Introduccion A La Citometria de Flujo

Introducción a la
citometría de flujo.
Julio 2005.
BD Biociencias, NLA
Introducción a la citometría de flujo
2
Contenido
Prefacio ............................................................................................................................... 4
Visión general ..................................................................................................................... 5
Sistema de fluidos ............................................................................................................... 8
Dispersión de la luz y fluorescencia ................................................................................. 11
Dispersión de la luz....................................................................................................... 11
Fluorescencia ................................................................................................................ 14
Óptica................................................................................................................................ 18
Láser.............................................................................................................................. 18
Tabla óptica................................................................................................................... 18
Filtros ópticos................................................................................................................ 21
Detección de señales ..................................................................................................... 23
Umbral (“Threshold”)................................................................................................... 27
Análisis de datos ............................................................................................................... 28
Adquisición y despliegue de datos................................................................................ 28
Selección (“Gating”)..................................................................................................... 30
Análisis de datos para medición de subpoblaciones. .................................................... 31
Análisis de datos para otras aplicaciones...................................................................... 34
Separación (“Sorting”)...................................................................................................... 38
Respuestas a los cuestionarios de revisión........................................................................ 41
3
Prefacio
El aprender a operar un citómetro de flujo sólo puede hacerse de una manera completa
usando el instrumento. Sin embargo, el entender los principios básicos de la tecnología
facilita grandemente este proceso.
Esta guía contiene información básica para entender los principios de la citometría de
flujo. El estudio de este material y el resolver los cuestionarios al final de cada una de las
secciones hará mucho más provechoso el entrenamiento práctico en el uso de los
citómetros de BD Biociencias.
Esta guía toma alrededor de 2 horas para completarse. Por favor, tómese el tiempo para
completarla antes de recibir entrenamiento práctico formal. Las respuestas a los
cuestionarios se encuentran al final.
Nota acerca de la traducción de términos en citometría de flujo:

La citometría de flujo, como muchas tecnologías, es referenciada
principalmente en idioma inglés. Al traducir los términos al español es
posible que surjan ambigüedades respecto al término correcto a usar, y en
muchos casos el término en inglés ha sido de facto adoptado por
aquellosque están involucrados en esta disciplina. Por lo tanto, a lo largo
de esta guía cuando surjan términos con los que pudiera haber alguna
confusión, se proporcionará entre paréntesis, el término habitual usado en
inglés, de manera que se disminuyan las interpretaciones ambiguas y se
facilite la búsqueda de información complementaria en internet y
referencias en lengua inglesa.
Para mayor información
Consulte nuestro curso interactivo en línea:
http://www.bdbiosciences.com/immunocytometry_systems/support/training/
4
Visión general
La citometría de flujo es una tecnología que simultáneamente mide y analiza múltiples

características de partículas individuales en suspensión, usualmente células, mientras
estas pasan en un chorro de fluido a través de un rayo de luz. Las propiedades medidas
incluyen el tamaño relativo de las partículas, la complejidad relativa o granularidad, y la
intensidad de fluorescencia relativa.
Estas características se determinan usando un sistema óptico-electrónico que registra la
manera en que la partícula dispersa la luz y emite fluorescencia.
Un citómetro de flujo está compuesto de tres sistemas principales: sistema de fluidos,

óptica y electrónica.
El sistema de fluidos transporta las partículas en un chorro hasta el rayo láser para su
interrogación.
La óptica consiste de uno o varios láser para iluminar las partículas en el chorro y un
sistema de lentes y filtros para dirigir la luz resultante de la interacción de las partículas
con los láser a los detectores apropiados.
La electrónica convierte la luz detectada en señales electrónicas que pueden ser
procesadas por la computadora. En aquellos sistemas capaces de hacer separación celular,
la electrónica también se hace cargo del proceso de decisión de qué partículas serán
separadas.
En el citómetro de flujo, las partículas se llevan hasta el láser en un chorro de fluido.

Partículas suspendidas de entre 0.2 y 150 micrómetros de diámetro pueden ser
analizadas.
Es posible analizar células provenientes de tejidos sólidos, pero es preciso dispersarlas
primero y ponerlas en suspensión para poder analizarlas.
Las partículas a analizar pasan en la porción central del flujo (“sample core”). Cuando las
partículas se intersectan con el láser, dispersan la luz. Si hay moléculas fluorescentes
presentes se producirá además fluorescencia. La luz dispersada y fluorescencia es
recolectada por lentes colocados en las posiciones apropiadas, y una serie de filtros y
espejos conducirá la luz hasta los detectores apropiados. Estos detectores producirán
señales electrónicas de una intensidad proporcional a la cantidad de luz que llegue hasta
ellos.
La magnitud de cada una de las señales de dispersión y fluorescencia es registrada para

cada evento o partícula y grabada en un formato de lista, frecuentemente referido como
“list mode data”. Estos datos son recolectados y almacenados en la computadora y
pueden ser analizados para proveer información relativa a subpoblaciones dentro de la
muestra.
5
Muestra
Láser Despliegue
de datos
Señales
electrónicas
Figura 1: Señales producidas por la dispersión de la luz y la fluorescencia convertidas a pulsos

electrónicos y representadas gráficamente
Revisión
1. ¿Qué propiedades de una célula o partícula pueden medirse en un citómetro de

flujo?
_______________________________________________________________
2. ¿Qué fuente de luz se usa comúnmente en los citómetros de flujo?

_______________________________________________________________
3. ¿Cuáles son los tres principales subsistemas en un citómetro de flujo?

_______________________________________________________________
4. ¿Qué tipo de muestra biológica es la más apropiada para análisis por citometría de
flujo?
_______________________________________________________________
6
5. ¿Qué nombre se le da a la porción del flujo por el que pasa la muestra?

