Práctica 8.

Espectrofotometría

María Camila Guerrero Blandón, María del Mar Ocampo Mejía y Lina Marcela Álvarez Palomino
Estudiantes de Bioquímica de la Universidad Libre Sede Pereira.

Silvia Carolina Rivera Docente de Laboratorio de Bioquímica de la Universidad Libre sede Pereira.

Palabras Clave: espectrofotómetro – luz - blanco – patrón - absorbancia – longitud de onda

Introducción
La espectrofotometría es una técnica experimental que se utiliza para medir la cantidad de energía
radiante que absorbe una muestra de una sustancia química en función de la longitud de onda de
la radiación. La cantidad de luz absorbida depende de las propiedades de la muestra en cuestión,
como su concentración, estructura y composición, ya que permite identificar y cuantificar la
presencia de compuestos químicos en una muestra. También se utiliza para estudiar la interacción
entre moléculas y para caracterizar las propiedades ópticas de los materiales. Se puede usar en una
variedad de aplicaciones, como el análisis de alimentos, la medición de la concentración de
sustancias químicas en el medio ambiente, la cuantificación de la concentración de proteínas en una
muestra, entre otras. En la espectrofotometría, se utiliza un espectrofotómetro para medir la
cantidad de luz que atraviesa la muestra a diferentes longitudes de onda de la radiación
electromagnética. La muestra absorbe diferentes cantidades de energía en diferentes longitudes de
onda, y esta información se puede utilizar para inferir su composición química.

Las moléculas tienen la capacidad de absorber radiaciones y almacenarlas. Cuando molécula

absorbe la luz (energía) se produce un cambio de estado energético basal a un estado energético
excitado (mayor energía) lo que permite diferenciarlas de las otras moléculas, gracias a esto la
absorción que tiene una molécula a diferentes longitudes de onda (espectro de absorción) hace
parte de la identidad de esa molécula. Posteriormente la molécula libera su energía mediante
distintos mecanismos hasta que vuelve al estado energético basal (1).

En la espectrofotometría UV-Visible visible, se utiliza luz visible (400-780 nm), y ultravioleta (UV
cercano, de 195-400 nm) para medir la absorbancia de una sustancia. La luz visible nos permite
observar el color visible de una solución, y este corresponde a la longitud de onda de luz que
transmite, pero no absorbe; el color que absorbe es complementario al que transmite. La luz UV es
peligroso para ojo humano pues produce daños y también quemaduras, es muy importante en la
determinación cualitativa y cuantitativa de compuestos orgánicos (2).

Cuando un haz de luz pasa a través de un medio, se registra una cierta pérdida de intensidad, debido
a la absorción por parte de la sustancia (1). Se le denomina transmitancia (T) a la relación entre la
luz incidente y la luz transmitida. La absorbancia (A) se relaciona con la concentración de una
sustancia a través de la Ley de Lambert-Beer, que establece que la absorbancia es proporcional a la
concentración de la muestra y a la longitud del camino de la luz a través de la muestra. Esta ley se
expresa como A = εlc, donde A es la absorbancia de la muestra, ε es la constante de absorción molar,
l es la distancia que la luz recorre en la muestra y c es la concentración de la muestra. En resumen,
cuanto mayor sea la concentración de la muestra, mayor será la absorbancia medida por el
espectrofotómetro (1).

En la práctica de laboratorio de espectrofotometría, se llevaron a cabo mediciones de la absorbancia

de una muestra en disolución a diferentes longitudes de onda utilizando un espectrofotómetro. La
muestra utilizada fue una solución de permanganato de potasio (KMnO4) que se utilizó para
construir una curva de espectral y aplicar la Ley de Beer.

