Fredy Alexander Pulido Quevedo Grupo: III-C

Inmunofluorescencia

¿Que acción tiene el Azul de Evans en la inmunofluorescencia?

El azul de Evans es un colorante soluble en agua, usado como medio de diagnóstico en

la lectura de la reacción antígeno-anticuerpo, siendo empleado como medio de
contraste. Esto se realiza con un microscopio de fluorescencia, en los controles y/o
pruebas positivas se aprecian los patrones nucleares con una fluorescencia intensa y
bien definida; el resto del tejido se observara con un tono pardo rojizo dado por este
colorante de contraste azul de Evans y zonas con un tono verde claro y brillante por la
fluorescencia de fondo u otro tono dependiendo del tipo del fluorocromo utilizado.

¿Cómo se titula un conjugado de inmunofluorescencia?

En la inmunofluorescencia se utilizan anticuerpos específicos marcados con un

fluorocromo, que es una sustancia que al ser excitada con una onda de luz corta, emite
otra longitud de onda más larga, que puede ser observada, y medida por fotometría. En
la inmunofluorescencia directa, este conjugado se aplica sobre el material, tejido o
muestra que se quiere examinar; y en la indirecta la muestra se cubre primero con
suero del paciente (contra el antígeno), luego se lava y hay si aplicamos el anticuerpo
antisuero humano, (el cual es obtenido mediante la inmunización en animales),
conjugado con el fluorocromo.

Conjugación

Se añade al suero un amortiguador o tampón carbonato de sodio 0,2 mol/L pH 9,5 o

carbonato-bicarbonato para mantener condiciones óptimas de pH (9.0) (se debe tener
en cuenta el pH adecuado para el fluorocromo a usar); se agita en baño de hielo
añadiendo el fluorocromo en un período determinado de tiempo, luego se aplica el
anticuerpo teniendo en cuenta su concentración mediante tratamiento con sales de
amonio saturado y se purifica mediante eliminación de las sales amortiguadoras y los
elementos utilizados como solventes del fluorocromo (acetona) por medio de diálisis. Se
utiliza extracción con carbón o filtración en columna de sephadex para eliminar las
sustancias fluorescentes que no reaccionaron lo cual puede ocasionar tinción
inespecífica.

= Indirecta

Directa

En el procedimiento de IFI, los portaobjetos con células de tejidos infectadas por

antígenos se cubre con diluciones seriadas del suero del paciente, luego de la
incubación y el lavado se agrega un anticuerpo anti- inmunoglobulina humana
producido en una cabra o conejo marcados con fluoresina (conjugado), después del
lavado se observan las láminas con un microscopio de fluorescencia y se determina el
punto final (la dilución mas alta del suero que produce inmunofluorescencia positiva).
Se pueden establecer los cambios en el titulo mediante el examen a los portaobjetos
con diluciones seriadas de suero de la fase aguda y de la convalecencia que se
ensayaron juntas en una misma prueba. También se pueden realizar los ensayos
indirectos utilizando conjugados marcados.

Los títulos se pueden determinar realizando el ensayo con diluciones al doble del suero
y leyendo la mayor dilución del suero, lo que da como resultado un grado no valido de
fluorescencia.

Comercialmente se pueden conseguir sueros marcados liofilizados o en solución

concentrada que se diluyen según las instrucciones, y deben ser titularlos antes de su
uso, esto se realiza enfrentando diferentes diluciones del conjugado específico, es decir
conjugado concentrado, y diluciones de este (por ejemplo: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32,
1:64, 1:128) con el antígeno, con el fin de establecer la mayor dilución o dilución de
punto final en la cual se observa mejor la fluorescencia, la cual nos ayuda a determinar
los resultados positivos o negativos del análisis cuando montemos y observemos la
prueba.

Tomamos la muestra del paciente suero en una dilución específica por ejemplo 1/32,
colocamos las diluciones del conjugado fluorescente y observamos con cual es la
mayor dilución en la que se observa mejor la fluorescencia.
 Bibliografía

1]http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/
minmuflures.htm

2]http://books.google.com.co/books?
id=jyVQueKro88C&pg=PA124&dq=como+se+prepara+un+conjugado+en+inmunofluorescencia
&hl=es&sa=X&ei=oVShT7yWBoGE8ATA8a2JCA&ved=0CC0Q6AEwAA#v=onepage&q=como
%20se%20prepara%20un%20conjugado%20en%20inmunofluorescencia&f=false

3]http://bvs.sld.cu/revistas/mtr/vol49_2_97/mtr11297.htm

4]https://docs.google.com/viewer?
a=v&q=cache:90wo6LZZ5FIJ:www.inmunoquimica.qb.fcen.uba.ar/
Inmunofluorescencia2.ppt+como+se+titula+un+conjugado+en+inmunofluorescencia&hl=es&gl=
co&pid=bl&srcid=ADGEESgasF1BjSnTEt5cMxUyg2v3ZsvzFFuTAzKHiiA6B4aUa1MoHdpe4S40
IfP6kS_U_T3ZHVSGw_3g7zdZT020JJqhBkZboZyphqiuqa_EwTlcm1T12PQejn9qnq1FScRf2aX
Vvq&sig=AHIEtbRj20alqWk0bRPaqfrbuze20MeobA

5]http://www.veterinaria.org/revistas/vetenfinf/vet_enf_inf_tripod/vetenfinftripodcomar/3histo.htm

6[https://docs.google.com/viewer?a=v&q=cache:KfWSQNvKMaIJ:inmunologia.umh.es/
AUTOANTICUERPOS%2520EN
%2520SUERO.doc+&hl=es&gl=co&pid=bl&srcid=ADGEESjQs0um-
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