_______________________________________________________________
6. Cuando pasan a través del láser células marcadas con moléculas fluorescentes,
¿Cuáles son los dos tipos de señales generadas?
_______________________________________________________________
7. La luz emitida por una partícula es recolectada por:

_______________________________________________________________
8. La señal electrónica producida por los detectores es proporcional a:

_______________________________________________________________
9. ¿Todos los parámetros que se miden en citometría de flujo pueden determinarse

simultáneamente en una sola célula?
Verdadero Falso
10. ¿Las partículas deben estar separadas y en suspensión para poder ser analizadas
por citometría de flujo?
Verdadero Falso
7
Sistema de fluidos
El propósito del sistema de fluidos es transportar las partículas en suspensión hasta el

rayo láser para su interrogación. Para que las partículas sean iluminadas de la mejor
manera, las partículas deben pasar por el centro del rayo láser y solamente una célula o
partícula debe pasar por el láser a la vez.
Para conseguir esto, la muestra es inyectada en el centro de un chorro de fluido que la

envuelve (“sheat fluid”) en la cámara de flujo. El diseño de esta cámara de flujo (“flow
cell”) hace que la muestra se mantenga en el centro del flujo, en la región denominada
“sample core”, y es enfocada para llevar la muestra hasta el punto de interacción con el
láser.
Basándose en los principios del flujo laminar, el centro del flujo (“sample core”)
permanece en el centro del fluido envolvente (“sheat fluid”), y es comprimido y
acelerado de una manera controlada.
Las presiones de la muestra y del fluido envolvente son diferentes. Siempre, la presión
del fluido envolvente será mayor, y la presión de la muestra puede variarse con lo que
puede cambiar el tamaño del área por la que pasa la muestra y por consiguiente la
cantidad de muestra que pasa a través del láser por unidad de tiempo. La velocidad de las
partículas al pasar a través del láser siempre será constante.
Baja presión Alta presión

(12uL/min) Láser (60uL/min) Láser
Fluido Muestra Fluido Fluido Muestra Fluido

envolvente envolvente envolvente envolvente
Figura 2: Enfoque hidrodinámico del núcleo de la muestra (“sample core”) en la celda de flujo
Un flujo mayor, permite a las células pasar por distintos puntos a través del láser, lo que
hace que los eventos sean medidos con cierta variación dependiendo de la región por la
8
que crucen el láser, aunque de manera más rápida. Este tipo de flujo es normalmente
usado para mediciones cualitativas como la inmunofenotipificación.
Un flujo menor, limita a las células a pasar por un área más restringida. Esto hace que la
iluminación por el láser sea más uniforme y los eventos son adquiridos más lentamente.
Este tipo de flujo es usado comúnmente en aplicaciones dónde la resolución es crítica,
como el análisis de DNA.
La operación adecuada del sistema de fluidos es vital para conseguir que los eventos
lleguen al láser de una manera ordenada. Por lo tanto siempre se deben seguir los pasos
necesarios para asegurarse que el sistema está libre de burbujas de aire, suciedad y que se
encuentre adecuadamente presurizado para conseguir el flujo requerido.
Revisión: sistema de fluidos
1. El propósito del sistema de fluidos es:

tr transporte de las celulas o particulas al sample
_______________________________________________________________
core para ser detectadas por el laser
2. ¿Cuáles son los dos factores que pueden afectar la iluminación de las partículas
dentro del rayo láser?
la presión a la que pasa la muestra- la amplitud del
_______________________________________________________________
sample core
3. ¿Cuántas células o partículas deben pasar por el rayo láser al mismo tiempo?
una
_______________________________________________________________
4. La suspensión de partículas es inyectada en el flujo de ____________________

sheat fluid
dentro de la ____________________________.
sample core
5. El proceso por el cual la porción por la que pasa la muestra (“sample core”) se
coloca en el centro del fluido envolvente se conoce como:
flow cell
_______________________________________________________________
9
6. ¿Qué control regula el diámetro de la sección por la que pasa la muestra (“sample
core”)?
la presion de la muestra
_______________________________________________________________
7. Incrementar la presión de la muestra ___________________

aumenta la cantidad de
muestra que pasa y hace más __________________
variable el “sample core”.
8. Los estudios de DNA requieren un nivel de resolución tan alto como sea posible.
¿Qué flujo es el recomendado?
_______________________________________________________________
bajo
9. Un “sample core” más ancho disminuye la resolución.

Verdadero
_______ Falso
10. Una velocidad de flujo alta puede usarse para realizar mediciones cualitativas.
Verdadero
_______ Falso
10
Dispersión de la luz y fluorescencia
En la sección previa, se hablo de como las partículas o células eran alineados y llevados
en una fila a cruzar el láser. Para entender cómo el citómetro de flujo mide las distintas
propiedades de los eventos, es necesario entender que ocurre cuando la luz láser
interactúa con las partículas o células.
Dispersión de la luz
La luz se dispersa cuando se encuentra con una partícula. La manera como esto ocurre
depende de las propiedades físicas de la partícula, en particular su tamaño y su
complejidad interna. Factures como los organelos celulares, material granular dentro de
la célula y la forma de esta, afectan la manera en que dispersa la luz.
La luz se dispersa en un ángulo pequeño en una cantidad proporcional a la superficie

celular o tamaño de la partícula iluminada. Esta luz dispersada hacia el frente (forward
scatter = FSC) puede recolectarse independientemente de la luz no dispersada, y como
esta señal es independiente de la existencia de fluorescencia, frecuentemente se le usa
para identificar cuando un evento está pasando a través del láser y “disparar” el
procesamiento de las señales de todos los demás parámetros.
La luz que se dispersa lateralmente (side scatter = SSC), es decir, en un ángulo cercano a
90°, es proporcional a la complejidad interna de la partícula o la granularidad celular.
Detector de dispersión lateral
Fuente de luz Detector de dispersión frontal
Figura 3: Dispersión de la luz por una célula
La medición simultanea de las dispersiones frontal y lateral, FSC y SSC respectivamente,

permite la diferenciación de tipos celulares en base a sus características de tamaño (FSC)
y complejidad (SSC).
11
Neutrófilos
Sangre completa lisada
Neutrófilos
Monocitos
Linfocitos
Figura 4: Identificación de subpoblaciones celulares basandose en FSC y SSC
Revisión: Dispersión de la luz
1. ¿Cuándo ocurre dispersión de la luz?

