La Metilación Del Promotor Del Gen Epigenético Al Nacer Es Asociado Con La Adiposidad Posterior Del Niño

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ARTÍCULO ORIGINAL
La metilación del promotor del gen epigenético al nacer es
Asociado con la adiposidad posterior del niño
Keith M. Godfrey,1,2,3 Allan Sheppard,4,5 Peter D. Gluckman,4,6 Karen A. Lillycrop,1
Graham C. Burdge,1 Cameron McLean,4,5 Joanne Rodford,1,3 Joanne L SlaterJefferies,1
Emma Garratt,1,3 Sarah R. Crozier,2 B. Starling Emerald,6 Catharine R. Gale,2 Hazel M. Inskip,2
Cyrus Cooper,2,3 y Mark A. Hanson1,3
OBJETIVO—La variación genómica fija explica solo una pequeña proporción
del riesgo de adiposidad. En modelos animales, la dieta materna altera la
composición corporal de la descendencia, acompañada de cambios
epigenéticos en los genes de control metabólico. Poco se sabe acerca de si del riesgo de obesidad humana y enfermedad
tales procesos operan en humanos. metabólica (1,2). Sin embargo, hay un aumento epide
Las variaciones genómicas
miológica fqijas
evidencia ue re xplican
elaciona solo
los una fpracción
factores erinatales
DISEÑO Y MÉTODOS DE INVESTIGACIÓN: con Sequenom MassARRAY
medimos el estado de metilación de 68 CpG 59 de cinco genes candidatos en
con la adiposidad posterior y el riesgo de enfermedades metabólicas
el ADN del tejido del cordón umbilical de recién nacidos sanos. La metilación (3,4). Por ejemplo, la hambruna durante el embarazo está asociada
varió mucho en CpG particulares: para 31 CpG con una mediana de metilación con la obesidad en la descendencia adulta (5) y las variaciones
de $5 % y un rango de 5 a 95 % de $10 %, relacionamos el estado de normales en la composición corporal materna se relacionan con la
metilación con la dieta materna durante el embarazo y con la adiposidad del adiposidad posterior del niño (6). Aunque la comprensión de los
niño a la edad de 9 años. Se buscó la replicación en una segunda cohorte mecanismos subyacentes es limitada, los datos de modelos animales
independiente.
sugieren que los procesos epigenéticos son un vínculo importante
RESULTADOS: en la cohorte 1, la metilación del receptor X retinoidea entre el entorno de la vida temprana, por ejemplo, la dieta materna, y
(RXRA) chr9: 136355885+ y la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) chr7: el metabolismo y la composición corporal alterados en la descendencia adulta (7
150315553+ tenían asociaciones independientes con la masa grasa infantil Los procesos epigenéticos como la metilación del ADN y
ajustada por sexo (coeficiente de regresión exponencial [b] 17 % por
las modificaciones de histonas permiten que el entorno de
desviación estándar de cambio en la metilación [IC 95 % 4–31], P = 0,009, n
= 64 y b = 20 % [9–32], P , 0,001, n = 66, respectivamente) y % de masa
desarrollo module la transcripción de genes; muchos de
grasa (b = 10 % [1–19], P = 0,023, n = 64 yb = 12 % [4–20], P = 0,002, n = 66, estos cambios son estables a lo largo de la vida (10,11).
respectivamente). Los análisis de regresión que incluyeron el sexo y las La metilación regulada del ADN ocurre principalmente en una
marcas epigenéticas neonatales explicaron el 0,25 % de la varianza en la citosina inmediatamente 59 a una guanina (sitios CpG). Dichos
adiposidad infantil. Una mayor metilación de RXRA chr9: 136355885+, pero procesos están involucrados no solo en la diferenciación celular y
no de eNOS chr7:150315553+, se asoció con una menor ingesta materna de la impronta genómica de los padres, sino también en la plasticidad
carbohidratos al principio del embarazo, que anteriormente se relacionaba