Materiales y Métodos
En esta práctica de laboratorio iniciamos con la determinación de la curva espectral del ion de
permanganato de potasio, donde en una celda se agregaron 3 ml de permanganato de potasio
(KMnO4) de concentración de 0,0001 mol/L, para ser usado como muestra, y a otra celda se le
agregaron 3 ml de agua destilada para ser usado como blanco. Cuando el nivel de absorbancia
estaba en cero ubicamos adecuadamente la muestra de permanganato en el fotómetro para poder
medir la absorbancia desde los 400 nm hasta los 700 nm en intervalos de 50 nm, después
determinamos el valor máximo de la absorbancia del permanganato de potasio (KMnO4) con ayuda
de los datos de longitud de onda y los resultados de la absorbancia que obtuvimos.

Después realizamos la prueba de la aplicación de la ley de Beer, en donde iniciamos utilizando el

permanganato de potasio para preparar diferentes soluciones según como se indicaba en la guía
(en el primer tubo agregamos 6 ml de KMnO4 más 4 ml de H2O, en el segundo tubo fueron 9 ml de
KMnO4 más 1 ml de H2O, en el tercero fueron 1 ml de KMnO4 más 9 ml de H2O, en el cuarto 3 ml
KMnO4 más 7 ml de H2O, en el quinto fueron 7 ml KMnO4 más 3 ml de H2O, y en el sexto tubo
fueron 10 ml de KMnO4 solamente); luego con las soluciones preparadas medimos la absorbancia
de la longitud de onda, calculamos la concentración de las diluciones, y por último, con los valores
de absorbancia y concentración elaboramos una gráfica para poder observar la relación entre la
absorbancia y la concentración.

Análisis de Resultados

I. Curva espectral del permanganato de potasio (KMnO4)

Tabla 1. Relación Absorbancia Vs Longitud de Onda

λ 400 450 500 550 600 650 700

nm
A 0,179 0,170 0,642 0,817 0,157 0,122 0,083
 Relación Absorvancia Vs Longitud de Onda
0,9
0,8 550; 0,817

0,7
500; 0,642
0,6
ABSORBANCIA

0,5
0,4
0,3
400; 0,179
0,2 650; 0,122
0,1 450; 0,17 600; 0,157 700; 0,083
0
0 100 200 300 400 500 600 700 800
LONGITUD DE ONDA

El valor máximo de la absorbancia máxima del permanganato de potasio (KMnO4) fue 550 λ nm con
una absorbancia de 0,817.

II. Aplicación de la Ley de Beer

Concentraciones:

• Tubo 1: V1= 6 ml C1=0,0001 mol/ml V2= 10 ml

C2= 6mlx0,0001 mol/ml = 0,00006 mol/ml

10 ml

• Tubo 2: V1= 9 ml C1=0,0001 mol/ml V2= 10 ml

C2= 9mlx0,0001 mol/ml = 0,00009 mol/ml

10 ml

• Tubo 3: V1= 1 ml C1=0,0001 mol/ml V2= 10 ml

C2= 1mlx0,0001 mol/ml = 0,00001 mol/ml

10 ml

• Tubo 4: V1= 3 ml C1=0,0001 mol/ml V2= 10 ml

C2= 3mlx0,0001 mol/ml = 0,00003 mol/ml

10 ml
 • Tubo 5: V1= 7 ml C1=0,0001 mol/ml V2= 10 ml

C2= 7mlx0,0001 mol/ml = 0,00007 mol/ml

10 ml

• Tubo 6: V1= 6 ml C1=0,0001 mol/ml V2= 10 ml

C2= 10mlx0,0001 mol/ml = 0,0001 mol/ml

10 ml

Tabla 2. Relación Absorbancia Vs Concentración

Tubo 1 2 3 4 5 6
Concentración 0,00006 0,00009 0,00001 0,00003 0,00007 0,0001
Mol/KMnO4
A 0,556 0,900 0,078 0,288 0,696 0,973

Relación Absorbancia Vs
Concentración
1,2

1 0,0001; 0,973
0,00009; 0,900
0,8
ABSORBANCIA

0,00007; 0,696
0,6
0,00006; 0,556
0,4
0,00003; 0,288
0,2
0,00001; 0,078
0
0 0,00002 0,00004 0,00006 0,00008 0,0001 0,00012
CONCENTRACIÓN MOL/ML

