante el
estrés.

130
 a

b
Figura 26. Cambios en la arquitectura de plantas de limón mexicano (Citrus
aurantifolia) transformadas con los genes rol de una cepa silvestre de Agrobacterium
rhizogenes. a. Izquierda; planta con una arquitectura aparentemente normal, centro y
derecha; plantas con una dominancia apical reducida. b. Planta con una hipertrofia del
sistema radical.

131
 18. ANALISIS DE RESULTADOS EN EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

Para poder conocer y manipular las respuestas al cultivo in vitro de cierta

especie o tejido vegetal es indispensable diseñar de manera adecuada los
experimentos necesarios, así como interpretar de una manera correcta los resultados
de los mismos. La estadística es una herramienta muy importante en el cultivo de
tejidos vegetales, ya que nos permite una interpretación más precisa y objetiva de los
datos experimentales y una planeación más adecuada de los experimentos requeridos
para obtener la información deseada. En general, las aplicaciones de la estadística en
el CTV y en las Ciencias Biológicas son las siguientes:

A. Permite estudiar la variación que se presenta dentro de una población de seres

vivos.
B. Permite la caracterización de poblaciones mediante el estudio de pequeñas
muestras obtenidas a partir de ellas.
C. Permite comparar dos o más poblaciones o muestras.
D. Permite comparar las respuestas de poblaciones o muestras ante distintos
tratamientos. Esta es una de las aplicaciones más utilizadas en el caso del cultivo
de tejidos vegetales.
E. La estadística permite determinar la relación entre una o más variables.
F. Por último, la estadística ofrece métodos para reducir las fuentes de error en la
recolección de datos.

Actualmente, el uso de paquetes de “software” facilita la aplicación de métodos

estadísticos relativamente complicados sin necesidad de comprender a fondo los
procesos matemáticos requeridos para llegar al resultado final. Sin embargo, es muy
importante tener el conocimiento para saber en qué momento aplicar cada uno de los
diferentes métodos, las limitaciones del mismo y la interpretación correcta del resultado
obtenido. Por supuesto, la elección del método estadístico para el análisis de los datos
debe hacerse al momento de diseñar el experimento y no una vez obtenidos los
resultados del mismo.

El diseño correcto de un experimento se basa en tres principios básicos, que son la

reproducción, la aleatorización y el control local.

Reproducción. Se refiere al número de repeticiones a utilizar, es decir, al número de

veces que se repite un mismo tratamiento en las unidades experimentales. Se le
denomina unidad experimental a la menor subdivisión del material experimental que
puede recibir un tratamiento diferente. En los experimentos que se realizan en el área
del cultivo de tejidos vegetales, una unidad experimental puede ser un explante o un
recipiente de cultivo, en el caso en que se trabaje con cultivos en suspensión, por
ejemplo. Siempre que se trabaje con al menos dos unidades experimentales a las que
se aplica un solo tratamiento, es muy probable que se obtengan por lo menos dos
resultados diferentes. La diferencia entre la respuesta a un mismo tratamiento de dos
o más unidades experimentales genera el error experimental. Un buen diseño

132
 experimental debe tender siempre a minimizar este tipo de error, aunque la naturaleza
misma del trabajo con entes biológicos hace imposible su eliminación total. La elección
correcta del tamaño de las unidades experimentales, el manejo uniforme de las
mismas y el utilizar un número adecuado de repeticiones ayudan a minimizar el error
experimental.

Aleatorización. La aleatorización se refiere a la manera en que se asignan los diferentes

tratamientos a las diferentes unidades experimentales. Para que el diseño
experimental sea confiable, esta asignación debe ser hecha al azar.

Control local. Involucra el balanceo, bloqueo y agrupamiento de las unidades

experimentales. El balanceo es la manera de asignar el número de repeticiones a cada
tratamiento. La utilización de diseños balanceados (el mismo número de repeticiones
para cada tratamiento) facilita el análisis estadístico de los resultados y siempre debe
ser preferido. Sin embargo en el caso del cultivo de tejidos vegetales, es muy frecuente
la pérdida de unidades experimentales a causa de la contaminación microbiana, por lo
que aunque frecuentemente se parta de un diseño balanceado, finalmente se termina
por hacer el análisis de los datos con uno no balanceado. El bloqueo se refiere a la
distribución en bloques de los diferentes tipos de unidades experimentales en el caso
de que éstas no sean homogéneas. Las unidades dentro de cada bloque sí deben ser
homogéneas. Por último, el agrupamiento es la distribución en grupos del total de
unidades experimentales. Cada uno de estos grupos recibirá un tratamiento diferente.