del desarrollo a través de la cual el ambiente en los primeros años
con una mayor adiposidad neonatal en esta población. En la cohorte 2, la
metilación de cord eNOS chr7:150315553+ no mostró asociación con la de vida puede afectar la trayectoria del desarrollo, con efectos a
adiposidad, pero la metilación de RXRA chr9:136355885+ mostró asociaciones largo plazo sobre la expresión génica y el resultado fenotípico (12–
14). Por ejemplo, en la rata, la dieta materna desequilibrada
similares con la masa grasa y el % de masa grasa (b = 6 % [2–10] y b = 4 %
[1–7], respectivamente, ambos P = 0,002, n = 239). durante el embarazo induce cambios en la metilación del ADN y
CONCLUSIONES—Nuestros hallazgos sugieren que un componente modificaciones de histonas covalentes en las 59 regiones
reguladoras de genes específicos no impresos (1517) y afecta la
sustancial del riesgo de enfermedad metabólica tiene una base de desarrollo prenatal.
El análisis epigenético perinatal puede tener utilidad para identificar la composición corporal y el fenotipo metabólico posterior de la
vulnerabilidad individual a la obesidad y la enfermedad metabólica posteriores. descendencia. Los cambios inducidos en el fenotipo pueden
Diabetes 60:1528–1534, 2011 prevenirse mediante intervenciones nutricionales durante el
embarazo (18), o modificarse mediante intervenciones nutricionales
durante el período juvenilpuberal (19) o mediante intervenciones hormonale
Aunque los procesos epigenéticos que operan en el
desarrollo temprano han sido implicados en los orígenes de
la obesidad (3,11), todavía no hay evidencia directa de esta
1
Del Instituto de
Ciencias del Desarrollo, Universidad de Southampton, Southampton, Reino Unido; proposición en humanos. Además, ha habido un debate
la Unidad de Epidemiología del C
2
urso de Vida dRel
Southampton, MRC,
eino
3
Universidad
Unido; de
la Unidad SIouthampton,
de nvestigación Biomédica considerable sobre la importancia relativa de tales vías de
de Nutrición, Dieta y Estilo de Vida del NIHR, NHS TSouthampton,
rust de los Hospitales
Southampton,
de la URniversidad
eino Unido;
de
el
Instituto Liggins, Universidad de Auckland, Auckland, Nueva Zelanda; AgResearch, Hamilton,
desarrollo para determinar los resultados fenotípicos.
4
Nueva Zelanda; y el Instituto de Ciencias Clínicas de Singapur, Singapur, Singapur. Cualquier asociación entre el estado epigenético al nacer y
5 6
el fenotipo posterior permitiría una estimación de la posible
Autor para correspondencia: Keith M. Godfrey, kmg@mrc.soton.ac.uk.
contribución al desarrollo, independientemente de si tal
Recibido el 14 de julio de 2010 y aceptado el 27 de febrero de 2011. asociación fue causal o simplemente reflejó el estado de desarrollo.
DOI: 10.2337/db100979 Este
Razonamos que la medición específica de la metilación
artículo contiene datos complementarios en línea en http://diabetes. diabetesjournals.org/lookup/
suppl/doi:10.2337/db100979//DC1. 2011 por la Asociación Americana de Diabetes. Los lectores
del ADN en tejidos fetales humanos al nacer podría no solo
pueden usar este artículo siempre que el trabajo se cite correctamente, el uso sea educativo y proporcionar evidencia de que las influencias ambientales
sin fines de lucro, y el trabajo no se altere. Consulte http://creativecommons.org/licenses/by nc han afectado el desarrollo prenatal sino que, si luego se
nd/3.0/ para obtener más detalles.
correlacionan con el fenotipo posterior, proporcionarían un enfoque pa
1528 DIABETES, VOL. 60 DE MAYO DE 2011 diabetes.diabetesjournals.org

