Listado-Problemas-capitulo-7-8.

pdf

SrJoseJavier

Ingeniería Genética

4º Grado en Biología

Facultad de Ciencias
Universidad de Córdoba

Reservados todos los derechos.

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
 Ingeniería Genética Diego Becerra Mora

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
CAPÍTULOS 7-8

30.- Una cepa mutante niaD- del hongo filamentoso Aspergillus nidulans deficiente en la enzima
nitrato reductasa (requerida para la utilización del nitrato fuente de nitrógeno) se transformó con
el ADN del plásmido pSTA14 que lleva el gen de resistencia a ampicilina bacteriana y el alelo
silvestre niaD de A. nidulans. Se obtuvieron tres transformantes niaD+ (transformantes I, II y III).

a) ¿En qué medio se seleccionaron los transformantes?

En un medio suplementado con ampicilina, ya que solo las transformantes presentarán el gen de
resistencia a dicho antibiótico.

El ADN de los tres transformantes y de la cepa parental (no transformada) se analizó mediante
hibridación Southern con las dos sondas diferentes indicadas a continuación. La figura muestra las
bandas de hibridación obtenidas en los dos experimentos.

Reservados todos los derechos.

sonda: plásmido pSTA14 sonda: gen de resistencia a apicilina
ADN del parental (P) y transformantes I, II, III ADN del parental (P) y transformantes I, II, III

P I P I

P II P II II

P III P III

a) Explique el patrón de bandas de los transformantes I, II, III y el parental

b) Dibuje esquemáticamente los eventos de integración de ADN que han ocurrido en cada
transformante.

• El transformante I presenta una única banda cuando se realiza un southern-blot por lo que se ha
producido una integración del plásmido en el genoma correcta.

• El transformante II presenta 2 bandas en el southern por lo que se ha producido una integración

ectópica del ADN plasmídico y se ha producido una duplicación génica, encontrándose presentes
tanto el alelo silvestre como el mutante integrados en distintas regiones del cromosoma

a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-5974743
 Ingeniería Genética Diego Becerra Mora

• El transformante III presenta una única banda, pero esta no aparece cuando se realiza el souther para
comprobar si está presente el gen de resistencia por lo que se ha producido un doble evento de
recombinación entre regiones homólogas que flanquean al alelo silvestre.

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
31.- Los vectores de levadura YEp24 y YIp5 contienen el gen URA3, que se requiere para la
biosíntesis de Uracilo. Un fragmento de ADN genómico de levadura contiene el gen LEU2 que se
requiere para biosíntesis de Leucina. El tratamiento de este fragmento de ADN con la enzima de
restricción AvaII genera 4 fragmentos (A, B, C, D). Después de realizar una digestión parcial del
fragmento con AvaII, los fragmentos resultantes se ligan en YEp24 previamente cortado con la
misma enzima que tiene un solo sitio de corte enel vector. La mezcla de ligación se transforma en un
mutante de levadura ura3 leu2 que es auxótrofo para ambos aminoácidos. Se seleccionan colonias
Ura+ y los plásmidos presentes en estos transformantes son analizados. Todos los transformantes
que llevan los fragmentos B-C-D o A-B-C-D son Leu+, pero los portadores de los fragmentos A, B,
C, D, A-B, B-C, C-D o A-B-C son Leu-.

Reservados todos los derechos.

a) ¿Cuál de los fragmentos se requiere para la función del gen LEU2? Explíquelo

Es necesario el fragmento B-C-D para que los transformantes sean Leu+, todo lo que no sea presentar de base
estos 3 fragmentos resulta en Leu-. Si junto con estos 3 fragmentos también encontramos el fragmento A, el
transformante sigue siendo Leu+ ya que B-C-D son los necesarios.

b) Cuando la cepa de levadura receptora es solo ura3, todas las colonias transformantes son Ura+ Leu+.
¿Por qué?

Porque el gen Ura3 y Leu2 están muy cerca en el vector, incluso podrían estar continuos, haciendo que los
fragmentos recombinen a la vez, por lo que si es Ura+ también es Leu+, si presenta al menos los fragmentos B-C-
D.

c) Si en lugar del vector YEp24, se usa el vector YIp5 (también contiene un solo sitio AvaII), los
resultadosson idénticos con las siguientes excepciones:
- Cuando un mutante ura3 leu2 se transforma con YIp5-D o YIp5-C-D, algunos de los
transformantes sonUra+ Leu+ y el resto son Ura+ Leu-.
- Cuando la cepa ura3 se transforma con YIp5-C, todos los transformantes son Ura+ Leu-.
¿Cuál es la diferencia entre los vectores YEp24 y YIp5?

