INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

INGENIERÍA BIOQUÍMICA

LABORATORIO DE INGENIERIA DE BIORREFINERIAS

GRUPO: 8IX1 EQUIPO: 1

Práctica 1.
Sacarificación de productos lignocelulósicos

INTEGRANTES:
• Bello Guerrero Martin
• Crecencio Hernández Edgar Humberto
• González Sosa Salvador Cristian
• Ríos Moreno José Alberto

Profesor: Dra. Merlyn Alejandra Salazar Huerta

 FUNDAMENTO DE LAS TÉCNICAS:
Capacidad de absorción de agua (CAA):
CAA es un método que evalúa el cambio del volumen o del peso de un material en un periodo de
tiempo, en esta situación el material se expone a un volumen no necesariamente especifico de agua
y se deja un tiempo reposando para que haga absorción, después se retira el agua no retenida y se
calcula la diferencia de peso del materia seco con el del material húmedo, esto representara el peso
del agua absorbida.
Determinación de proteínas por el método de Lowry:
El método de Lowry es un método colorimétrico, empleado para la determinación cuantitativa de la
concentración de proteínas, el cual consta de dos etapas:
Primeramente, los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los
átomos de nitrógeno que se encuentran en los enlaces peptídicos, dichos complejos presentan una
coloración azul tenue, asimismo, se provoca el desdoblamiento de la estructura tridimensional de las
proteínas, de manera que los residuos fenólicos de tirosina quedan expuestos. En cuanto a la segunda
etapa, se lleva a cabo la reducción del reactivo de Folin-Ciocalteu, igualmente en medio alcalino, por
los grupos fenólicos de los residuos de tirosina, teniéndose al cobre como catalizador de dicha
reducción. Ahora bien, el ácido fosfomolibdotúngstico es el componente principal del reactivo de Folin-
Ciocalteu, el cual presenta una coloración amarilla, tal componente al ser reducido, en este caso por
los grupos fenólicos de los residuos de tirosina, da lugar a un complejo de color azul intensa, de
manera que la intensidad de tal coloración es proporcional a la concentración de proteínas. (Iribarren,
2015).

Figura 1. Determinación de proteínas por el método de Lowry.

Determinación de azucares reductores por el método de Fehling:

El método de Fehling utiliza dos reactivos, Fehling A (Sulfato de cobre pentahidratado) y Fehling B
(Tartrato de potasio y sodio; hidróxido de sodio), es un reactivo químico utilizado para diferenciar entre
los grupos funcionales carbohidrato y cetona solubles en agua, y como prueba para azúcares
reductores y azúcares no reductores, se fundamenta en el poder reductor del grupo carbonilo de un
aldehído. (Guirales,E. 1974)
Las reacciones que se desarrollan durante la prueba son las siguientes:

Figura 2.- Reacciones del método de Fehling. Realizada en ChemDraw

El cobre y el tartrato se combinan para formar un complejo que es atraído por el grupo nucleófilo OH
de los aldehídos y lo oxida a un grupo carboxilo (COOH). El cobre se reduce para formar óxido cuproso
(Cu2O) que se ve como un precipitado rojo.
Antes de esta etapa de la reacción, la energía calorífica facilita la creación del complejo intermediario
tartrato-cobre que oxida los aldehídos y forma Cu2O. La oxidación del aldehído con el complejo
tartrato-cobre es reversible y el aumento de la energía térmica ayuda a inclinar el equilibrio de la
reacción hacia la derecha, es decir, la oxidación de -CHO en -COOH y la formación de Cu2O como
precipitado rojo.
RESULTADOS
Capacidad de absorción de agua:
Tabla 1.0. Datos de masa obtenidos para determinar la capacidad de absorción de agua.
wi wf
Tubo.
Antes de decantar. (g) Después de decantar. (g)
1 18.5624 16.1928
2 17.8662 15.4925

Ejemplo de cálculo empleando el tubo 1:

Agua no retenida = wi − wf
Agua no retenida Tubo 1 = (18.5624 − 16.1928)g agua = 2.3696 g agua