KM GODFREY Y ASOCIADOS
demostrando el papel del entorno prenatal en la predisposición a la y el cebador directo se marcó con un 10mer para equilibrar la Tm (59aggaagagag39).
adiposidad. La Tabla complementaria 1 enumera los amplicones, las secuencias de cebadores, la temperatura
de recocido de PCR y las coordenadas genómicas para las regiones promotoras extendidas
Aquí primero medimos el estado de metilación de CpG en los
medidas. El ADN tratado con bisulfito se amplificó por PCR (Qiagen HotStar Taq Polymerase) en
promotores de genes candidatos en ADN extraído del tejido del reacciones de 5 ml y se trató con fosfatasa alcalina de camarón (Sequenom) (20 min a 37 °C), se
cordón umbilical obtenido al nacer en niños que luego fueron inactivó con calor (85 °C durante 5 min) y se inactivó simultáneamente en Se llevó a cabo una
evaluados por adiposidad a la edad de 9 años (el estudio del Hospital reacción de transcripción in vitro/escisión de uracilo (reacciones de 7 ml) utilizando una mezcla de
Princess Anne [PAH]) (21) . Las mediciones de la metilación del reactivos de escisión T Sequenom. Los productos de escisión de la transcripción se desalinizaron
ADN perinatal se relacionaron con la adiposidad en la niñez posterior con 6 mg de CleanResin y se colocaron 20 nL en un SpectroCHIP de 384 almohadillas (Sequenom)
usando un nanodispensador MassARRAY (Samsung). Los espectros de masas se adquirieron
y con información sobre la dieta de la madre durante el embarazo.
usando un MassARRAY MALDITOF MS (BrukerSequenom) y la detección de picos, los cálculos
Debido a las fuertes asociaciones encontradas, buscamos replicar de señal a ruido y la metilación cuantitativa del sitio CpG se realizaron usando el software patentado
las asociaciones entre la metilación de CpG del cordón umbilical y la EpiTyper v1.0 (Sequenom).
adiposidad infantil en un segundo grupo independiente de niños de De acuerdo con las especificaciones del fabricante (www.sequenom.com), la concordancia entre
la Encuesta de Mujeres de Southampton (SWS) (22). las réplicas técnicas fue buena, las medidas duplicadas diferían en menos del 10% de metilación
en casi todos los casos. Excluimos del análisis las muestras que no dieron un producto de PCR
confiable o produjeron espectros con puntajes de confianza bajos (<2.9 en EpiTyper). Para los
fragmentos que contenían un solo sitio CpG, la metilación del ADN se calculó mediante la proporción
de fragmentos metilados y no metilados. Las limitaciones impuestas por el análisis de Sequenom
DISEÑO Y MÉTODOS DE INVESTIGACIÓN tratan los productos de escisión que contienen múltiples sitios CpG como unidades únicas, y los
Estudiamos dos cohortes prospectivas reclutadas prenatalmente en Southampton, Reino Unido. valores de metilación informados son promedios ponderados en toda la unidad (denominado grupo
En el estudio PAH, se reclutaron mujeres caucásicas de $ 16 años con embarazos únicos de menos CpG).
de 17 semanas de gestación y se administró un cuestionario validado de frecuencia de alimentos En todos los ensayos se incluyeron controles de calidad del ADN y sin plantilla, 0% y 100% de ADN
(23) a las 15 semanas de gestación; Se excluyeron pacientes con diabetes y concepciones metilado. La Tabla complementaria 2 muestra las distribuciones de los valores de metilación para
inducidas hormonalmente. Cuando los niños se acercaron a los 9 años, escribimos al 461 que aún los grupos CpG y CpG y el número de sujetos con mediciones disponibles.
vive en la localidad. Doscientos dieciséis (47%) asistieron a una clínica y la adiposidad se midió
mediante absorciometría de rayos X de energía dual (DEXA); 78 tenían ADN disponible de una Se llevó a cabo un análisis de pirosecuenciación (PyroMark Q96MD; Qiagen) para excluir
muestra de cordón umbilical recolectada al nacer y almacenada a 280°C. A ninguna de las madres polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) relacionados con dinucleótidos CpG, lo que daría lugar
se le administraron glucocorticoides durante el embarazo. a la pérdida del potencial de metilación. Brevemente, el ADN se amplificó por PCR y el producto se
hibridó con perlas de sefarosa recubiertas de estreptavidina y se desnaturalizó (NaOH 0,2 M) para
En el SWS, se reclutaron mujeres de 20 a 34 años cuando no estaban embarazadas; las que dar un producto monocatenario. Los nucleótidos se incorporaron a la cadena abierta de ADN 39 en
posteriormente concibieron fueron seguidas durante el embarazo y la descendencia (22). Para la que se libera pirofosfato y se usaron en una reacción de sulfurilasa que emite ATP, se midieron
replicar las asociaciones con la adiposidad encontradas en la cohorte de HAP, estudiamos a 239 en una reacción de luciferasa y se analizaron con el software PyroMark MD v1.0 (Qiagen) (29).
niños seleccionados por tener disponible tanto el ADN del cordón umbilical como las mediciones de
la adiposidad infantil. Análisis estadístico. Usando Stata 11 (StataCorp), las variables del estudio se transformaron
Ambos grupos se sometieron a medición de adiposidad por DEXA (estudio PAH, edad 9 años: usando FisherYates (30) (para mediciones de metilación) o transformaciones logarítmicas cuando
Lunar DPXL, software pediátrico, versión 4.7c; GE Corporation, Madison, WI [6]; SWS, edad 6 fue necesario para satisfacer los supuestos estadísticos de normalidad. A priori, restringimos el
años: Hologic Discovery, modo de escaneo pediátrico; Hologic, Bedford, MA). Los instrumentos se análisis a CpG con una mediana de metilación de $ 5% y un rango de 5 a 95% de $ 10%. En