Esto se debe a que el único sitio de corte de AvaII presente en el vector Ylp5 se encuentra dentro del gen Leu2,
entre los fragmentos B-C o C-D. De ahí que cuando se transforma con los fragmentos D o C-D puedan originarse
Leu+

d) ¿En qué fragmento del gen LEU2 se localiza la mutación leu- en la cepa receptora? Explíquelo.

En el fragmento D, ya que cuando este se introduce únicamente en el vector la célula receptora puede ser Leu+

32.- Le gustaría hacer un mutante nulo en ratón pero no está realmente seguro de cómo hacerlo
correctamente. Decide hacer tres transgenes dirigidos diferentes, esperando que al menos uno
funcione. Usted crea los 3 transgenes que se muestran en la Figura en la página siguiente y los
transforma en células ES, luego agrega neomicina y gancyclovir. Para cada transgén, describa si
una célula vivirá o morirá si
a) el transgén no se integra

Si el transgén no se integra en ninguno de los 3 casos se integrarán ni el gen de resistencia a neomicina ni

¿No te llega para pagar Wuolah Pro? ¿Un año sin anuncios gratis? ¡Clic aquí!
a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-5974743
 Ingeniería Genética Diego Becerra Mora

el que de timidina quinasa, responsable de la conversión de gancyclovir en un metabolito toxico. Por lo

que las células en los 3 casos morirán cuando se les agrega neomicina, mientras que no morirán cuando se
les agregue ganciclovir

b) el transgén completo se integra al azar en el genoma de las células ES,

Si en los 3 casos se produce una integración completa al azar sin recombinar las regiones homólogas
todas las células van a presentar tanto el gen de resistencia de neomicina como el gen de la timidina
quinasa, por lo que todos los transformantes morirán al agregar gancyclovir.

c) la recombinación homóloga se produce correctamente.

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
En caso de las células transformadas con el transgén 1, presentaran gen de resistencia a neomicina
por lo que no morirán cuando se agregue este compuesto , pero presentan el gen de la timidina
quinasa, por lo que morirán cuando se agregue gancyclovir.

En el caso de una recombinación homóloga correcta del transgén 2 no presentaran el gen de

resistencia a neomicina por lo que cuando este se añada morirán, mientras que tampoco
presentaran el gen de la timidina quinasa por lo que la adición de gancyclovir no producirá ningún
efecto.

En el caso de una recombinación homóloga correcta con el transgén 3 las células no presentaran el
gen de resistencia a neomicina por lo que la adición de esta supondrá la muerte de las células, por
otro lado, si que presentarán el gen TK, por lo que la adición de gancyclovir también matará a las
células

Reservados todos los derechos.

33.- Su amiga decide hacer un mutante nulo de levadura en arg-4, un gen requerido para sintetizar
arginina.Ella hace una construcción para reemplazar de manera dirigida arg-4 con el gen marcador
ura-3.

a) ¿Para qué debería ser auxotrófica la cepa inicial?

Para uracilo

b) Si comienza con una cepa haploide, ¿qué seleccionará si siembra la levadura en: medio completo,
mediosin uracilo, medio sin arginina?

En un medio completo no seleccionaríamos ninguna levadura, ya que aporta tanto arginina como
uracilo.

En un medio sin uracilo seleccionaríamos levaduras que presentaran el gen ura3, es decir, que no
fuesen auxotróficas para uracilo.

En un medio sin arginina seleccionaríamos levaduras que presentaran el gen arg-4, es decir, levaduras
7

¿No te llega para pagar Wuolah Pro? ¿Un año sin anuncios gratis? ¡Clic aquí!
a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-5974743
 Ingeniería Genética Diego Becerra Mora

que no fueran auxotróficas para arginina

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
c) Si comienza con una cepa diploide, ¿qué seleccionará si siembra la levadura en: medio completo,
mediosin uracilo, medio sin arginina?

En un medio completo no seleccionaríamos ninguna levadura.

En un medio sin uracilo seleccionaríamos tanto levaduras homocigóticas para el gen ura3 como
heterocigóticas para el gen ura3.