Se pudo observar que a mayor concentración de la solución de permanganato de potasio mayor es

su absorbancia. El tubo 6, que no fue diluido y mantuvo la concentración 0,0001 mol/ml, tuvo la
mayor absorbancia (0,973); mientras que el tubo 3, que fue el de menor concentración 0,00001
mol/ml tuvo la menor absorbancia (0,078).
Discusión
En base al procedimiento realizado en la práctica de laboratorio podemos argumentar que al
momento de realizar la lectura en el espectrofotómetro se debe tener en cuenta que la cubeta no
presente ningún rayón o alguna impureza, ya que esto podría afectar de manera directa los
resultados. Por lo tanto, la cubeta se debe llenar con dicha sustancia hasta el aforo indicado, esto
se debe a que, llegado el caso de agregarle un poco más de la cantidad de esta, el haz de luz solo
medirá una parte de la sustancia y la otra parte vacía, haciendo un mal uso del espectrofotómetro,
así mismo se debe evitar llenar de más y ocasionar un derrame de sustancia dentro de este lo cual
dañaría por completo dicho procedimiento (3).

Al realizar la lectura con la sustancia del permanganato de potasio en el espectrofotómetro para

determinar la absorbancia con diferentes longitudes de ondas se observa que con una longitud de
550 nm se presentó la máxima absorbancia, posteriormente se logró comprobar la ley de LAMBERT,
pues al realizar el grafico con los valores obtenidos en la espectrometría se observa una recta con
comportamiento lineal, lo cual demuestra que la absorbancia y la concentración son directamente
proporcionales.

Finalmente, como indica la literatura, la curva de calibración permite obtener los valores
desconocidos de dicha solución problema gracias a la Ley de Beer-Lambert.

Podemos concluir que el espectrofotómetro es una herramienta muy importante en el laboratorio,

ya que con ella determinamos la absorbancia de una sustancia en una cubeta a través de un haz de
luz, mediante la experimentación se pudo constatar la veracidad de la Ley de Beer-Lambert., ya que
se evidencio una relación directamente proporcional entre la trasmisión de luz a través de una
sustancia y la concentración. Así como también entre la trasmisión y la longitud del cuerpo de la luz
que atraviesa (4).

Glosario
Monocromador: consiste en una rendija de entrada que proporciona una imagen estrecha y casi
coherente de la fuente de radiación, un colimador que hace paralela la radiación procedente de la
rendija de entrada, una red o prisma para dispersar la radiación incidente, otro colimador para
formar la imagen de la rendija de entrada sobre la rendija de salida y una rendija de salida para aislar
la banda espectral deseada (5).

Filamento de tungsteno: Es un cuerpo en forma de hilo, flexible o rígido, utilizado en el hilo

conductor de las lámparas eléctricas. El filamento de tungsteno de una lámpara incandescente está
formado por un alambre extremadamente fino, mucho más que el de un cable cualquiera ().

Red de difracción: es una estructura repetitiva que se utiliza para introducir una perturbación
periódica en un frente de onda (6).

Lampara de deuterio: se utilizan, para longitudes de onda del espectro visible y el ultravioleta
próximo. Estas lámparas producen un espectro radiante entre 360-950 nm. Por su parte,
las Lámparas de Deuterio generan un espectro continuo en la región ultravioleta entre 220-360 nm
(7).
Cuestionario
1. Consultar 5 aplicaciones de la espectrofotometría en el campo clínico.

• Identificación de microbios: es un requisito en el laboratorio clínico, se realiza para el cultivo