calibraron diariamente; coeficientes de variación fueron ,1%. El seguimiento de los niños y la sujetos con PAH, primero usamos la correlación de Pearson (rp) y la regresión lineal para examinar
recolección/análisis de muestras se llevó a cabo bajo la aprobación de la Junta de Revisión la metilación de CpG en relación con la adiposidad del niño. Se construyeron modelos de regresión
Institucional (Comité de Ética de Investigación de Southampton y SW Hampshire) con consentimiento mutuamente ajustados que incluían sitios CpG significativamente asociados con cada resultado en
informado por escrito. Las investigaciones se realizaron de acuerdo con los principios expresados análisis univariados (P < 0,05). Debido a que las medidas de adiposidad infantil están en la escala
en la Declaración de Helsinki. logarítmica y las medidas de CpG son puntuaciones z, los resultados exponenciados se interpretan
como un cambio porcentual en las medidas de adiposidad infantil por cambio SD en la metilación.
Selección de genes candidatos. El ADN de 15 cordones umbilicales del estudio de PAH Para permitir la evaluación de la influencia de tener en cuenta el sexo del niño, los coeficientes de
seleccionados al azar se sometió a una precipitación de cromatina específica para la metilación, regresión exponenciados se presentan primero excluyendo e incluyendo el ajuste por sexo del niño.
seguida de hibridación con un microarreglo de oligómeros en mosaico comercial (arreglo NimbleGen Luego preajustamos todas las medidas de adiposidad por sexo y tomamos en cuenta la edad de la
Systems HG17_min_promoter [24]), que utiliza oligonucleótidos de 50 unidades posicionados en madre, la adiposidad (como variables continuas) y el tabaquismo durante el embarazo (como
promedio cada 100 pb desde 23 750 pb a +500 pb en relación con el sitio de inicio de la transcripción variable binaria, sí/no) incluyéndolos como covariables en el modelo de regresión; Luego
de 24.134 genes humanos. Enfocamos nuestro análisis inicialmente en un panel de 78 genes relacionamos la dieta de la madre con la metilación de CpG al nacer. Finalmente, buscamos la
candidatos, 28 seleccionados sobre la base de datos de animales de nuestro y otros laboratorios replicación de las asociaciones entre la metilación de CpG y la adiposidad infantil en la cohorte
(25,26) y 50 seleccionados de la matriz por tener la SD más alta entre sujetos en relación con la SD SWS. Las mediciones de SWS, tomadas en un rango de edad más amplio que las de los sujetos
de réplicas dentro del sujeto. Para este panel, identificamos aquellos con correlaciones entre el con HAP, se preajustaron por edad y sexo.
estado general de metilación del gen y las mediciones DEXA de adiposidad a la edad de 9 años y
de estos genes elegimos cinco genes para un estudio adicional basado en oligómeros individuales
que muestran evidencia de correlación con las mediciones DEXA a la edad de 9 años, plausibilidad
biológica y viabilidad de diseñar amplicones adecuados para el análisis Sequenom; los genes
seleccionados fueron el receptora del retinoide X (RXRA), la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS), RESULTADOS
la superóxido dismutasa1 (SOD1), la interleucina8 (IL8) y la fosfoinositida3quinasa, catalítica,
La mediana (rango intercuartílico) del peso al nacer, la edad, la
polipéptido d (PI3KCD) . Todos estos genes tenían asociaciones de fuerza comparable entre la
composición corporal infantil y la metilación general del promotor de genes y la metilación de
masa grasa y el % de grasa corporal en los valores de seguimiento
oligómeros individuales. Todas las coordenadas cromosómicas se basan en el ensamblaje del para los sujetos con HAP fueron 3330 g (3010–3790), 8,66 años
genoma humano de marzo de 2006 de la Universidad de California Santa Cruz (hg18). (8,52–8,73), 5,41 kg (3,97–8,41) , y 18,3% (14,4–27,0),
respectivamente. Los valores comparables para los 239 niños SWS
fueron 3485 g (3205–3773), 6,59 años (6,41–6,78), 4,60 kg (3,66–
5,69) y 23,4 % (19,7–27,6), respectivamente. Porcentajes similares
Análisis de polimorfismos de secuenciación y de un solo nucleótido. El ADN genómico se purificó a
partir de cordones congelados mediante digestión con proteinasa K y extracción con fenol:cloroformo.
de madres fumadoras en las cohortes PAH y SWS (21 vs. 24%,
La metilación del ADN se midió con el Sequenom MassARRAY Compact System respectivamente); la mediana de edad materna y el IMC antes del
(www.sequenom.com/). Brevemente, la amplificación específica del gen del ADN tratado con embarazo fueron más bajos en las madres con HAP (28 frente a 31
bisulfito fue seguida por la transcripción in vitro y el análisis mediante espectrometría de masas de años y 22,3 frente a 24,3 kg/m2 , respectivamente). Las características
tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDITOF) (27,28). El anteriores son similares a los valores generales de los participantes en las dos
diseño y los métodos del ensayo Sequenom fueron según el protocolo del fabricante. El ADN (1
Estudios de metilación de cohortes de PAH. La Tabla complementaria
mg) se convirtió con bisulfito usando el kit de metilación de ADN EZ (Zymo Research). Se diseñaron
cebadores de PCR específicos para el ADN convertido con bisulfito (Methprimer). Cada cebador
2 muestra la distribución del porcentaje de metilación de los 68
inverso contenía una etiqueta promotora de T7 para la transcripción in vitro (59 grupos CpG y CpG entre los 78 sujetos con PAH; 31 grupos CpGs/
cagtaatacgactcactatagggagaaggct39), CpG cumplían criterios a priori para su posterior análisis.
diabetes.diabetesjournals.org DIABETES, VOL. 60 DE MAYO DE 2011 1529