El diseño experimental más utilizado en el cultivo de tejidos vegetales es el

completamente al azar. En éste, los diferentes tratamientos son asignados
aleatoriamente a todas las unidades experimentales. El requisito para trabajar con este
diseño es que las unidades experimentales sean homogéneas. Las ventajas del diseño
completamente al azar son: el análisis de los datos es más simple, pueden utilizarse
diseños no balanceados, el número de repeticiones esta limitado únicamente por el
número de unidades experimentales disponibles y hay una cierta tolerancia a la
pérdida de datos. La manera de analizar estadísticamente los datos de un experimento
de este tipo es el análisis de varianza (ANDEVA). En éste se prueba una hipótesis nula
(Ho) que postula que el efecto de todos los tratamientos es igual, contra una hipótesis
alternativa (Ha) que postula que al menos uno de los tratamientos es estadísticamente
diferente al resto de ellos. El proceso matemático para obtener el resultado es
laborioso, pero el análisis hecho por computadora es muy sencillo. El resultado final
da un valor de F que nos permite aceptar o rechazar la hipótesis nula. Si en el ANDEVA
se rechaza la hipótesis nula, esto nos dice únicamente que estadísticamente al menos
uno de los tratamientos es diferente, pero no nos da ningún dato sobre la relación entre
los tratamientos. Para comparar los tratamientos unos con otros, se utilizan pruebas
complementarias como la diferencia mínima significativa (DMS), la prueba de Duncan
y la prueba de Tukey las cuales son sencillas y pueden ser consultadas en cualquier
texto de estadística. Algunos ejemplos típicos de la aplicación del diseño
completamente al azar en el cultivo de tejidos vegetales son:

 Se desea conocer el efecto de seis diferentes niveles de BA sobre el número de

brotes producidos por segmentos nodales de clavel.

133
 Se prueban seis medios básales con una concentración fija de IBA con el fin de
determinar cuál de ellos promueve una mayor formación de raíces en segmentos
de tallo de durazno.

En estos casos, los explantes son homogéneos. El ANDEVA nos indicaría si

hay al menos un tratamiento diferente, y la DMS u otra prueba similar, cual de ellos es
el mejor y cuales son iguales o diferentes entre sí. Las fuentes de variación son
únicamente los tratamientos y el error experimental.

Cuando se tienen unidades experimentales que no son homogéneas, se debe

recurrir a otro tipo de diseño, que es el llamado de bloques al azar. Para ello se deben
reunir entre sí las unidades experimentales parecidas para formar con ellas grupos
llamados bloques. Luego, los tratamientos deben asignarse al azar dentro de cada
bloque. En este diseño las fuentes de variación son los tratamientos, los bloques y el
error experimental. El ANDEVA nos indica si hay efecto entre los diferentes
tratamientos y los diferentes bloques. Un ejemplo de un experimento de bloques al
azar sería el siguiente: se desea probar el efecto de seis combinaciones de BA e IAA
en la producción de brotes adventicios en hoja, cotiledón e hipocotilo de jitomate. En
este caso, primeramente se forman los bloques, uno con cada tipo de explante, y luego
se asignan al azar los seis tratamientos dentro de cada bloque.

Cuando se desea probar la posible interacción entre dos o más factores, debe
recurrirse a un experimento de tipo factorial, que puede realizarse sobre un diseño
completamente al azar o sobre uno de bloques al azar. Por ejemplo, se desea conocer
el efecto de cuatro auxinas y tres temperaturas de incubación en el enraizamiento de
segmentos de tallo de manzano. El diseño debe probar el efecto de las auxinas, el
efecto de las temperaturas y la posible interacción entre las diferentes auxinas con las
temperaturas de incubación. este sería un experimento factorial con diseño
completamente al azar. Suponiendo que en ese mismo ejemplo se quisieran probar al
mismo tiempo tres variedades de manzano, se podría tratar entonces de un
experimento factorial con diseño de bloques al azar, siempre y cuando se formara un
bloque con cada variedad. El análisis de este tipo de experimentos suele resultar más
complicado y se sugiere evitarlos substituyéndolos de ser posible por una serie de
experimentos más sencillos.