_________________________________________________________________
2. ¿Qué características de la célula contribuyen a la dispersión de la luz?

_________________________________________________________________
3. La luz dispersada en la misma dirección de incidencia del láser es llamada:

_________________________________________________________________
4. La señal de FSC es proporcional a:

_________________________________________________________________
5. La luz dispersada y recolectada a 90° del eje de incidencia del láser es llamada:
_________________________________________________________________
6. SSC es proporcional a la ___________________ o ____________________ de la

célula.
12
7. La determinación simultanea de ____________ y ___________ puede permitir la

diferenciación de distintos subtipos celulares dentro de una población
heterogénea.
13
Fluorescencia
Un compuesto fluorescente es capaz de absorber la luz dentro de un rango determinado
de longitudes de onda. La absorción de energía de un fotón de longitud de onda
apropiada, ocasiona que un electrón en la molécula fluorescente pase a un estado de
energía más alto. Rápidamente el electrón regresa a su estado basal, deshaciéndose del
exceso de energía mediante la emisión de un fotón de luz. Este nuevo fotón emitido no es
exactamente igual al fotón absorbido originalmente, sino que tiene una longitud de onda
distinta, también dentro de un rango específico para el compuesto. Este proceso es el
denominado fluorescencia.
El rango de longitudes de onda en las cuales un compuesto fluorescente puede excitarse

es llamado espectro de absorción, y el rango de longitudes de onda de los fotones
emitidos es denominado espectro de emisión. Las diferentes longitudes de onda
corresponden dentro del espectro visible a distintos colores, de manera que estas
longitudes de onda suelen identificarse de acuerdo al color al que corresponden.
El láser más comúnmente usado en citometría de flujo es el de ion-argón, la luz de 488

nm de longitud de onda (azul) que emite tiene la capacidad de excitar varios de los
fluorocromos más comúnmente usados. Uno de esos fluorocromos es el isotiocianato de
fluoresceína (fluorescein isothiocyanate = FITC), al observar el espectro de absorción de
FITC, se puede ver que la línea de 488 nm está cerca del máximo de absorción, cuando
este fluorocromo sea iluminado por un láser de esta longitud de onda se producirá
fluorescencia; luz de otra longitud de onda dentro del espectro de absorción de FITC,
también será capaz de producir emisión de fluorescencia, aunque la intensidad no será la
misma debido a las diferencias en la eficiencia de absorción de la energía que refleja el
espectro.
Más de un fluorocromo puede ser utilizado al mismo tiempo con un sólo láser siempre y
cuando puedan ser excitados a la misma longitud de onda del láser, y si las longitudes de
onda de emisión son distintas de manera que se puedan identificar independientemente.
La combinación de FITC y ficoeritrina (phycoerythrin = PE), por ejemplo, cumple con
estos criterios. A pesar de que el máximo de absorción para PE no se encuentra en 488
nm, el fluorocromo es excitado lo suficiente. Las longitudes de onda de emisión de cada
uno de estos fluorocromos es distinta: 530 nm (verde) para FITC, y 570 nm (naranja)
para PE. Los picos de emisión están lo suficientemente apartados como para detectar
cada señal de manera diferenciada. La magnitud de la señal registrada será proporcional a
la cantidad de moléculas fluorescentes en la partícula o célula.
14
Figura 5: Espectro de absorción de 4 fluorocromos comunes
Figura 6: Espectro de emisión de los fluorocromos anteriores
Cuando un colorante fluorescente se conjuga a un anticuerpo monoclonal, puede usarse

para identificar un tipo celular específico en base a los marcadores de superficie presentes
en la membrana de la célula. En una población mixta, diferentes fluorocromos pueden ser
usados para distinguir entre distintas subpoblaciones. El patrón de tinción para cada
subpoblación, combinado con los datos de dispersión de la luz FSC y SSC, pueden usarse
para identificar las células presentes en una muestra y contar sus porcentajes relativos; y
en el caso de los separadores celulares para ser aisladas.
15
Anticuerpos marcados Marcadores antigénicos

con fluorocromos de superficie
Analizar
Incubar
Figura 7: Unión específica a un antígeno de superficie de un anticuerpo conjugado a un fluorocromo
Revisión: Fluorescencia
1. Cuando un compuesto fluorescente absorbe energía luminosa y después libera la

energía emite ____________________.
2. El rango de longitudes de onda a las cuales un compuesto fluorescente puede ser

excitado se denominan: __________________________________.
3. Las longitudes de onda a las cuales emite un fluorocromo constituyen su:

_______________________________.
4. ¿Cuál es el láser más comúnmente usado en citometría de flujo?

_________________________________________________________________
5. Los fluorocromos FITC y PE son excitados por la longitud de onda de un láser de

ión-Argón.
Verdadero Falso
6. Dos fluorocromos comúnmente usados en citometría son ________________ y

_______________.
16
7. Anticuerpos conjugados a fluorocromos son usados para:

________________________________________________________________
17
Óptica
El sistema óptico consta de dos partes, la óptica de excitación y la óptica de recolección.
La óptica de excitación está conformada por el o los láser, y los lentes que moldean y
enfocan el rayo. La óptica de recolección consiste de una serie de lentes para recoger la
luz emitida en la interacción láser partícula y un sistema de espejos y filtros ópticos para
dirigir determinadas longitudes de onda de esta luz recogida, hacia los detectores ópticos
designados. Todos estos elementos se encuentran montados sobre una tabla óptica
(optical bench) que asegura la alineación de los distintos elementos.
Láser
La palabra LASER son de hecho las siglas de light amplification by stimulated emission
of radiation (amplificación de luz mediante emisión estimulada de radiación). En los
láser de gas, la luz es generada mediante la ionización por un pulso de alto voltaje, de un
gas inerte (Ej.: Argón) contenido en un tubo de plasma al que se le aplica un campo
magnético. Los láser de estado sólido funcionan de manera análoga a los punteros láser,
usando un diodo que emite en una sola longitud de onda.
Tabla óptica
La tabla óptica en un citómetro de flujo, provee una superficie estable que mantiene la
fuente de luz y los distintos elementos de la óptica de excitación y recolección en
posiciones fijas. Con esto se asegura que el láser intercepta el flujo de partículas de
manera consistente de día a día y previene la necesidad de hacer ajustes por el operador.
18
Figura 8: Diagrama de la tabla óptica de un BD FACSCalibur