EPIGENÉTICA PERINATAL Y ADIPOSIDAD INFANTIL
En algunos sitios se observó una variación interindividual la masa grasa del niño no se atenuó después del ajuste por peso al
particularmente marcada en el porcentaje de metilación (por ejemplo, nacer y edad de la madre, tabaquismo e IMC.
RXRA chr9:136355885+ tuvo una mediana de 59 % con percentiles En esta población, anteriormente hemos relacionado una menor
5–95 4–99 %; eNOS chr7:150315553+ tuvo una mediana de 93 %, ingesta materna de carbohidratos al principio del embarazo con una
con percentiles 595 64100%). Las correlaciones entre la metilación mayor adiposidad neonatal (21). Al relacionar la metilación de CpG
de diferentes CpG fueron generalmente bajas (por ejemplo, rp = del cordón umbilical con la ingesta materna de carbohidratos al
20,03, P = 0,81, n = 55 entre los dos CpG anteriores). principio del embarazo, una mayor metilación de RXRA chr9:
De los 31 CpG con metilación variable por encima del umbral a 136355885+, pero no de eNOS chr7: 150315553+, se asoció con una
priori, siete tenían asociaciones significativas con la adiposidad del menor ingesta materna de carbohidratos (Fig. 1). La ingesta temprana
niño a la edad de 9 años (Tabla complementaria 3). La Tabla 1 de grasas y proteínas del embarazo temprano de la madre no se
muestra los resultados de los análisis univariados y multivariados de asoció con la metilación RXRA chr9:136355885+ del cordón (P = 0,7
los sitios CpG con asociaciones independientes significativas con la y P = 0,6, respectivamente), y no se explicó ninguna variación
adiposidad del niño. La comparación de los coeficientes de regresión adicional en la metilación RXRA chr9:136355885+ tomando
para las asociaciones univariadas y multivariadas de RXRA chr9: simultáneamente cuenta de la ingesta materna de grasas y proteínas
136355885+ y eNOS chr7: 150315553+ metilación con la masa grasa al principio del embarazo o la ingesta de macronutrientes al final del
del niño, el % de grasa y la relación entre la grasa del tronco y las embarazo. Al relacionar la metilación de CpG del cordón umbilical
extremidades muestra que el ajuste mutuo entre sí y el sexo tiene con el tamaño del bebé al nacer, solo tres CpG mostraron una
poco efecto sobre los coeficientes; Por lo tanto, las mediciones de correlación significativa con el peso al nacer ajustado por sexo y edad
adiposidad se preajustaron por sexo en análisis posteriores. La gestacional (PIK3CD chr1: 9609980+ [rp= 20.32, P = 0.013, n = 58],
metilación RXRA chr9:136355885+ tuvo asociaciones positivas con PIK3CD chr1 :9635676/79+ [rp= 20,36, P = 0,028, n = 37] y SOD1
la masa grasa infantil, el % de masa grasa (los diagramas de chr 21:31853827+ [rp= 20,27, P = 0,029, n = 65]). La metilación
dispersión se muestran en la Fig. 1 complementaria) y la relación RXRA chr9:136355885+ mostró una asociación débil con el sexo de
entre la grasa del tronco y las extremidades, con asociaciones los sujetos y la altura ajustada por edad (rp = 0,24, P = 0,054), pero
positivas similares para eNOS chr7:150315553+: re exponenciada no se asoció con el peso del bebé o el índice ponderal al nacer.
los coeficientes de progresión (b) (IC del 95 %) por cambio de SD en
la metilación fueron del 17 % (4–31), P = 0,009; 10% (119), p =
0,023; y 6% (012), P = 0,039, respectivamente (n = 64). Análisis de metilación en la cohorte SWS. Luego buscamos replicar
Los valores comparables para la metilación de eNOS chr7:150315553+ las asociaciones más fuertes encontradas en la primera cohorte
fueron 20 % (9–32), P < 0,001; 12% (420), p = 0,002; y 7% (213), P (eNOS chr7: 150315553+ y RXRA chr9: 136355885+ metilación de
= 0,007, respectivamente (n = 66). La metilación de RXRA CpG y adiposidad infantil) en la cohorte SWS (20). En estos 239
chr9:136355885+ y eNOS chr7:150315553+ tuvo asociaciones niños SWS, eNOS chr7:150315553+ no mostró asociación con la
positivas similares con el IMC del niño (b = 3 % [0–6], P = 0,037; y 4 adiposidad, pero RXRA chr9: 136355885+ mostró asociaciones
% [2–7], P = 0,001, respectivamente) . Independientemente de la notablemente similares y estadísticamente significativas (masa grasa,
metilación de RXRA chr9:136355885+ y eNOS chr7:150315553+, la b = 6 % [2–10], P = 0,002; % de grasa masa, b = 4 % [1–7], P =
metilación de SOD1 chr21:31853660/63+ también se relacionó 0,002, ambos n = 239) a los de los niños con HAP. Al igual que en la
inversamente con la proporción de grasa del tronco a las extremidades dcohorte de
el niño (P =P 0AH,
estas asociaciones cambiaron poco después de
,037).
Las asociaciones reflejan cambios clínicamente importantes en la tener en cuenta el peso al nacer y la edad materna, el tabaquismo y
adiposidad, de modo que la masa grasa media aumentó de 4,8 kg el IMC. Las Figuras 2 y 3 muestran las asociaciones graduadas entre
(17,3 % de grasa corporal) en el trimestre más bajo de metilación la metilación del cordón RXRA chr9:136355885+ y la masa grasa del
RXRA chr9:136355885+ a 6,6 kg (21,3 % de grasa corporal) en el niño y el % de masa grasa en las dos cohortes.
trimestre más alto de la distribucion Teniendo en cuenta la metilación
de RXRA chr9:136355885+ y el sexo, se explicó el 26 % de la La pirosecuenciación a través de RXRA chr9: 136355885+ en
variación en la masa grasa en niños con HAP, y los análisis sujetos SWS no mostró SNP del alelo C que pudieran explicar las
simultáneos mostraron que la asociación entre la metilación de RXRA chr9:136355885+
diferencias en la ymetilación observadas entre individuos.
TABLA 1
Análisis univariado y multivariado de la metilación de CpG del cordón umbilical en relación con la adiposidad infantil medida por DEXA a los 9 años
eNOS RXRA Varianza

