4.2.2.

Medida del número de individuos

Métodos directos:

1.2.1.1   Cámara de recuento de Petroff-Hauser: Consiste en un portaobjetos

especial con una graduación en superficie y unas medidas muy concretas:

excavación con 0.02 mm de profundidad;

área de 1 mm2, dividida en un retículo de 25 cuadrados grandes;

cada cuadrado grande está subdividido a su vez en 4x4 = 16 cuadrados

pequeños.

O sea, la muestra se distribuye en 16X25 = 400 celdillas (cuadros pequeños).

La muestra, una vez dispensada entre la porta y el cubre, se deja reposar sobre la
plataforma del microscopio durante unos minutos, y se cuenta el número de
células en varias celdillas (normalmente en 16, equivalentes a uno de los cuadros
grandes). Se anota el número n de células observadas en esas 16 celdillas.
Entonces, la concentración celular es fácil de establecer:

n x 25 x 50 x 1000 = concentración en células/ml.

Ventajas: es un método muy rápido

Inconvenientes: sólo sirve para suspensiones relativamente concentradas

(>10x106 céls. /ml). Por debajo de este valor el número de células vistas en el
campo del microscopio es muy pequeño y poco significativo estadísticamente. En
bacterias móviles, hay que inmovilizarlas previamente, con una mezcla de alcohol
y agua.

1.2.1.2 Recuento en preparaciones teñidas: Se dispone de una porta con una

excavación circular (de área At) con un volumen conocido (v). Sobre esta
excavación se extiende la muestra con asa de siembra o con micropipeta, y se fija
y tiñe por algún colorante. Se observa con un microscopio dotado de un juego de
ocular y objetivo que delimitan un área de campo (Ac). Si en dicho campo se
cuentan n bacterias, la concentración de bacterias por mililitro será:

n·At/Ac· 1/v

1.2.1.3   Recuento proporcional de Wright: Se mezcla la suspensión bacteriana

problema con una cantidad conocida de bolitas de látex o de hematíes. La
concentración bacteriana se deduce de la proporción de bacterias y partículas
observadas en el mismo campo microscópico. Este método se emplea más
frecuentemente en Virología.

1.2.1.4   Contadores electrónicos de partículas (tipo Coulter): Se hace pasar

una suspensión bacteriana por un tubo capilar, entre los dos polos de una
corriente eléctrica. Cada vez que por un orificio (30 m m diámetro) pasa una
partícula (p. ej., bacteria) se interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un
dispositivo de registro electrónico, que detecta el número y el tamaño de las
partículas que van pasando. (El tamaño detectado es función de la intensidad del
pulso de voltaje al paso de la partícula). Recientemente se ha introducido la
citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS). Es una sofisticada
modificación en la que las partículas a contar se marcan previamente con un
anticuerpo monoclonal u otro ligando específico hacia alguna molécula de
superficie, unidos a su vez a un fluorocromo, una molécula que emite
fluorescencia al incidir sobre ella un haz de luz láser.

Métodos indirectos:

Son métodos que miden el número de bacterias viables (que no equivale al de

totales).

1.2.2.1   Método del número más probable: Su fundamento estriba en la

distribución de Poisson: una distribución aleatoria de partículas en una serie de
muestras iguales, en función del número medio de partículas presentes en una
suspensión.
PX = mX · e-m/x!

donde x = número real de partículas en cada muestra y m = concentración

(no partículas/volumen)

La técnica consiste en sembrar alícuotas de la suspensión original problema sobre

un medio líquido o sólido adecuado; tras el tiempo de incubación adecuado se
anota la proporción obtenida de muestras donde no se haya dado crecimiento,
P0 (x = 0). Entonces, según la distribución de Poisson:

P0= e--m

y por lo tanto es fácil calcular el valor de m:

m = -lnP0

1.2.2.2   Recuento de viables en placa: Como esta técnica será explicada al

alumno en clase, y además la realizará en las prácticas, remitimos a las
pertinentes explicaciones "en vivo". Es una de las técnicas de recuento más
usadas en la rutina del laboratorio de Microbiología.

Precauciones:

 para minimizar los errores estadísticos de muestreo, se recomienda

sembrar 5 placas de cada dilución;

 hay que usar pipetas nuevas en cada dilución;

 contar las placas donde existan entre 50 y 300 colonias.

1.2.2.3 Determinación de la proporción células viables/células totales: Si se

está interesado en conocer esa proporción se recurre a una técnica de micro
cultivos en cubreobjetos: hay que seguir periódicamente la evolución del
crecimiento de células individuales y determinar la proporción de aquellas células
no viables (visibles al microscopio, pero incapaces de crecer).

1.2.2.4 Recuento sobre filtros de nitrocelulosa: Se usa para suspensiones

diluidas de bacterias. Se hace pasar un gran volumen de suspensión a través de
una membrana de nitrocelulosa estéril, que retiene las bacterias. Posteriormente,
el filtro se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo sólido. Las colonias
se forman sobre el filtro y se cuentan, deduciéndose la concentración original en
función del volumen de suspensión que se hizo pasar por el filtro.

http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/micro-ianez/14_micro.htm