Figura 9: Diagrama de la óptica de adquisición en un BD FACSAria


Revisión: Tabla óptica
1. La tabla óptica, provee una superficie estable para la interacción del láser con:
_______________________.
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2. ¿Cuáles son los dos componentes del citómetro de flujo que deben estar
perfectamente alineados para iluminar las células de manera uniforme?
______________________________________________________________
3. La _______________________ en el citómetro asegura que el láser en el

citómetro intercepte al ____________________ consistentemente de un día a
otro.
20
Filtros ópticos
Una vez que una célula o partícula pasa a través de la luz láser, la luz resultante de esta
interacción es dirigida hacia un fotodiodo en el caso de FSC, y hacia tubos
fotomultiplicadores (photomultiplier tubes = PMTs) en el caso de SSC y la fluorescencia.
Todas estas señales son dirigidas hacia sus detectores mediante un sistema de espejos y
filtros ópticos. La especificidad de los detectores para una longitud de onda (color)
específico se optimiza al colocar un filtro al frente de este que sólo permite que un cierto
intervalo de longitudes de onda alcance el detector. Esta ventana de longitudes de onda
que puede alcanzar el detector se encuentra cerca del pico de emisión de fluorescencia
para cada fluorocromo. Los filtros como estos son llamados de paso de banda (band pass
= BP). Por ejemplo, el filtro usado frente al detector de FITC es un filtro 530/30 BP. Este
número nos da las características de las longitudes de onda que pueden atravesarlo: 530 ±
15 nm, o las longitudes de onda entre 515 nm y 545 nm.
Otros filtros usados son los de paso corto (shortpass = SP), que transmiten longitudes de
onda de menor o igual amplitud que la especificada, y de paso largo (longpass = LP) que
transmiten longitudes de onda de igual o mayor amplitud que la especificada. La luz que
no logra atravesar estos filtros es reflejada por ellos, de esta forma se puede dividir la luz
de longitudes de onda superiores e inferiores a la indicada por estos espejos dicróicos.
Figura 10: Paso de la luz a través de filtros de paso largo, corto, y de banda
21
Revisión: Filtros ópticos
1. Hay filtros ópticos colocados en frente de los detectores para:

_________________________________________________________________
2. Un filtro de paso de banda 530/30 BP permite el paso de la luz entre _________ y

_______ nm.
3. Un ______________________ es usado para dividir las señales de luz de acuerdo

a su longitud de onda y dirigirla a los detectores apropiados.
4. Los filtros de _____________________ permiten el paso de longitudes de onda

iguales o menores a la especificada, mientras que los filtros de
___________________ permiten el paso de longitudes iguales o mayores a la
especificada.
22
Detección de señales
Las señales de luz son generadas conforme las partículas pasan por el haz de luz láser.
Estas señales de luz son transformadas en señales electrónicas (voltajes) mediante
fotodetectores y en base a su intensidad se les asigna un canal en una escala. Existen dos
tipos de fotodetectores en los citómetros de BD Biociencias: fotodiodos y tubos
fotomultiplicadores (PMTs). Un fotodiodo es menos sensible a la luz que un PMT y es
usado para distinguir la señal de FSC, que es la más intensa de las señales. Los PMTs se
usan para detectar las señales mas débiles generadas por SSC y fluorescencia. Los
detectores de fluorescencia se identifican mediante los códigos FL1, FL2, FL3 y FL4, las
longitudes de onda que mide cada uno de estos están definidas por los filtros BP
colocados frente a ellos.
Un pulso de voltaje es creado cuando una partícula entra al paso del láser y comienza a
dispersar la luz y a generar fluorescencia. Cuando los fotones alcanzan el fotodetector,
son convertidos en un número proporcional de electrones, lo que crea una corriente
eléctrica. Esta es convertida en un pulso de voltaje por un amplificador, y este puede ser
medido y asignársele una magnitud en una escala. El punto más alto del pulso de voltaje
ocurre cuando la partícula se encuentra en el centro del láser y la máxima cantidad de luz
la está iluminando. Conforme la partícula abandona el láser, el pulso disminuye hasta su
nivel basal otra vez.
Figura 11: Creación de un pulso de voltaje
El tamaño del pulso de voltaje depende del número de fotones detectados, el voltaje
aplicado al PMT, y los parámetros del amplificador. Las señales pueden amplificarse
aplicando un mayor voltaje a los PMTs de manera que una misma cantidad de luz
incidente genere un voltaje mayor, o incrementando la ganancia en el amplificador.
23
El amplificador puede transformar las señales de lineares (Lin) a logarítmicas (Log). La

amplificación logarítmica se usa comúnmente para diferenciar señales negativas de
débilmente positivas en fluorescencia; mientras que la amplificación lineal se usa
normalmente para amplificar señales de dispersión de la luz.
Al pulso de voltaje se le asigna un valor numérico por un convertidor análogo-digital

(analog-to-digital converter = ADC). El ADC convierte el pulso de entre 0 y 1000 mV en
un número que lo representa como un canal en una escala de canales con valores de 0 a
1024. El número de canal se transfiere a la computadora mediante una interfase GPIO
(interfase de entrada y salida de propósito general) y puede ser representado como un
valor en una gráfica.
Análisis del pulso

Digitalización
Pulsos de voltaje
Figura 12: Pulsos de voltaje transformados en valores de canales por el ADC
En los sistemas digitales, como el BD FACSAria o el BD FACSCanto, el voltaje que

corresponde a cada señal es digitalizado en 16,384 niveles posibles 10 millones de veces
por segundo por los ADCs y transferidos a la computadora mediante una interfaz
ethernet. Los sistemas digitales no hacen uso de amplificadores logarítmicos, sino que los
datos son almacenados de manera lineal y desplegados gráficamente de manera lineal o
logarítmica según sea requerido.
24
Conversión
digital
Señal Datos
Fotón digitales
entrante
Voltaje
aplicado
Fuente de
poder Digitalización Muestreo
16 384 niveles 10mHz
Figura 13: Transformación de los pulsos de voltaje en un sistema digital
Independientemente de si el sistema es análogo o digital, en aquellos casos en que se usan

múltiples láser, las partículas irán cruzándolos sucesivamente lo que ocasiona una
diferencia en tiempo de las señales generadas por cada uno, de manera que la señal de los
láser debe ser sincronizada en el tiempo para que todos los parámetros de un evento sean
procesados a un tiempo. Al valor empleado en esta sincronización se le denomina retraso
del láser (“laser delay”).
Figura 14: El valor de “laser delay” sincroniza las señales provenientes de distintos láser para un
mismo evento
Revisión: Detección de señales
1. ¿Qué tipo de detector se utiliza para detectar la señal de FSC?