chr7:150315553+ (%) P chr9:136355885+ (%) P Sexo (%) P explicada (%)
Masa grasa total (ln kg)
Análisis univariado 21 0.001 21 0.003 39 0.001
Analisis multivariable 19 0.002 23 0.001 47 0.001 44
Porcentaje de grasa (ln %)
Análisis univariado 13 0.006 14 0.006 42 ,0.001
Analisis multivariable 11 0.009 14 0.005 48 ,0.001 47
Proporción de grasa en el tronco y las extremidades (ln)
Análisis univariado 7 0.008 7 0.016 12 0.009

Analisis multivariable 8 0.004 7 0.021 11 0.059 28
Los valores son el cambio porcentual en la variable de resultado por cambio SD en la metilación de CpG y el valor de P. Las filas del análisis univariante muestran los
coeficientes de regresión y los valores P que relacionan cada uno de eNOS chr7:150315553+, RXRA chr9:136355885+ y el sexo con los resultados individualmente,
mientras que las filas del análisis multivariante muestran los coeficientes de regresión y los valores P para un análisis combinado de eNOS chr7: 150315553+, RXRA
chr9:136355885+, y el sexo en relación con los resultados, junto con la varianza explicada por el modelo multivariante. Para varianzas explicadas, n = 55.

promotor o cercano a él, otros estaban más distales y pueden estar
ejerciendo efectos a través de la regulación de otros genes.
Sin embargo, los datos indican posibles caminos mecanicistas, lo
que sugiere vías para estudios futuros. Nuestra observación de que
los CpG adyacentes o cercanos dentro del mismo promotor mostraron
diferencias en la fuerza de la asociación con la adiposidad del niño
sugiere cambios altamente específicos en la regulación transcripcional
de estos genes inducidos por el entorno de desarrollo, en lugar de
cambios generalizados en la metilación del promotor. Tanto la hiper
CpG (eNOS chr7: 150315553+ y RXRA chr9: 136355885+) como la
hipometilación (SOD1 chr21: 31853660/63+) en diferentes sitios se
asociaron con la distribución de la grasa corporal, lo que nuevamente
indica complejidad en el control transcripcional. La especificidad de
las asociaciones entre la metilación de una CpG individual y la dieta
materna y el fenotipo del niño respalda el concepto de un control fino
del desarrollo por parte de factores ambientales a través de procesos
epigenéticos.
HIGO. 1. Los carbohidratos maternos más bajos al principio del embarazo se asocian con una
Nuestra observación indica una posible vía mecánica involucrada,
metilación más alta de RXRA chr9:136355885+ del cordón umbilical en la cohorte de PAH. Los
valores son medios + SEM.
porque la inducción de la transcripción por RXRA depende de su
unión a ligandos, incluidos los receptores activados por proliferadores
de peroxisomas, involucrados en la sensibilidad a la insulina, la
DISCUSIÓN adipogénesis y el metabolismo de las grasas (31,32).
Este estudio proporciona evidencia novedosa de la importancia de la Además, RXRA chr9:136355885+ se encuentra en una región que se
contribución del desarrollo a la adiposidad posterior. Encontramos considera que contiene elementos reguladores positivos de la
que una mayor metilación de RXRA chr9: 136355885+ medida al transcripción (33). La figura 4 muestra la proximidad de RXRA
nacer se correlacionó fuertemente con una mayor adiposidad en la chr9:136355885+ a los sitios de unión propuestos para RXR, MAF,
niñez posterior en dos cohortes independientes. NFkB y AP1. La biología de los receptores de retinoides es compleja
Aunque estudiamos un subconjunto de niños en ambas cohortes, y el aumento de la metilación de RXRA podría estar actuando a través
estos se seleccionaron en función de la disponibilidad de sujetos y de una variedad de vías (34); sin embargo, una asociación entre el
especímenes, por lo que es poco probable que el sesgo de selección aumento de la metilación de RXRA y la adiposidad es consistente con
pueda explicar las relaciones observadas a menos que la asociación la observación de una expresión fuertemente disminuida de RXRA en
entre la metilación de RXRA y la adiposidad fuera diferente en el resto tejido adiposo blanco visceral de ratones obesos (35).
del grupo. grupo. Los datos se basan en experimentos con animales Además, el papel de la metilación del receptor de retinoides en las
que sugieren que el entorno de desarrollo actúa a través de procesos influencias del desarrollo sobre el riesgo metabólico posterior está
epigenéticos para ejercer una fuerte influencia en la composición respaldado por datos experimentales recientes que muestran una
corporal posnatal y la función metabólica (7–11). influencia de la dieta materna durante el embarazo en la metilación
de LXRA, un compañero heterodimérico de RXRA (36).
Nuestro estudio muestra que los componentes específicos del Los estudios de asociación del genoma completo sugieren que la
estado genético epi al nacer predicen la adiposidad infantil posterior. variación genética fija hace una contribución relativamente pequeña
Las asociaciones con la adiposidad se vincularon a CpG 59 al riesgo de obesidad, enfermedades cardíacas y diabetes (1,2);
específicas al sitio de inicio de los genes candidatos seleccionados. nuestros hallazgos plantean la posibilidad de que el componente del
Aunque algunos de los CpG estudiados estaban dentro de la región proximal entorno de desarrollo pueda ser igual o más importante. excluimos
HIGO. 2. El % de masa grasa del niño y la masa grasa a la edad de 9 años aumentan con una mayor metilación RXRA chr9:136355885+ del cordón umbilical en la cohorte de HAP.
Los valores son medios + SEM. *La masa grasa y el porcentaje de masa grasa están preajustados por sexo.