Agua retenida = Agua agregada − Agua no retenida

Agua retenida Tubo 1 = (5 − 2.3696)g agua = 2.6304 g agua
 Tabla 1.1. Cantidad de aguar retenida por el salvado.
Tubo. Agua no retenida. (g) Agua retenida. (g)
1 2.3696 2.6304
2 2.3737 2.6263
(2.6304 + 2.6263)g agua
Promedio = = 2.6284 g agua
2
0.8 g agua
En el medio = 2.6284 g agua ∗ = 2.1022
g muestra seca g muestra seca
Determinación de azúcares reductores:
Tabla 2.0. Datos de la titulación por método de Fehling
Muestra ml titulados
3 (Día 4) 14.2
4 (Día 7) 10.6
Ejemplo de cálculo empleando la muestra 3:
0.05 g de azucar reductor ∙ 𝐹𝐷 8 mL
[Azúcar reductor] = ∗
mL titulados 0.5 g de salvado
0.05 g ∙ 20 8 mL 𝑔 𝑑𝑒 𝑎𝑧ú𝑐𝑎𝑟 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟
[Azúcar reductor] = ∗ = 1.126
14.2 𝑚𝐿 0.5 g de salvado 𝑔 𝑑𝑒 𝑠𝑎𝑙𝑣𝑎𝑑𝑜
Tabla 2.1. Concentración de azucares reductores en las muestras
Muestra g de azúcar reductor/ g de salvado
3 (Día 4) 1.126
4 (Día 7) 1.5094

1.6
g de azúcar reductor/g de salvado

1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Días

Gráfica 1.0. Concentración de azucares reductores en función del tiempo.

Determinación de proteínas por el método de Lowry:
Tabla 3.0 Datos de absorbancia obtenidos de las muestras problema y el control positivo.
Muestra. Absorbancia 500 nm (diluidas).
1 (Día 0). 0.395
2 (Día 2). 0.520
3 (Día 4). 0.580
4 (Día 7). 0.800
Control (+) 0.335
Ejemplo de cálculo empleando la muestra 1:
Abs problema · [Control] 8 mL
[Proteínas] = ∗
Abs control 0.5 g salvado
Abs muestra 1 · [Control] 8 mL
[Proteínas]Muestra 1 = ∗
Abs control 0.5 g salvado
0.395 0.5 mg proteína 8 mL
[Proteínas]Muestra 1 = ∗ ∗
0.335 mL 0.5 g salvado
mg proteína
[Proteínas]Muestra 1 = 9.4328
g salvado
Tabla 3.1. Concentración de proteínas obtenida de las muestras problema.
Muestra. Proteína (mg proteína/g salvado).
1 (Día 0). 9.4328
2 (Día 2). 12.4179
3 (Día 4). 13.8507
4 (Día 7). 19.1045
Graficando la Tabla anterior se obtiene la siguiente tendencia:

25

20
Proteína (mg/g salvado)

15

10

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Días

Gráfica 2.0. Concentración de proteínas en función del tiempo.