________________________________________________________________
25
2. Las señales de SSC y fluorescencias son detectadas por elementos altamente

sensibles llamados:
________________________________________________________________
3. Los detectores de luz generan una corriente que viaja hacia un amplificador, este
convierte la corriente en voltaje, el cual es proporcional a la intensidad de la luz
detectada.
Verdadero Falso
4. ¿Cuál es la función de un ADC?

_________________________________________________________________
26
Umbral (“Threshold”)
El umbral (“threshold”) puede usarse para limitar el número de eventos adquiridos por el
citómetro de flujo. El umbral puede establecerse como un canal límite en un parámetro de
dispersión o fluorescencia y una vez establecido sólo las señales con una intensidad igual
o mayor al valor del umbral serán procesadas y enviadas a la computadora. Por ejemplo,
al hacer inmunofenotipificación de muestras, el umbral puede establecerse en FSC para
eliminar eventos como restos celulares que se encuentren por debajo de un cierto número
de canal. Dependiendo de la aplicación se pueden usar valores de umbral en distintos
parámetros según convenga.
Es posible establecer valores de umbral para más de un parámetro, en este caso, los
eventos deben sobrepasar ambos umbrales para poder ser procesados.
Revisión: Umbral (“threshold”)
1. El “threshold” en FSC puede usarse para eliminar las señales generadas por:
________________________________________________________________
2. Si se ha elegido hacer “threshold” en dos parámetros, un evento debe superar al

menos el límite establecido por uno para ser registrado.
Verdadero Falso
27
Análisis de datos
Adquisición y despliegue de datos
Una vez que las señales luminosas han sido transformadas en digitales por el ADC, los
datos deben almacenarse en la computadora.
Los datos de citometría de flujo se almacenan de acuerdo a un formato estándar: el flow

cytometry standard (FCS), desarrollado por la Society for Analytical Cytology. De
acuerdo con este estándar, el archivo que se almacena incluye una descripción de la
muestra adquirida, el instrumento en el que se hace la adquisición, los datos en sí, y los
resultados del análisis.
Una sola célula analizada en cuatro parámetros (FSC, SSC, fluorescencia FITC y
fluorescencia PE) genera 8 bytes de datos. Al adquirir 10,000 eventos de una sola
muestra, un archivo FCS contendría 80 kB de datos.
Una vez que un archivo de datos ha sido salvado, las poblaciones celulares pueden
visualizarse gráficamente de diversas maneras. Un sólo parámetro como FSC o FL1
(FITC), puede ser representado como un histograma dónde el eje horizontal representa la
intensidad de fluorescencia y el eje vertical representa el número de eventos que hay con
cada intensidad. Las señales con idénticas intensidades se acumulan en el mismo canal
(picos más altos) y las señales de mayor intensidad se representan en los canales más a la
derecha de las señales menos intensas.
Es posible representar dos parámetros simultáneamente en una gráfica. Uno de los

parámetros en el eje “x” y el otro en el eje “y”; donde cada evento con ciertos valores es
representado con un punto (gráficas de dispersión = dot-plots), o dónde la densidad de los
eventos se representa por curvas de probabilidad (density plots y countour plots).
También es posible representar en un tercer eje “z” el número de eventos por canal, en
una gráfica tridimensional (“3-D plot”).
28
Histograma Dot-plot Gráfica

tridimensional
Figura 15: Representaciones gráficas de los datos en citometría de flujo
Revisión: Adquisición y despliegue de datos
1. ¿Qué se representa en el eje horizontal de un histograma?

_________________________________________________________________
2. Un dot-plot permite visualizar ________________ parámetros simultáneamente.
29
Selección (“Gating”)
Un subgrupo de datos de interés puede definirse a través de una selección o “gate”. Un

“gate” es una selección hecha numérica o gráficamente que puede usarse para aislar
eventos con determinadas propiedades. Por ejemplo, en una muestra de sangre dónde se
tiene una población mixta, se puede querer restringir el análisis a la población de
linfocitos. Usando como referencia la gráfica de tamaño vs. complejidad (FSC vs. SSC),
se puede definir una región alrededor de los eventos con características de linfocitos y
hacer los subsiguientes análisis sólo sobre esos eventos haciendo un gating en esa región,
de manera que sólo esos eventos sean considerados.
Sin “gate”
Aplicando un
“gate” (región R1)
Figura 16: Uso de “gates” para restringir un análisis a una subpoblación
Revisión: Selección (gating)
1. Un “gate” puede usarse para restringir los eventos que se visualizan y/o analizan
en una muestra.
Verdadero Falso
30
Análisis de datos para medición de subpoblaciones.
El análisis de datos consiste en el despliegue de los datos que se encuentran en modo de

lista en el archivo FCS, en una gráfica que nos permita interpretar el patrón de
distribución de los eventos identificándolos como parte de una población. El uso de
estrategias de selección (gating) permite aplicar análisis sobre una fracción específica de
los datos.
Por ejemplo, el dot-plot mostrado a continuación, una región se encuentra dibujada

