AISLAMIENTO Y PURIFICACION DE PROTEINAS A PARTIR DE MATERIALES

BIOLOGICOS

OBJETIVO: Aislar y purificar proteínas a partir de diversos materiales biológicos

FUNDAMENTO: Los métodos utilizados habitualmente para la separación de proteínas puras se

basan en su distinta solubilidad en determinadas condiciones (pH próximo o alejado de su punto
isoeléctrico, tamaño molecular, fuerza iónica del medio, etc.) de modo que, por regla general, se
favorece la eliminación de materiales que puedan interferir, precipitando a continuación la proteína
deseada y dejando los restantes componentes de la muestra biológica en el sobrenadante, para su
eliminación.
Los métodos de separación son diversos. Así, la caseína, la principal proteína de la leche se precipita
simplemente por variación del pH, hasta llegar al punto isoeléctrico donde es insoluble en agua. La
caseína es, en realidad una mezcla heterogénea de fosfoproteínas que se encuentra en una
proporción del 3.5 % en la leche y constituye un alimento muy completo pues posee todos los
aminoácidos esenciales para un crecimiento y desarrollo normales.
La ovoalbúmina el principal componente de la clara de huevo (64 %), se obtiene tras precipitar las
ovoglobulinas con sulfato amónico y ajuste del pH al punto isoeléctrico donde su solubilidad es menor
y precipita.
La vitelina, una fosfoproteína que se encuentra en la yema de huevo, se obtiene por eliminación de
los lípidos que la acompañan y por disminución de la fuerza iónica del medio.
La miosina, una globulina típica, forma parte del sistema de proteínas contráctiles de las miofibrillas
del músculo estriado. Como globulina se solubiliza en una solución salina de fuerza iónica baja y
precipita al disminuir notoriamente la fuerza iónica. El mismo efecto se utiliza para extraer una
globulina de un tejido vegetal.
La ureasa (código 3.5.1.5) fue la primera enzima cristalina obtenida en forma pura por Sumner, en
1926, a partir de la soya, siguiendo el mismo procedimiento que seguiremos aquí, o sea mediante
precipitación con acetona, a partir del extracto de semillas de soya.
La base de la separación de las proteínas que hemos mencionado es el hecho de que la solubilidad
de los solutos ionizables, sean proteínas o sales inorgánicas sencillas, se modifica por la presencia
de otros iones.
Cada ion en solución se encuentra rodeado por una "atmósfera iónica" de iones de carga opuesta
que puede modificar notablemente la solubilidad de una sustancia iónica dada. En general, la
solubilidad de una proteína aumenta por la presencia de fuerzas iónicas relativamente bajas de sales
neutras y disminuye por la presencia de fuerzas iónicas altas. Normalmente, como sal neutra se
utiliza sulfato de amonio para aumentar o disminuir la solubilidad de una proteína.

El efecto facilitador de las sales neutras sobre la solubilidad se llama solubilización salina o saltíng
in, en tanto que la disminución de la solubilidad en presencia de fuerzas iónicas elevadas constituye
la precipitación salina o salting out.
La solubilización salina estabiliza los grupos cargados en las proteínas mientras que la precipitación
salina se presenta por una competición, por el agua, entre la proteína y la sal. Al aumentar la
concentración de sal ésta desplaza al agua, que se transforma en agua de hidratación alrededor de
los iones cargados de la sal. La consecuencia final es la precipitación de la proteína.

MATERIALES Y REACTIVOS:
Centrífuga
Nevera
Vidrio de reloj grande baño María
Probeta de 50 ml probeta de 100 mL
Termómetro tijeras
Gasa algodón
pH-metro
balanza
Vaso de precipitados de 100 mL
agitador de vidrio
Erlenmeyer de 125 mL y de 500 mL
2 erlenmeyer de 21
papel de filtro
Hielo
embudo de separación de 500 ml
100 mL de leche
2huevos
50 mL de ácido acético al 25 %
50 mL etanol al 95 %
100 mL etanol al 50 %. Conservarlo en nevera
500 mL éter etílico
I00 mLNaOH 0.lN
250 mL de solución saturada de sulfato de amonio
(760 g/1)
250 mL acetona 250 ml NaC1 10%
50 mL NaCI 0.95 %
Mantener en nevera hasta su uso
20 mL tampón de citrato 0.5 M, pH 6.0.
Para prepararlo se disuelven en agua 1.208 g de ácido cítrico cristalizado y 13.014 g de de citrato
trisódico cristalizado, hasta completar 100 mL de solución. Si no se dispone de citrato trisódico, se
pueden disolver 1.208 g de ácido cítrico cristalizado en unos 50 mL de agua destilada y se adiciona
hidróxido sódico 1 N, gota a gota y con agitación continua, hasta que el pH-metro marque 6.0. Luego
se diluye con agua destilada hasta 100 mL.25 mL tampón de citrato 0.05 M, pH 6.0. El tampón
anterior se diluye 10 veces 10 ml tolueno 1 g citrato sódico
10 mg heparina 30 mL sangre fresca de res o humana