 DISCUSIÓN
La síntesis de proteínas por Pleurotus ostreatus se ve influenciada directamente por el tiempo de
incubación, esto se muestra en la gráfica 2.0, donde se determinó la cantidad de proteínas en 4 días
diferentes (día 0, 2, 4 y 7), donde el día cero corresponde el primer día del ensayo y el día y el último
día. Sin embargo, el método que se uso para determinar la concentración de proteínas en cada
muestra midió no solo las proteínas (o enzimas) implicadas en la degradación lignocelulosa, sino que
determinó la cantidad total de proteína presente en este microorganismo. En ese sentido, el hongo
Pleurotus ostreatus, conocido también como gírgola, setas, o orellanas, constituye una magnífica
fuente de proteínas por contener hasta 35 %, este dato es significativo si se compara con el contenido
en el arroz (7 %), en el trigo (13,2 %) y en la leche (25,2 %), todos expresados en peso seco. La
humedad de los hongos es alta, en general se considera alrededor del 90 % (proteína 3,5 a 4 % de su
peso fresco) (Ruilova & Hernández, 2014). Por lo tanto, se puede observar la diferencia significativa
entre la cantidad de azúcares reductores y la cantidad de proteínas, donde esta ultima es mucho
mayor en el día 7, debido a lo que se mencionó anteriormente.
Asimismo (Velasco & Vargas, 2004) ha demostrado también que el contenido de proteína de los
cuerpos fructíferos de Pleurotus ostreatus se puede mejorar enriqueciendo los sustratos con fuentes
orgánicas e inorgánicas de nitrógeno tales como harina de soya, salvado de arroz, trigo, alfarina o
simplemente urea lo cual también aumenta la productividad; aunado a lo anterior, en esta práctica se
usó salvado de trigo como fuente de carbono, con lo cual, dicho lo anterior, la producción de proteínas
por parte de este microorganismo fue significativa, esto puede corroborarse en la tabla 3.1, donde se
muestra que la cantidad de proteínas fue aumentando con respecto al tiempo de incubación,
expresado en mg proteína/mg de salvado. Aunque , como se menciona en este párrafo, podrían usarse
otros sustratos como fuente de carbono y/o nutrientes, con lo cual se esperarían resultados
semejantes, no obstante, la utilización se otros sustratos estarían en función de los objetivos que se
pretende alcanzar con el uso de este hongo; para este ensayo, el principal objetivo fue utilizar
Pleurotus o. para degradar residuos agroindustriales, en otros casos se usan para consumo, por ende,
se pretende cultivar Pleurotus o. como proteína unicelular.
Por otro lado, de la tabla No. 3.1 se puede mencionar que del día 0 al día 7 hubo un aumento de 10
mg de proteína/g salvado; en ese sentido (Cueva et al., 2017) demostraron que la cantidad de proteína
aumentaba con relación al número de días que fue incubado el hongo, siendo el ultimo día donde se
encontró la mayor cantidad de proteína, sin embargo, evaluaron la relación del contenido de nitrógeno
y carbono (N/C) a la cual la cantidad de proteína era máxima, así como también la mezcla óptima de
sustratos; en nuestro ensayo, no se evaluaron la relación de N/C y sustratos, aunque el
comportamiento de la síntesis de proteína fue similar. En otro estudio realizado por (Ceci et al., 2009),
donde en un cultivo del hongo Pleurotus ostreatus fueron analizados los macro y micronutrientes de
la materia prima y de los sustratos inicial y residual (post-cosecha), y que, en cuyo estudio se concluyó
que hubo un aumento del contenido proteico y de minerales en el sustrato residual en relación al inicial.
El aumento en proteína también puede deberse a que la fermentación se llevo en un medio sólido; ya
que la fermentación en estado sólido (FES) es un proceso que tiene grandes ventajas con respecto a
la fermentación sumergida tales como: mayor productividad, menor costo de inversión, bajo consumo
de energía, procesos más simples, menor cantidad de agua residual y mejor eficiencia en la
recuperación de los productos (Pineda et al., 2014).
En la tabla No. 2.1 es posible observar el comportamiento de los azucares reductores tomando como
referencia su concentración en dos días diferentes. Por otro lado, se puede observar en la gráfica
No.1.0 que el comportamiento de la concentración de azucares reductores es similar a la
concentración de proteínas evaluada, es decir, que aumenta progresivamente con el tiempo. Este
comportamiento fue observado por (Cerda, 2007) al observar que distintas especies de Hongos
aumentan la concentración de azucares reductores a medida que transcurre el tiempo, esto como
resultado de la degradación de materia lignocelulósica.
Por otro lado, (Ferrer, 2011) determinó que la producción de azucares reductores (como resultado de
la degradación de materiales lignocelulósicos) está influencia por múltiples factores como el estado de