En un medio sin arginina seleccionaríamos las levaduras tanto homocigóticas como heterocigóticas para
el gen arg-4.

d) Su amiga piensa que ha logrado hacer el mutante nulo con éxito y lo crece en medio completo,
pero quiere asegurarse de que la recombinación haya ocurrido correctamente usando la PCR. Ella
pide tres cebadores, como se muestran en la siguiente figura. Las distancias entre los cebadores A y
B, entre los cebadores B y C, la longitud del gen ura3 y la distancia entre las dos regiones de
homología son aproximadamente de 1 kb.

Reservados todos los derechos.

Para asegurarse mediante la PCR debería de aparecer una única banda, la originada entre los cebadores
que se unen al gen A y al gen C ( cebadores A y C) ya que el cebador B no se podría unir ya que se va a
eliminar el gen de la arg.4.

34.- Quiere estudiar la función de un gen esencial en ratón. ¿Cuál de los siguientes métodos elegirías?
Explíquelo.

1) Mutante nulo dirigido

No elegiría mutante nulo ya que eliminaríamos el gen y como es un gen esencial el ratón moriría sin llegar a saber
la función del gen en cuestión.

2) Silenciamiento de genes por ARNi

Permite no solo anular si no disminuir la expresión génica mediante el uso de pequeños fragmentos de ARN de
doble cadena, lo que seria de gran ayuda para ver la función de un gen que es esencial. Es un proceso rápido y es
el que utilizaría para estudiar la función de un gen esencial en ratón.

3) Edición del genoma por CRISPR Cas9

Es bastante específico, pero eliminar o alterar un gen esencial no nos ayudaría a saber su función igual que con la
realización de un mutante nulo.

4) Otros métodos (en caso afirmativo, ¿cuáles?)

Sobreexpresar el gen en otro organismo

35.- El ARN de interferencia (ARNi) es un proceso de silenciamiento génico postranscripcional

mediado por moléculas de ARN de doble cadena cortas denominadas ARN pequeños interferentes
(siRNA, en inglés). En el siguiente experimento, se usan ratones (mutantes nulos y de silenciamiento
mediante ARNi) para investigar dos proteínas relacionadas de superficie celular, designadas p24 y
p25, que se sospecha que son receptores celulares para la captación de un virus recientemente
aislado.

a. Para probar la eficacia del ARNi en células, los siRNAs específicos para las proteínas de superficie
celular p24 (siRNA-p24) y p25 (siRNA-p25) se transfectan individualmente en células de ratón
cultivadas. El ARN total se extrae de estas células transfectadas y el ARNm para las proteínas p24 y
8

a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-5974743
 Ingeniería Genética Diego Becerra Mora

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
p25 se detecta mediante hibridación Northern utilizando sondas marcadas de ADNc de p24 y p25.
El control para este experimento es una transfección sin siRNA. ¿Qué concluye de esta hibridación
Northern sobre la especificidad de los siRNAs para sus ARNm objetivo?

Se puede observar que los siARN presentan una especificidad muy alta ya que cuando se emplea el
siRNA-p24 solo se disminuye la expresión de la proteína p24 y de igual manera cuando se utiliza el
siRNA-p25 se disminuye la proteína p25 sin afectar a la proteína p2

b. A continuación, se investiga la capacidad de los siRNAs para inhibir la replicación viral. Las
células de ratón se transfectan con siRNA-p24 o siRNA-p25 o con siRNA dirigido a una proteína
esencial del virus. Un día después, las células transfectadas se inoculan con el virus. Después de un
período de incubación adicional, las células se recogen y se lisan. La cantidad de virus producidos por
cada cultivo se muestra a continuación. El control son las células transfectadas sin siRNA. ¿Qué

Reservados todos los derechos.

concluye acerca del papel de p24 y p25 en la captación del virus? Explicar los resultados

Tratamiento celular Número de Virus/ml

Control 1 x 107
siRNA-p24 3 x 106
siRNA-p25 2 x 106
siRNA-p24 y siRNA-p25 1 x 104
siRNA proteína vírica 1 x 102

Se concluye que tanto la proteína p24 como la p25 son receptores celulares que utiliza el virus para captar
las células ya que cuando se disminuye la expresión de las 2, el número de virus disminuye también. Se ha
visto también que es mucho más eficaz introducir siARN contra una proteína vírica esencial para la
supervivencia de este.

¿No te llega para pagar Wuolah Pro? ¿Un año sin anuncios gratis? ¡Clic aquí!
a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-5974743