alrededor de la población de interés, en este caso los linfocitos, un gating hecho en base a
esta región permite aislar estos eventos para análisis o separación.
Figura 17: Dot-plot con un “gate” abarcando la población de linfocitos
Los datos de los eventos dentro de este “gate”, pueden subsecuentemente ser mostrados
en distintas gráficas para la identificación y en su caso determinación de los porcentajes,
de las distintas poblaciones presentes.
Es posible trabajar en un histograma, para un solo parámetro, usando marcadores de

intervalos para identificar poblaciones. En un dot-plot para dos parámetros usando
cuadrantes o regiones. Es posible hacer combinaciones lógicas entre las poblaciones
abarcadas por las distintas regiones y los resultados pueden mostrarse en cuadros de
estadísticas que pueden a su vez ser exportados para trabajar con los datos en una hoja de
cálculo.
Un histograma permite ver un solo parámetro graficado con el número de eventos para
cada valor del mismo. Un control de isotipo (un anticuerpo irrelevante de la misma clase
usado para determinar unión inespecífica) puede emplearse para determinar la posición
en que deben colocarse los marcadores. En el primer histograma, el marcador M1 se
coloca abarcando el pico negativo definido por el control de isotipo y el marcador M2 a
la derecha de este para identificar a los eventos positivos. El segundo histograma muestra
los resultados del marcaje de una muestra con un anticuerpo CD3 FITC, con un “gate”
aplicado en la región de los linfocitos.
31
Figura 18: Histogramas de control de isotipo (NORM001) y tinción con CD3 FITC (NORM002)
mostrando la ubicación de los marcadores
La estadística del histograma muestra 619 eventos en M1 y 2272 en M2. Los porcentajes
de eventos se muestran tanto para el total de eventos adquiridos (6000) como para los
eventos en el “gate” G1 que define a los linfocitos (2891). El porcentaje que nos interesa
el de linfocitos CD3+ dentro del total de linfocitos, este dato se encuentra en la columna
%Gated para la población M2: 2272/2891= 78.59%.
Figura 19: Estadística del histograma
Un dot-plot proporciona una representación de los datos en dos parámetros. Cada punto
representa un evento (o más de uno cuando los eventos se superponen). El primer dot-
plot muestra la distribución de los eventos al usar controles de isotipo para determinar
unión inespecífica. Este se usa para determinar la posición en la que deben colocarse los
cuadrantes. Los cuadrantes dividen la gráfica en 4 secciones que distinguen entre los
eventos doblemente negativos, dobles positivos y positivos para cada uno de los
parámetros representados.
En el ejemplo, el cuadrante inferior izquierdo representa los eventos que son negativos
para CD3 y CD19 (no los expresan), el cuadrante superior izquierdo, representa a los
eventos que son positivos únicamente para CD19, el cuadrante inferior derecho
representa a los eventos que son positivos únicamente para CD3, y el cuadrante superior
derecho representa los eventos que son positivos tanto para CD3 como para CD19.
32
Figura 20: Dot-plots de los controles de isotipo (NORM001) y tinción con CD3 FITC/CD19 PE
(NORM002) con marcadores de cuadrantes
Para conocer los porcentajes de linfocitos CD19+/CD3- se debe mirar en el análisis

estadístico de cuadrantes la columna %Gated de la población superior izquierda (upper
left = UL).
Figura 21: Estadística de cuadrantes
Alternativamente, las estadísticas pueden obtenerse creando regiones alrededor de las

poblaciones de interés en lugar de usar cuadrantes. Se pueden crear regiones de formas
distintas y usar la estadística de regiones para obtener los porcentajes de una población
específica.
Figura 22: Dot-plot de CD3 FITC/CD4 PE con cuatro regiones
33
Figura 23: Estadística de regiones
Existe un problema potencial al cualquiera de estos métodos de análisis cuando se

requiere analizar archivos provenientes de distintas muestras. Es posible que debido a la
variabilidad entre las muestras, los cuadrantes o regiones definidas para una no ajusten
perfectamente para el resto. En este caso será necesario reajustar las regiones o
marcadores por cada archivo.
Existen métodos de análisis que previenen esta situación. La tecnología de análisis de

grupos (cluster analysis) usada en BD Multiset y BD Attractors permite que las
regiones cambien de posición de manera que siempre abarquen las poblaciones de
eventos adecuadas de un archivo a otro. La herramienta de selección Snap-To, cumple
con la misma función en BD CellQuest Pro y BD FACSDiVa.
Figura 24: Regiones auto ajustables antes y después del análisis
Análisis de datos para otras aplicaciones
Los métodos de análisis descritos hasta ahora son útiles para estimar los porcentajes de
subpoblaciones en una muestra, pero otros tipos de análisis también revisten importancia.
Si estuviéramos analizando un clona celular para saber si es positiva para un marcador
determinado, no tendría sentido hablar de porcentajes. Ya que una línea celular clonada
consiste de una sola población, en la mayoría de los casos esta será 100% positiva o
34
100% negativa. También es posible que exprese un bajo nivel de la molécula analizada,
en este caso aún será positiva pero débilmente (dim).
Para casos como este, dónde se desea comparar la intensidad de fluorescencia y medir el
grado de positividad, se deben comparar las medias geométricas o las medianas de los
controles de isotipo y los de la muestra probada. Si los valores resultan mayores que los
del control de isotipo a partir de un límite establecido por quién realiza el estudio, las
muestras serán consideradas positivas. Mientras más grande sea esta diferencia, significa
que cada célula expresa un mayor número de moléculas y mayor será la positividad, o
más brillante la población.
El dot-plot siguiente muestra una sola población. La sobreposición de histogramas

muestra los datos del control de isotipo, y la tinción con dos anticuerpos distintos. La
media geométrica de las distintas poblaciones es en este caso de izquierda a derecha: 2, 5,
20. Corresponde a quién realiza el estudio decidir si el histograma del medio es positivo o
no.
Figura 25: Análisis de una línea celular
Además de ser usada para medir la positividad, la media geométrica o mediana puede ser
usada para evaluar la cantidad de moléculas ligando expresadas por célula. Software
especializado como QuantiCALC usan las medianas en conjunción con datos de una
curva estándar para calcular el número de anticuerpos unidos por célula. Un ejemplo de
esto se muestra en la siguiente figura. Los círculos en el eje “y” indican la información de
la curva estándar. Esta información puede usarse para estimar el número de ligandos por
célula.
35
Información de la curva estandar
Figura 26: Estimado del número de anticuerpos unidos por célula con QuantiCALC

Para análisis de contenido de DNA, puede usarse otro software especializado como lo es
ModFit LT. Debido a que la distinción de las poblaciones en las distintas fases del ciclo
celular en un histograma de DNA no presentan límites claros, estos programas aplican un
modelo matemático que calcula los porcentajes de cada población presentes en el área
bajo la curva.
Figura 27: Histograma de DNA
Revisión: Análisis
1. ¿Por qué razón podríamos querer utilizar un dot-plot en lugar de un histograma?