PROCEDIMIENTO:

Obtención de caseína:

En un vaso de precipitados de 125 mL vierta 30 mL de leche. Agregue ácido acético al 25 %, gota a

gota, agitando después de cada adición, hasta que se observe la precipitación floculada de la
caseína. En este momento el pH debe ser aproximadamente 4.8. Centrifugue a 2000 rpm durante
cinco minutos. Si es necesario, agregue un pequeño volumen de agua destilada al vaso de
precipitados para pasar todo el sólido al tubo de centrífuga. Deseche el sobrenadante. Por dos veces
redisuelva el residuo en 30 mL de agua destilada y centrifugue de nuevo. En ambos casos elimine
el sobrenadante.

Resuspende el residuo en 20 mL de etanol al 95 % y centrifugue de nuevo. Elimine el sobrenadante.

Prepare 20 mL de una mezcla etanol-éter 1:1 y en esa mezcla resuspende el nuevo residuo.
Centrifugue y elimine el sobrenadante. Resuspende en 20 mL de éter y pase el conjunto a un vidrio
de reloj grande o a otro recipiente previamente pesado. Deje secar al aire y pese el conjunto. Por
diferencia de pesadas determine la cantidad de caseína obtenida. Guarde el polvo blanco obtenido
para la práctica de "Caracterización de proteínas"

Obtención de ovoalbúmina de clara de huevo:

Pase una clara de huevo a través de una malla de media de nylon y recíbalas en un vaso de
precipitados previamente tarado. Determine el peso de la clara de huevo.
Añada un volumen de tantos mililitros de solución saturada de sulfato de amonio como gramos de
clara de huevo haya recogido. Esta adición se debe realizar con lentitud, casi gota a gota, mientras
se agita vigorosamente. Las ovoglobulinas y la ovomucina (principal responsable de la viscosidad
de la clara de huevo) precipitan fácilmente y se pueden separar por centrifugación a 3000 rpm,
durante cinco minutos.
El sobrenadante se filtra a través de una mota de algodón situada en el vértice de un embudo y al
filtrado se le añade solución saturada de sulfato de amonio., gota a gota, hasta que el líquido esté
totalmente turbio. En este punto se añade ácido acético al 25 %, gota a gota y con agitación continua
hasta que el pH de la solución esté próximo a 4.5 (comprobar con papel indicador) que es el punto
isoeléctrico de la ovoalbúmina, A este pH se produce la precipitación de la proteína. El precipitado
se separa por centrifugación a 3000 rpm durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y
redisuelva el precipitado, agitando con una varilla, en unos 20 ml de agua destilada. Transfiera a otro
recipiente filtrando a través de un embudo con una mota de algodón. Allí, añada lentamente, y con
agitación, 20 mL de acetona. El precipitado que se forma se separa por centrifugación. Pase el
residuo a un vidrio de reloj u otro recipiente previamente pesado, adiciónele 20 mL de éter y deje
secar al aire. Pese el polvo obtenido y guárdelo para la práctica de "Caracterización de proteínas".

Obtención de hemoglobina:
A 20 mL de sangre fresca agregue 3 mg de heparina o 30 mg de citrato sódico, agite bien y
centrifugue a 2000 rpm durante 20 minutos. Descarte el plasma sobrenadante. Se resuspende el
precipitado de eritrocitos en un volumen aproximadamente igual de cloruro sódico al 0.95 % y
centrifugue de nuevo, durante 10 minutos, para eliminar los restos de plasma. El residuo se
resuspende en agua destilada hasta un volumen total de 50 mL. Se agregan 5 mL de tolueno y se
mantiene el conjunto a 37 °C durante 15 minutos, con agitación fuerte y constante. Se centrifuga de
nuevo a 2000 rpm, durante 10 minutos, y se descartan el precipitado y la fase orgánica que contiene
buena parte de los lípidos- Se transfiere la disolución de hemoglobina a un baño de hielo y se mide
su volumen, se agita fuertemente durante tres minutos y se le añade un volumen de etanol frío al 50
%, gota a gota, agitando el conjunto con una varilla para que la precipitación sea uniforme. Se
centrifuga y el residuo se guarda para la práctica de "Caracterización de proteínas".

RESULTADOS:
• ¿Cuáles son las características físicas de la solución o del polvo de proteína obtenido?
• ¿Cuál es el porcentaje de la proteína aislada (en los casos en que se obtuvo un polvo) con
respecto a la muestra biológica utilizada? Compare ese valor con el que se encuentra en la
literatura
• ¿Qué métodos de desproteinización aplicables a una muestra de un alimento puede
mencionar? Enumere ventajas y desventajas.
• ¿Qué diferencias existe entre un método extractivo y uno no extractivo para determinar
proteína?
• Explique detalladamente como metaboliza y degrada la proteína de la leche y el huevo en el
organismo humano.