HIGO. 3. En una segunda cohorte independiente, el % de masa grasa del niño y la masa grasa a la edad de 6 años aumentan con una mayor metilación RXRA chr9:136355885+ del cordón umbilical en
sujetos SWS. Los valores son medios + SEM. *La masa grasa y el porcentaje de masa grasa están preajustados por edad y sexo.
la presencia de un SNP en RXRA chr9:136355885+ mediante cambios epigenéticos en el tejido del cordón umbilical humano. Datos
secuenciación, pero sin un análisis de todo el genoma no es posible recientes muestran que para algunas regiones genómicas la metilación
excluir un efecto genético de SNP distantes, que podría influir tanto parece en gran medida independiente del tejido de origen, mientras
en la metilación del ADN de una secuencia particular como en el que para otras existe una clara dependencia específica del tejido (39).
fenotipo del niño. Sin embargo, incluso si este fuera el caso, nuestros Muchos estudios epidemiológicos han demostrado asociaciones
datos indican claramente que las medidas epigenéticas al nacer entre el desarrollo fetal, a través de la medida sustituta del tamaño al
pueden tener valor pronóstico. Aunque los cambios epigenéticos nacer, y la función metabólica y la adiposidad posteriores (3,4), pero
pueden ser dinámicos, los estudios experimentales han demostrado la contribución del desarrollo a tales características fenotípicas sigue
que los factores ambientales que actúan sobre el genotipo durante el siendo incierta y controvertida.
desarrollo se relacionan con el perfil epigenético en la edad adulta Este estudio proporciona la primera estimación de la contribución del
(7,15), y hay estudios longitudinales en humanos que muestran que la desarrollo al fenotipo asociado con el riesgo de enfermedades
metilación del ADN suele ser estable en el tiempo (37) . Dichos humanas basado en medidas de la biología subyacente: nuestros
cambios pueden ser específicos del tejido y, a este respecto, el cordón datos para RXRA chr9: 136355885+ sugieren que una proporción
umbilical puede ser ventajoso porque contiene una alta proporción de sustancial de la variación en la adiposidad en niños prepuberales
tejido vascular fetal y células mesenquimales, que pueden ser puede explicarse por mediciones epigenéticas realizadas al nacer.
relevantes para la adiposidad posterior. Además, a diferencia de la Aunque nuestros datos son correlativos y, por lo tanto, solo pueden
placenta, es un tejido en el que la consistencia del muestreo entre implicar una asociación entre la metilación del ADN al nacer y el
individuos es más probable. Aunque el trabajo experimental en la rata fenotipo posterior, la importancia de la observación se mantiene
sugiere que los cambios de metilación inducidos por la dieta materna independientemente de si la metilación de RXRA está causalmente
pueden ser similares en el cordón umbilical y el hígado (38), se relacionada con el desarrollo de la adiposidad. Incluso si se trata
necesita más trabajo para determinar la relevancia de simplemente de una asociación no causal, el cambio epigenético
HIGO. 4. Diagrama esquemático de la región promotora de RXRA, que muestra la posición del grupo CpG en RXRA chr9:136355885+ (subrayado) y los sitios de unión del factor de transcripción vecinos.