fermentación, las temperaturas de fermentación y el pH del medio.
Respecto a lo realizado en la práctica, resulta importante mencionar que el desarrollar una
fermentación en estado sólido tuvo un efecto positivo en el aprovechamiento del sustrato (salvado),
ya que, (Ferrer, 2011) también demostró que la fermentación en estado sólido puede resultar en un
aumento de hasta 5 veces la producción de enzimas celulasas excretadas por los hongos.
Este fenómeno explica los altos valores de proteína determinados en la práctica y por otro lado explica
el porqué del aumento en el contenido de azucares reductores, esto ya que a mayor concentración de
enzimas secretadas mayor degradación de los carbohidratos complejos y por ende mayor
concentración de azucares reductores.
Otros estudios que respaldan la degradación efectiva de materiales lignocelulósicos por el hongo
Pleurotus ostreatus son los realizados por (Rojas, 2011). En ellos se demuestra la capacidad para
degradar la celulosa y la hemicelulosa en función de su concentración y en función de la concentración
de glucosa. En ambos casos se observó que la concentración de carbohidratos complejos disminuye
gradualmente mientras que la concentración de azucares reductores aumenta con el tiempo de
fermentación.
En cuanto al porcentaje de sacarificación o rendimiento de hidrólisis enzimática se observó que el
mayor valor alcanzado por Pleurotus ostreatus fue de 18,4 g de glucosa en la HE/g de glucosa
potencial en la fibra pre-tratada. Este valor demuestra que este hongo actúa de forma positiva
destruyendo la estructura del material, lo que favorece la hidrólisis enzimática posterior. Este resultado
resulta prometedor ya que, en comparación con pre-tratamientos físicos, por ejemplo cuando se
emplea ácido diluido sobre materiales lignocelulósicos, Cynara cardunculus genera un rendimiento de
Hidrolisis enzimática del 28,5% a 160° C, sin adición de ácido y un máximo de 80,2% a 200° C en
presencia de 0,2% de ácido sulfúrico.
Lo anterior supone que Pleurotus ostreatus tiene potencial en los procesos de sacarificación ya que
no requiere de pretratamientos de la materia a degradar ni condiciones extremas de temperatura.
En cuanto a las condiciones de crecimiento del microorganismo, (Rojas, 2011) demostraron que existe
un efecto significativo en cuanto al sustrato que se adiciona en la fermentación, esto ya que la mayor
productividad celular se obtuvo al cultivar los microorganismos en paja de trigo, seguido de la paja de
cebada. La evaluada productividad obtenida justifica la utilización de salvado de trigo en la práctica.
Cabe destacar que evaluar el efecto del sustrato en la excreción de enzimas resulta significativo para
dilucidar con que sustratos (desechos agroindustriales) resultaría optimo el implementar este
microorganismo. Por otro lado, la utilización de este microorganismo supondría bajo consumo de
energía, inversión de capital, condiciones ambientales favorables y reducción en la concentración de
inhibidores de fermentación, por lo que su estudio adquiere relevancia.
Finalmente, resultaría ideal el determinar las condiciones óptimas de manejo que permitan aumentar
la producción de azúcares fermentables por hidrólisis enzimática, así como disminuir el tiempo de
degradación de los materiales lignocelulósicos.

CONCLUSIONES

 El tiempo de incubación del hongo Pleurotus ostreatus influye directamente en la producción

de proteína. Así como también en la síntesis de enzimas implicadas en la degradación de
lignocelulosa presente en el salvado de trigo.
 Por otra parte, la cantidad de azúcares reductores producida por la sacarificación de
lignocelulosa (salvado de trigo) mostró un comportamiento similar al de la proteína, en ese
sentido, los azucares reductores aumentaban conformen pasaban los días, siendo el día 7,
donde se obtuvo mayor cantidad de azúcares reductores y proteínas.
 La fermentación en estado sólido mostró ser la mejor opción en cuento a la producción de
proteína, ya que el rendimiento de la proteína fue significativo, además; resulto ser un proceso
fácil y, como se mencionaba, no se consumía energía para mantener las condiciones de
fermentación que en una fermentación convencional.
 La sacarificación de productos lignocelulósicos utilizando biomasa, resulta ser un proceso
importante para la degradación de productos agroindustriales, en el sentido de obtener
productos de interés comercial, como los es la producción de un hongo comestible Pleurotus
ostreatus, el cual se utiliza en diversos alimentos; así como otros productos de interés
farmacéutico, medicina, alimentos, entro otros.

BIBLIOGRAFÍA

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