En ocasiones lo que se desea evaluar es la posible relación entre una o más

variables dependientes con una sola variable independiente. Por ejemplo, el aumento
de biomasa y la producción de pigmentos (variables dependientes) en tejido calloso,
en relación con los niveles de auxina (variable independiente) en el medio de cultivo.
En este caso se utiliza el procedimiento estadístico conocido como regresión. La
regresión puede ser lineal o no lineal dependiendo de la relación entre las variables y
puede ser simple o compuesta dependiendo del número de variables que se prueban.

En algunas situaciones los resultados obtenidos en un experimento de cultivo

de tejidos vegetales no pueden ser expresados en forma numérica. Por ejemplo,
cuando solo se evalúa la presencia o ausencia de raíz, presencia o ausencia de
pigmentos. Para este caso existen métodos de estadística no paramétrica, pero su

134
utilidad y precisión no es tan alta como la de los métodos paramétricos, por lo que su
utilización o no depende del criterio del investigador.

Por último, no es recomendable subestimar la importancia de la llamada

estadística descriptiva, la cual es de mucho valor en el momento de presentar los
resultados de un experimento de una forma gráfica fácilmente comprensible.

135
 BIBLIOGRAFIA:

 Ahokas, H. 1989. Transfection of germinating barley seed electrophoretically with

exogenous DNA. Theoretical and Applied Genetics 77:469-472.
 Aly, M.A.M., Owens, L.D. 1987. A simple system for plant cell microinyection and
culture. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 10:159-174.
 Ammirato, P.V., Evans, D.R., Sharp, W.R., Bajaj, Y.P.S. 1990. Handbook of plant
cell culture. Volume 5. Ornamental species. McGraw Hill. New York.
 Benzion, G., Phillips, R.L., Rines, H.W. 1986. Case histories of genetic variability in
vitro: Oats and maize. In: Vasil, I.K. (ed.). Cell Culture and Somatic Cell Genetics of
Plants. Vol. 3. Plant Regeneration and Genetic Variability. Academic Press Inc.
Orlando. pp. 435-448.
 Bevan, M.W., Flavell, R.B., Chilton, M.D. 1983. A chimeric antibiotic resistance gene
as a selectable marker for plant cell transformation. Nature 304:184-187.
 Cassells, A.C. 1991. Problems in Tissue Culture: Contamination. In: Debergh, P.C.,
Zimmerman, R.H. (Eds). Micropropagation: Technology and application. Kluwer
Academic Publishers. Boston. pp. 31-44.
 Cheung, A.L., Bogorad, L., Montagu, M., Schell, J. 1988. Relocating a gene for
herbicide tolerance: A chloroplast gene is converted into a nuclear gene.
Proceedings of the National Academy of Science. USA. 85:391-395.
 Chowria, G., Akelle, V., Lurquin, P.F. 1993. Transformation of peas and lentils by in
vivo electroporation of nodal meristems. Western Society of Crop Science Abstracts.
p.2.
 Constabel F. 1987. Cell culture in phytochemistry. In: Constabel, F., Vasil, I.K. (Eds).
Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. Vol. 4. Cell Culture in
Phytochemistry. Academic Press Inc. San Diego. pp. 3-13.
 Chu, C.C. 1978. The N6 medium and its applications to anther culture of cereal
crops. In: Proc Symp Plant Tissue Culture. Science Press, Beijing, pp. 43-50.
 Croughan, T.P. 1995. Anther culture for doubled haploid production. In: Gamborg,
O.L., Phillips, G.C. (Eds). Plant Cell, Tissue and Organ Culture. Springer. Berlin. pp.
143-154.
 Davies, P.J. 1995. The Plant Hormones: Their Nature, Accurrence, and functions.
In: Davies, P.J. (Ed). Plant Hormones. Physiology, Biochemistry and Molecular
Biology. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht. pp. 1-11.
 Debergh, P.C., Zimmerman, R.H. 1991. Micropropagation: Technology and
application. Kluwer Academic Publishers. Boston. 484 pp.
 D’Haullin, K., Bonne, E., Bossut, M., De Beuckeleer, M., Leemans, J. 1992.
Transgenic maize plants by tissue electroporation. Plant Cell 4:1495-1505.
 Dixon, R.A. 1985. Plant cell culture. A practical approach. IRL Press. Oxford.
 Dodds, J.H. 1991. In vitro methods for conservation of plant genetic resources.
Chapman and Hall. London.
 Driver, J.A., Kuniyuki, A.H. 1984. In vitro propagation of Paradox walnut rootstocks.
HortScience 19:507.
 Endress, R. 1994. Plant Cell Biotechnology. Springer-Verlag, Berlin. 353 pp.