celular, este método genera una larga espera para obtener resultados y puede llegar a falsos
negativos, también se usa el método de espectrometría para los hemocultivos y han
ayudado para implementar nuevos métodos en las firmas biológicas asociadas al
coronavirus (8).
• Monitorización de anticuerpos terapéuticos: son una clase nuevas de terapias realizadas
para tratar una variedad de enfermedades como los son, los trastornos autoinmunes y
algunos tipos de cáncer (8).
• Proteómica de la salud y tejidos enfermos: es el estudio del complemento integral de las
proteínas en un organismo, tejidos, células o cambios que puedan ocurrir. Estos datos
proteómicos que se toman ayudan formar cosas muy valiosas en la salud del tejido como lo
ha sido identificar nuevos biomarcadores para diagnosticar de forma no invasiva
enfermedades como, proteína C reactiva y troponina I como biomarcadores para infarto de
miocardio (8).
• Oncología personalizada: permiten adquirir información sin precedentes sobre las
enfermedades, lo que hace que cada vez mayor sea de mayor interés los datos, para ayudar
a mejorar los resultados médicos. Los primeros trabajos en este campo se han centrado
principalmente en la oncología, los pacientes que tienen cánceres causados por anomalías
genómicas específicas se emparejan con pacientes, se les realiza terapias que ayudan a
atacar los mecanismos moleculares detrás de su malignidad. Po eso, Se han dado cuenta
que es esencial los datos proteómicos y transcriptómicas para complementar la información
genómica (8).
• Diagnóstico en el punto de atención: es una técnica interesante para aplicaciones de
pruebas en el punto de atención, donde se administran pruebas diagnósticas en el
momento y lugar de atención del paciente, facilitando decisiones rápidas y la prestación de
asistencia sanitaria simplificada (8).

2. Suponga que tiene una solución con una concentración muy elevada, al hacer la lectura
en el fotómetro excede el valor limite saturando la capacidad del detector. Describa
claramente qué procedimiento emplearía para su cuantificación.

Si la concentración de la solución es tan alta que satura la capacidad del detector del fotómetro, se
debe diluir la muestra para poder realizar una lectura más precisa. El procedimiento para diluir la
muestra implicaría tomar una cantidad conocida de la solución original y mezclarla con una cantidad
conocida de solvente para obtener una solución diluida con una concentración menor. Luego, se
tomaría una muestra de la solución diluida y se mediría su absorbancia en el fotómetro. Conociendo
la dilución, se podría calcular la concentración de la solución original a partir de la concentración
medida de la solución diluida y los volúmenes utilizados en la dilución. Debe de asegurarse de elegir
un solvente que no interfiera con la lectura en el fotómetro y de ajustar la dilución para que la
concentración de la solución diluida se encuentre dentro del rango lineal del detector del fotómetro
(9).
Referencias
1. PRÁCTICA 4. ESPECTROFOTOMETRÍA. (s. f.). Universidad Pablo de Olavide, de Sevilla.
https://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/quimbiotec/FQpractica4.pdf

2. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. (s. f.). 8. Espectrofotometría: Espectros

de absorción y cuantificación colorimétrica de biomoléculas. Universidad de Córdoba.
https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETRIA.pdf

3. Ángel, R. C. (2012). Técnicas espectroscópicas en química analítica. Dialnet.

https://dialnet.unirioja.es/servlet/libro?codigo=564061

4. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana, septiembre-diciembre, Vol. 39, N.º 4.

Federación Bioquímica de la Provincia de Buenos Aires, Argentina.
2005. http://www.redalyc.org/pdf/535/53539414.pdf

5. Capítulo 5.- Instrumentos para la medida práctica del color. (s. f.). Universidad de la Rioja.
https://www.unirioja.es/cu/fede/color_de_vino/capitulo05.pdf

6. EcuRed. (s. f.). Filamento - EcuRed. https://www.ecured.cu/Filamento

7. Diana Skigin. (s. f.). Redes de difracción. Universidad de Buenos Aires - Exactas
departamento de física.
http://materias.df.uba.ar/f2qa2016c2/files/2016/08/Guia_11_Redes_de_difraccion.pdf

8. Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. (s. f.).

Procedimientos en Microbiología Clínica. Sociedad Española Enfermedades Infecciosas
Microbiología Clínica.
https://seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc
-procedimientomicrobiologia62.pdf

9. N. Riaño, Fundamento de química analítica básica. Análisis cuantitativo, 2da ed. Colombia:
Editorial Universidad de Caldas, 2007, pp 107.