El estado proporciona un marcador objetivo de la trayectoria de desarrollo involucrando los mecanismos de plasticidad del desarrollo (10).
alterada en el momento del nacimiento. A pesar de las limitaciones de las De hecho, los datos brindan evidencia sólida que respalda el papel de la
herramientas de evaluación de la ingesta dietética, el instrumento que plasticidad del desarrollo en la determinación del riesgo individual de
utilizamos está validado y proporciona información que se puede utilizar enfermedad metabólica. Tercero, los datos sugieren que los factores de
para clasificar la ingesta de nutrientes de las personas (23). desarrollo pueden ser más significativos en la contribución a la variación
La metilación de eNOS chr7:150315553+ se asoció con adiposidad fenotípica y al riesgo de enfermedad de lo que generalmente se considera.
posterior solo en la cohorte inicial. Esto puede reflejar un hallazgo fortuito En cuarto lugar, la asociación entre la metilación de RXRA chr9:136355885+
o diferentes características maternas en las dos cohortes, como la mayor y la ingesta de carbohidratos de la madre plantea la posibilidad de que las
adiposidad materna y la suplementación con folato materno en la cohorte condiciones al principio del embarazo puedan afectar la adiposidad del
SWS (22, 40, 41). Alternativamente, la proliferación de adipocitos es alta niño a través de esta vía. Esto brinda apoyo adicional al argumento de
durante el primer año de vida, pero luego permanece baja hasta una que todas las mujeres en edad reproductiva deben tener un apoyo
segunda fase proliferativa entre los 9 y los 14 años (42). nutricional, educativo y de estilo de vida adecuado para mejorar la salud
de la próxima generación. Finalmente, nuestros datos sugieren que las
Por lo tanto, los procesos que determinan la adiposidad a los 9 años medidas epigenéticas al nacer pueden tener un valor pronóstico y una
pueden diferir de los de los 6 años. La síntesis de óxido nítrico por eNOS utilidad potencial para los programas de seguimiento para optimizar la
promueve la diferenciación de preadipocitos (43). Por lo tanto, otra posible salud y la nutrición maternas para obtener beneficios a largo plazo para la
explicación es que la metilación de eNOS en el cordón umbilical marca la descendencia; sin embargo, la evaluación de esta posibilidad requerirá
capacidad de adipogénesis, que tiene una mayor contribución neta a la más investigación que correlacione las mediciones de metilación en la
adi posidad a los 9 años que a los 6 años. vida temprana con las de la vida posterior.
Nuestros hallazgos muestran fuertes asociaciones entre los marcadores
epigenéticos y la grasa corporal total y central infantil.
Más allá de estas asociaciones simples, el análisis multivariante indica EXPRESIONES DE GRATITUD
que las asociaciones explican proporciones sustanciales de las variaciones Este trabajo fue apoyado por WellChild (anteriormente Children
en los resultados, lo que enfatiza una importante contribución al desarrollo Nationwide); la Universidad de Southampton; el Reino Unido
de los fenotipos asociados con la disfunción metabólica y el riesgo de Consejo de Investigaciones Médicas e Instituto Nacional de Investigaciones
enfermedad. Cabe señalar que los genes para los que informamos efectos en Salud; la Fundación Británica del Corazón (a MAH y GCB); Investigación
no están impresos. La fertilización in vitro aumenta el riesgo de trastornos de la artritis del Reino Unido; el Centro Nacional de Investigación para el
de impresión (44), y se han informado efectos de metilación en genes Crecimiento y el Desarrollo de Nueva Zelanda (para PDG y AS); y la
impresos en descendientes de madres expuestas a hambruna durante Agencia de Singapur para la Ciencia, la Tecnología y la Investigación (a
varios períodos del embarazo (45,46), pero no se informaron asociaciones BSE). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio,
con el fenotipo. El estudio actual implica el entorno prenatal humano con la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la
cambios epigenéticos en genes no impresos y es el primero en vincular el preparación del manuscrito.
estado epigenético al nacer con una variación fenotípica posterior No se informaron posibles conflictos de intereses relevantes para este
clínicamente relevante. artículo.
KMG concibió el estudio, realizó el análisis estadístico, escribió el
primer borrador del manuscrito y revisó y editó el manuscrito. AS llevó a
La variación en el grado de metilación de los genes no impresos y en cabo la biología molecular y revisó y editó el manuscrito. PDG concibió el
la fisiología metabólica y cardiovascular posterior puede inducirse estudio, escribió el primer borrador del manuscrito y revisó y editó el
experimentalmente mediante la manipulación del entorno de desarrollo, manuscrito.
por ejemplo, alterando la nutrición materna o administrando glucocorticoides
durante el embarazo (8,9), a menudo sin afectar necesariamente el KAL concibe el estudio, realizó la biología molecular y revisó y editó el
tamaño al nacer de la descendencia. Aunque encontramos asociaciones manuscrito. GCB concibió el estudio y revisó y editó el manuscrito. CM,
entre algunos marcadores epigenéticos y el peso al nacer, estas fueron JR, JLSJ. y EG se encargaron de la biología molecular y revisaron y
asociaciones más débiles que aquellas con fenotipo posterior y fueron editaron el manuscrito. SRC realizó el análisis estadístico y revisó y editó
para diferentes marcadores; además, informes previos sobre la misma el manuscrito. EEB llevó a cabo la biología molecular y revisó y editó el
cohorte mostraron solo asociaciones modestas entre el peso al nacer y la manuscrito. CRG coordinó el fenotipado de los niños y revisó y editó el
composición corporal posterior (6). Debido a que el peso al nacer en manuscrito. HMI coordinó el fenotipado de los niños, ayudó en el análisis
humanos está influenciado por múltiples factores, incluido el peso y la estadístico y revisó y editó el manuscrito. CC ayudó en el análisis
altura de la madre al nacer y por la duración de la gestación (40), los estadístico y revisó y editó el manuscrito. MAH concibió el estudio, escribió
cambios epigenéticos pueden proporcionar un índice más sensible que el el primer borrador del manuscrito y revisó y editó el manuscrito.
peso al nacer de los efectos inducidos por el medio ambiente en el
desarrollo fetal.
Existen implicaciones potencialmente importantes de la asociación
fuerte y replicada entre la metilación de RXRA chr9:136355885+ y la
adiposidad posterior. En primer lugar, el efecto es considerablemente Sue Copland y Farhad Shaffei, Universidad de Auck
mayor que el de factores como el peso al nacer o la composición corporal tierra, brindó asistencia técnica.
materna, lo que sugiere que las mediciones epigenéticas realizadas en el
recién nacido pueden ser útiles para predecir la obesidad posterior y otros
resultados fenotípicos. REFERENCIAS
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La Metilación Del Promotor Del Gen Epigenético Al Nacer Es Asociado Con La Adiposidad Posterior Del Niño

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eNOS RXRA Varianza

Análisis univariado 7 0.008 7 0.016 12 0.009

1530 DIABETES, VOL. 60 DE MAYO DE 2011 diabetes.diabetesjournals.org

diabetes.diabetesjournals.org DIABETES, VOL. 60 DE MAYO DE 2011 1531

1532 DIABETES, VOL. 60 DE MAYO DE 2011 diabetes.diabetesjournals.org

diabetes.diabetesjournals.org DIABETES, VOL. 60 DE MAYO DE 2011 1533

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