136
 Evans, N.E. 1990. Micropropagation: Axillary bud multiplication. In: Pollard, J.F.,
Walker, J.M. (eds.). Methods in Molecular Biology. Vol. 6. Plant Cell and Tissue
Culture. The Humana Press. pp. 93-104.
 Gambley, R.L., Ford, R., Smith, G.R. 1993. Microprojectile transformation of
sugarcane meristems and regeneration of shoots expressing -glucuronidase. Plant
Cell Reports 12:343-346.
 Gamborg, O.L., Miller, R.A., Ojima, K. 1968. Nutrient requirements of suspension
cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50:151-158.
 Gamborg, O.L., Shyluk, J.P. 1981. Nutrition, media and characteristics of plant cell
and tissue cultures. In: Thorpe, T.A. (Ed). Plant Tissue Culture, Academic Press,
New York. pp. 21-44.
 Gamborg, O.L., Phillips, G.C. 1995. Media Preparation and Handling. In: Gamborg,
O.L., Phillips, G.C. (Eds). Plant Cell, Tissue and Organ Culture. Fundamental
Methods. Springer, Berlin. pp. 21-34.
 Gaspar, T., Kevers, C., Penel, C., Greppin, H., Reid, D.M., Thorpe, T.a. 1996. Plant
Hormones and Plant Growth Regulators in Plant Tissue Culture. In Vitro Cell. Dev.
Biol.-Plant 32:272-289.
 Gould, A.R. 1986. Factors controlling generation of variability in vitro. In: Vasil, I.K.
(ed.). Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. Vol. 3. Plant Regeneration
and Genetic Variability. Academic Press Inc. Orlando. pp. 549-567.
 Gould, J., Devey, M., Hasegawa, O., Ulian, E.C., Peterson, G., Smith, R. 1991.
Transformation of Zea mays L. using Agrobacterium tumefaciens and shoot apex.
Plant Physiology 95:426-434.
 Gronenborn, B., Matzeit, V. 1989. Plant gene vectors and genetic transformation:
Plant viruses as vectors. In. Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. Vol.
6. Molecular Biology of Plant Nuclear Genes. Schell, J., Vasil, I.K. (Eds.). Academic
Press. San Diego pp 69-101.
 Grout, B.W.W. 1990. Meristem tip culture. In: Pollard, J.F., Walker, J.M. (eds.).
Methods in Molecular Biology. Vol. 6. Plant Cell and Tissue Culture. The Humana
Press. pp. 81-91.
 Grout, B.W.W. 1995. Minimal Growth Storage. In: Grout, B.W.W. (Ed.). Genetic
Preservation of Plant Cells in vitro. Springer-Verlag, Berlin. pp. 21-27.
 Grout, B.W.W. 1995b. Introduction to the in vitro Preservation of Plant Cells, Tissues
and Organs. In: Grout, B.W.W. (Ed.). Genetic Preservation of Plant Cells in vitro.
Springer-Verlag, Berlin. pp. 1-20.
 Halperin, W. 1986. Attainment and Retention of Morphogenetic Capacity in vitro. In:
Vasil, I.K. (ed.). Cell culture and somatic cell genetics of plants. Vol. 3. Plant
regeneration and genetic variability. Academic Press. Orlando. pp. 3-48.
 Hammerschlag, F.A., Litz, R.E. 1992. Biotechnology of perennial fruit crops. C.A.B.
International. Cambridge.
 Hanche, P.E. 1986. Heredability of juvenility in peach. Journal of Horticultural
Science 21:1197-1198.
 Hanche, P.E. 1986. Heredability of fruit quality traits in peach and nectarine breeding
stocks dwarfed by the dw gene. Journal of Horticultural Science 21:1193-1195.
 Haseloff, J., Amos, B. 1995. GFP in plants. Trends in Genetics 11:328-329.