________________________________________________________________
36
2. De las figuras 18 y 19,

¿Qué porcentaje de linfocitos NO es CD3+? ______________________________
¿Qué porcentaje de los eventos totales es CD3+? __________________________
3. La población en el cuadrante inferior izquierdo es doble positiva.

Verdadero Falso
4. De las figuras 20 y 21,

¿Cuál es el porcentaje de linfocitos que son CD3+/CD19-? __________________
5. Las regiones sólo pueden ser rectangulares.

Verdadero Falso
6. ¿Cuál es la desventaja del uso de regiones para analizar varios archivos?

__________________________________________________________________
7. ¿Qué clase de análisis previene el problema de los cambios de posición de grupos

de células?
__________________________________________________________________
8. ¿Qué estadísticas se usan para medir el grado de positividad y para estudios de

cuantificación?
__________________________________________________________________
37
Separación (“Sorting”)
En la mayoría de las aplicaciones, después de que la partícula pasa a través del láser se le
envía a los desechos. La separación o “sorting”, nos permite capturar o recolectar las
células de acuerdo a criterios elegidos por nosotros para seguir trabajando con ellas.
Para separar partículas o células, el citómetro necesita primeramente identificar las

células de interés. Una vez que la población de interés se ha identificado en una o varias
gráficas, se pueden dibujar regiones y crear el “gate” que las identifica (este “gate” puede
estar formado por la combinación lógica de varias regiones). El citómetro nos permitirá
definir un “gate” para hacer la separación.
Diferentes citómetros usan diferentes métodos para capturar las partículas de interés. El
BD FACSCalibur, cuando esta equipado con la opción de “sorting”, utiliza un tubo
mecánico llamado “catcher” situado en la parte superior de la celda de flujo. Este tubo se
mueve dentro y fuera del “sample core”, por el que viajan las células, dependiendo de si
las células que pasan son o no de interés. El sistema puede moverse y separar células a
una velocidad de hasta 300 células por segundo.
Conforme las células pasan a través del láser el BD FACSCalibur la electrónica

determina si cumplen con las características del “gate” de “sorting”, para determinar si se
trata de una célula blanco. Las células blanco son capturadas de acuerdo con un modo de
captura que puede enfatizar la pureza de la muestra o la exactitud en la cuenta de las
células separadas. Gracias a que la alineación del láser y la velocidad del flujo son
constantes, el tiempo que les toma a las células llegar del punto de interrogación al
“catcher” es constante. Cuando una célula blanco es detectada, el sistema espera durante
la duración del trayecto de la célula del punto de interrogación al “catcher”, y entonces
dispara el “catcher”, para que entre en el “sample core” y capture a la célula. En la
siguiente figura se muestra un esquema con el “catcher” en posición de descanso y de
captura.
38
Células
recolectadas
Desperdicios
“Catcher”
Fluido Fluido
envolvente envolvente
Figura 28: Diagrama del sistema de separación en el BD FACSCalibur  con el “catcher” en posición
de reposo (izquierda) y de captura (derecha)
El separador celular BD FACSAria, utiliza un método electromagnético para realizar la

separación. En este caso, después de pasar por el punto de interrogación, el flujo con las
células pasa a través de una boquilla (nozzle) que hace que éste viaje como un chorro
(stream) en el aire. Vibraciones impartidas por el citómetro, rompen este chorro a
intervalos regulares formando gotas en las que se distribuyen las células. El sistema
puede determinar cuales de las gotas contienen células de interés y a éstas se les imprime
una carga eléctrica que hace que se desvíen de su trayectoria al pasar a través de un
campo eléctrico para ser recolectadas en tubos. Dependiendo de la magnitud y el signo de
la carga, las gotas pueden desviarse en distintas trayectorias permitiendo separar más de
una población a la vez.
39
Electrodo de carga
Inyección de la muestra
Placas de deflección
Desperdicios
Tubos de recolección
Figura 29: Separación electromagnética
Revisión: Separación (“Sorting”)
1. ¿Cuál es el nombre del dispositivo utilizado en el BD FACSCalibur para

capturar las células a separar?
__________________________________________________________________
2. En el BD FACSAria, ¿Cuál es el método empleado para separar las células de

interés?
__________________________________________________________________
40
Respuestas a los cuestionarios de revisión
Revisión
1. Tamaño relativo, granularidad o complejidad relativa, y fluorescencia relativa
2. Un láser
3. Sistema de fluidos, óptica y electrónica
4. Una suspensión de células individuales
5. Núcleo de la muestra (“sample core”)
6. Dispersión de la luz y fluorescencia
7. Lentes
8. La cantidad de luz que llega hasta ellos
9. Verdadero
10. Verdadero
Revisión: Sistema de fluidos

1. Llevar las células hasta el punto de interacción con el láser de manera controlada.
2. El ancho de la fracción por la que pasan las células (“sample core”) y la
alineación del flujo
3. Una
4. Fluido envolvente (“sheat fluid”), Cámara de flujo.
5. Enfoque hidrodinámico
6. El regulador de la presión de la muestra.
7. Incrementa, Ancho.
8. El más bajo.
9. Verdadero
10. Verdadero
Revisión: Dispersión de la luz