137
 Hayford, M.B., Medford, J.L., Hoffman, N.L., Rogers, S.G., Klee, H.J. 1988.
Development of a plant transformation selection system based on expression of
genes encoding gentamycin acetyltransferase. Plant Physiology 86:1216-1222.
 Hemenway, C., Tumer, N.E., Powell, P.A., Beachy, R.N. 1989. Genetic engineering
of plants for viral disease resistance. In. Cell Culture and Somatic Cell Genetics of
Plants. Vol. 6. Molecular Biology of Plant Nuclear Genes. Schell, J., Vasil, I.K. (Eds.).
Academic Press. San Diego. pp. 406-424.
 Herrera-Estrella, L., Jofre y Garfias, A., Argüello-Astorga, G., Simpson, J. 1997.
Transformación genética de plantas. Avance y Perspectiva 16:67-73.
 Hicks, G.S. 1994. Shoot induction and organogenesis in vitro: A developmental
perspective. In Vitro Cell Dev. Biol. 30:10-15.
 Holmberg, N., Lilius, G., Bailey, J.E., Bülow, L. 1997. Transgenic tobacco expressing
Vitreoscilla hemoglobin exhibits enhanced growth and altered metabolite production.
Nature Biotechnology 15:244-247.
 Hurtado, M.D.V., Merino, M.M.E. 1987. Cultivo de tejidos vegetales. Ed. Trillas.
México. 232 pp.
 Jefferson, R.A., Kavanagh, T.A., Bevan, M.W. 1987. GUS fusions: -glucuronidase
as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO Journal
6:3901-3907.
 Jones, J.D.G.,Svab, Z., Harper, E.C., Hurwitz, C.D., Maliga, P. 1987. A dominant
nuclear streptomycin resistant marker for plant cell transformation. Mol. Gen. Genet.
210:86-91.
 Kiran, K.S., Thorpe, T.A. 1995. Asexual embryogenesis in vascular plants in nature.
In: Thorpr, T.A. (ed.). In Vitro Embryogenesis in Plants. Kluwer Academic Publishers.
Dordrecht. pp. 17-72.
 Klee, H.J., Rogers, S.G. 1989. Plant gene vectors and genetic transformation: Plant
transformation systems based on the use of Agrobacterium tumefaciens. In. Cell
Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. Vol. 6. Molecular Biology of Plant
Nuclear Genes. Schell, J., Vasil, I.K. (Eds.). Academic Press. San Diego pp. 2-25.
 Klein, T.M., Wolf, E.D., Wu, R., Sandford, J.C. 1987. High-velocity microprojectiles
for delivering nucleic acids into living cells. Nature 327:70-73.
 Klein, T.M., Harper, E.C., Svab, Z., Sandford, J.C., Froom, M.E., Maliga, P. 1988.
Stable genetic transformation of intact Nicotiana cells by the particle bombardment
process. Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8502-8505.
 Klein, T.M., Kornstein, L., Sandford, J.C., Fromm, M.E. 1989. Genetic transformation
of maize cells by particle bombardment. Plant Physiol. 91:440-444.
 Kyte, L. 1987. Plants from test tubes. An introduction to micropropagation. Timber
Press. Portland. 160 pp.
 Larkin, P.J. 1986. Case histories of genetic variability in vitro: Wheat and triticale. In:
Vasil, I.K. (ed.). Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. Vol. 3. Plant
Regeneration and Genetic Variability. Academic Press Inc. Orlando. pp. 367-383.
 Leifert, C., Morris, C.E., Waites, W.M. 1994. Ecology of microbial saprophytes and
pathogens in tissue culture and field grown plants: Reasons for contamination
problems in vitro. Critical Reviews in Plant Sciences. 13:139-183.
 Leifert, C., Murphy, K.P., Lumdsen, P.J. 1995. Mineral and carbohidrate nutrition of
plant cell and tissue cultures. Critical Reviews in Plant Sciences. 14:83-109.

138
 Li, B.J., Xu, X.P., Shi, H.P., Ke, X.Y. 1991. Introduction of foreign genes into the
seed embryo cells of rice by electro-injection and the regeneration of transgenic rice
plants. Scientia China 34:923-930.
 Linsmaier, E.M., Skoog, F. 1965. Organic growth factor requirements of tobacco
tissue cultures. Physiol. Plant. 18:100-127.
 Lloyd, G., McCown, B. 1980. Commercially feasible micropropagation of mountain
laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot tip culture. Comb Proc Int Plant Prop Soc
30:421-427.
 Lyon, B.R., LLewellyn, D.J., Huppatz, J.L., Dennis, E.S., Peacock, W.J. 1989.
Expression of a bacterial gene in transgenic tobacco plants confers resistance to the
herbicide 2,4-dichlorophenoxyacetic acid. Plant Molecular Biology 13:533-540.
 Maas, C., Werr, W. 1989. Mechanism and optimized conditions for PEG mediated
DNA transfection into plant protoplasts. Plant Cell Reports 8:148-151.
 McCown, B.H. 1997. Biotechnological approaches to modifying plant form. In:
Biotechnology of Ornamental Plants. Geneve, R.L., Preece, J.E., Merkle, S.A.
(Eds.). CAB INTERNATIONAL. Wallingford pp. 199-213.
 Merkle, S.A., Parrot, W.A., Flinn, B.S. 1995. Morphogenic aspects of somatic
embryogenesis. In: Thorpr, T.A. (ed.). In Vitro Embryogenesis in Plants. Kluwer
Academic Publishers. Dordrecht. pp. 155-203.
 Murashige, T., Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays
with tobacco cultures. Physiol. Plant. 15:473.
 Niedz, R.P., Sussman, M.R., Satterlee, J.S. 1995. Green fluorescent protein: an in
vivo reporter of plant gene expression. Plant Cell Reports 14:403-406.
 Nitsch, J.P., Nitsch, C. 1969. Haploid plants from pollen grains. Science. 163:85-87.
 Oard, J. 1993. Development of an airgun device for particle bombardment. Plant
Cell, Tissue and Organ Culture 33:247-250.
 Padgette, S.R., Della-Cioppa, G., Shah, D.M., Fraley, R.T., Kishore, G.M. 1989.
Selective herbicide tolerance through protein engineering. In. Cell Culture and
Somatic Cell Genetics of Plants. Vol. 6. Molecular Biology of Plant Nuclear Genes.
Schell, J., Vasil, I.K (Eds.). Academic Press. San Diego. pp. 442-476.
 Parkinson, M., O´Neill, C.M., Dix, P.J. 1990. Grafting In Vitro. In: Pollard, J.F.,
Walker, J.M. (eds.). Methods in Molecular Biology. Vol. 6. Plant Cell and Tissue
Culture. The Humana Press. pp. 105-112.
 Pollard, J.W., Walker, J.M. 1990. Plant cell and tissue culture. Methods in Molecular
Biology 6. Humana Press. New Jersey. 597 pp.
 Prasher, D.C. 1995. Using GFP to see the light. Trends in Genetics 11:320-323.
 Roxas, V.P., Smith, R.K., Allen, E.R., Allen, R.D. 1997. Overexpression of
glutathione S-transferase/glutathione peroxidase enhances the growth of transgenic
tobacco seddlings during stress. Nature Biotechnology 15:988-991.
 Rugini, E., Pellegrineschi, A., Mencuccini, M., Mariotti, D. 1991. Increase of rooting
ability in the woody species kiwi (Actinidia deliciosa) by transformation with
Agrobacterium rhizogenes rol genes. Plant Cell Reports. 10:291-295.
 Russell-Kikkert, J. 1993. The biolistic PDS-1000/He device. Plant Cell, Tissue and
Organ Culture 33:221-226.
 Schmulling, T., Schell, J., Spena, A. 1988. Single genes from Agrobacterium
rhizogenes influence plant development. EMBO Journal 7:2621-2629.