1. Cuando una partícula atraviesa el haz de luz láser
2. Su tamaño y su complejidad o granularidad
3. FSC
4. El tamaño de la célula.
5. SSC
6. Complejidad interna, Granularidad.
7. FSC, SSC.
41
Revisión: Fluorescencia
1. Fotones.
2. Espectro de absorción.
3. Espectro de emisión.
4. El láser de Ion-Argón de 488 nm.
5. Verdadero.
6. FITC, PE, PerCP, APC.
7. Identificar marcadores antigénicos.
Revisión: Tabla óptica

1. El flujo de la muestra.
2. El flujo de la muestra (“sample core”) y el láser.
3. Tabla óptica ("optical bench"), flujo ("stream").
Revisión: Filtros ópticos

1. Asegurar que sólo ciertas longitudes de onda alcancen el detector.
2. 515 y 545 nm
3. Filtro dicróico.
4. Paso corto ("shortpass"), paso largo ("longpass").
Revisión: Detección de señales

1. Un fotodiodo
2. Tubos fotomultiplicadores (PMTs).
3. Verdadero.
4. Convertir los pulsos de voltaje en una señal digital
Revisión: Umbral (“threshold”)

1. Restos celulares
2. Falso. Debe superar ambos.
Revisión: Adquisición y despliegue de datos

1. El valor de la señal para el parámetro medido (representado como el número de
canal).
2. Dos.
Revisión: Selección (gating)

1. Verdadero
42
Revisión: Análisis
1. Para representar al mismo tiempo valores en dos parámetros distintos
2. 21.41%, 37.87%
3. Falso. Es doble negativa
4. 79.57%
5. Falso.
6. Puede ser necesario ajustarlas de muestra en muestra.
7. El análisis con Atractores en BD Multiset y BDAttractors, y usando regiones
"Snap-to" en BD CellQuest Pro y BD FACSDiVa.
8. La media geométrica o mediana.
Revisión: Separación (“Sorting”)

1. “Catcher”.
2. Separación electromagnética.
43
44

Introduccion A La Citometria de Flujo

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Introducción a la

Nota acerca de la traducción de términos en citometría de flujo:

Para mayor información

Consulte nuestro curso interactivo en línea:

La citometría de flujo es una tecnología que simultáneamente mide y analiza múltiples

Un citómetro de flujo está compuesto de tres sistemas principales: sistema de fluidos,

En el citómetro de flujo, las partículas se llevan hasta el láser en un chorro de fluido.

La magnitud de cada una de las señales de dispersión y fluorescencia es registrada para

Figura 1: Señales producidas por la dispersión de la luz y la fluorescencia convertidas a pulsos

1. ¿Qué propiedades de una célula o partícula pueden medirse en un citómetro de

2. ¿Qué fuente de luz se usa comúnmente en los citómetros de flujo?

3. ¿Cuáles son los tres principales subsistemas en un citómetro de flujo?

5. ¿Qué nombre se le da a la porción del flujo por el que pasa la muestra?

7. La luz emitida por una partícula es recolectada por:

8. La señal electrónica producida por los detectores es proporcional a:

9. ¿Todos los parámetros que se miden en citometría de flujo pueden determinarse

El propósito del sistema de fluidos es transportar las partículas en suspensión hasta el

Para conseguir esto, la muestra es inyectada en el centro de un chorro de fluido que la

Baja presión Alta presión

Fluido Muestra Fluido Fluido Muestra Fluido

Revisión: sistema de fluidos

1. El propósito del sistema de fluidos es:

4. La suspensión de partículas es inyectada en el flujo de ____________________

7. Incrementar la presión de la muestra ___________________

9. Un “sample core” más ancho disminuye la resolución.

Dispersión de la luz y fluorescencia

La luz se dispersa en un ángulo pequeño en una cantidad proporcional a la superficie

Detector de dispersión lateral

Fuente de luz Detector de dispersión frontal

Figura 3: Dispersión de la luz por una célula

La medición simultanea de las dispersiones frontal y lateral, FSC y SSC respectivamente,

Sangre completa lisada

Figura 4: Identificación de subpoblaciones celulares basandose en FSC y SSC

Revisión: Dispersión de la luz

1. ¿Cuándo ocurre dispersión de la luz?

2. ¿Qué características de la célula contribuyen a la dispersión de la luz?

3. La luz dispersada en la misma dirección de incidencia del láser es llamada:

4. La señal de FSC es proporcional a:

6. SSC es proporcional a la ___________________ o ____________________ de la

7. La determinación simultanea de ____________ y ___________ puede permitir la

El rango de longitudes de onda en las cuales un compuesto fluorescente puede excitarse

El láser más comúnmente usado en citometría de flujo es el de ion-argón, la luz de 488

Figura 5: Espectro de absorción de 4 fluorocromos comunes

Figura 6: Espectro de emisión de los fluorocromos anteriores

Cuando un colorante fluorescente se conjuga a un anticuerpo monoclonal, puede usarse

Anticuerpos marcados Marcadores antigénicos

Figura 7: Unión específica a un antígeno de superficie de un anticuerpo conjugado a un fluorocromo

1. Cuando un compuesto fluorescente absorbe energía luminosa y después libera la

2. El rango de longitudes de onda a las cuales un compuesto fluorescente puede ser

3. Las longitudes de onda a las cuales emite un fluorocromo constituyen su:

4. ¿Cuál es el láser más comúnmente usado en citometría de flujo?

5. Los fluorocromos FITC y PE son excitados por la longitud de onda de un láser de

6. Dos fluorocromos comúnmente usados en citometría son ________________ y

7. Anticuerpos conjugados a fluorocromos son usados para:

Figura 8: Diagrama de la tabla óptica de un BD FACSCalibur

Figura 9: Diagrama de la óptica de adquisición en un BD FACSAria

Revisión: Tabla óptica

3. La _______________________ en el citómetro asegura que el láser en el

Revisión: Filtros ópticos

1. Hay filtros ópticos colocados en frente de los detectores para:

2. Un filtro de paso de banda 530/30 BP permite el paso de la luz entre _________ y

3. Un ______________________ es usado para dividir las señales de luz de acuerdo

4. Los filtros de _____________________ permiten el paso de longitudes de onda

6. SSC es proporcional a la _ o __ de la

7. La determinación simultanea de __ y _ puede permitir la