139
 Smigock, A.C., Owens, L.D. 1989. Citokinin-to-auxin ratios and morphology of
shoots and tissues transformed by the chimeric isopentenil transferase gene. Plant
Physiology 91:808-811.
 Songstad, D.D., Somers, D.A., Griesbach, R.J. 1995. Advances in alternative DNA
delivery techniques. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 40:1-15.
 Stalker, D.M., McBride, K.E., Malyj, L.D. 1988. Herbicide resistance in transgenic
plants expressing a bacterial detoxification gene. Science 242:419-423.
 Stepan-Sarkissian, G. 1990. Selection of Media for Tissue and Cell Culture. In:
Pollard, J.W., Walker, J.M. (Eds). Plant cell and tissue culture. Methods in Molecular
Biology 6. Humana Press. New Jersey. pp. 1-12.
 Tempe, J. 1989. Plant gene vectors and genetic transformation: Agrobacterium Ri
plasmids. In. Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. Vol. 6. Molecular
Biology of Plant Nuclear Genes. Schell, J., Vasil, I.K. (Eds.). Academic Press. San
Diego. pp. 26-51.
 Thorpe, T.A. 1981. Plant tissue culture. Methods and applications in agriculture.
Academic Press. New York. 379 pp.
 Torres, K.C. 1989. Tissue culture techniques for horticultural crops. Van Nostrand
Reinhold. New York. 285 pp.
 Vaeck, M., reynaerts, A., Hofte, H. 1989. Protein engineering in plants: Expresion of
Bacillus thuringiensis insecticidal protein genes. In. Cell Culture and Somatic Cell
Genetics in Plants. Vol. 6. Molecular Biology of Plant Nuclear Genes. Schell, J.,
Vasil, I.K. (Eds.). Academic Press. San Diego. pp. 425-441.
 Vain, P., Kleen, N., Murillo, J., Rathus, C., Nemes, C., Finer, J.J. 1993. Development
of the particle inflow gun. Plat Cell Tissue Organ Culture 33:237-246.
 van der Salm, T.P.M., Hanish ten Cate, C.H., Dons, H.J.M. 1996. Prospects for
application of rol genes for crop improvement. Plant Molecular Biology Reporter
14:207-228.
 Vasil, I.K. 1984. Cell culture and somatic cell genetics of plants. Vol. 1. Laboratory
procedures and their applications. Academic Press. Orlando.
 Vasil, I.K. 1986. Cell culture and somatic cell genetics of plants. Vol. 3. Plant
regeneration and genetic variability. Academic Press. Orlando.
 Weising, K., Schell, J., Kahl, G. 1988. Foreign genes in plants: Transfer, structure,
expression and applications. Annual Reviews in Genetics 22:421-477.
 Waldron, C., Murphy, E.B., Roberts, J.L., Gustafson, G.D., Armour, S.L., Malcom,
S.K. 1985. Resistance to hygromicin B. A new marker for plant transformation
studies. Plant Molecular Biology 5:103-108.
 Zhang, L.J., Gheng, L.M., Xu, N., Zhao, N.M., Li, , C.J., Yuan, J., Jia, S.R. 1991.
Efficient transformation of tobacco by ultrasonication. Bio/Technology 9:996-997.
 Zimmerman, R.H. 1991. Micropropagation: Technology and application. Kluwer
Academic Publishers. Boston.
 Ziv, M. 1991. Vitrification: morphological and physiological disorders of in vitro
plants. In: Debergh, P.C., Zimmerman, R.H. (Eds). Micropropagation: Technology
and application. Kluwer Academic Publishers. Boston. pp. 45-70.
 Zupan, J.R., Zambrysky, P. 1995. Transfer of T-DNA from Agrobacterium to the plant
cell. Plant Physiology 107:1041-1047.

140
 Zupan, J.R., Zambrysky, P. 1997.The Agrobacterium DNA Transfer Complex.
Critical Reviews in Plant Science 16:279-295.

141