PRIMERA SEMANA

ENZIMA INMUNO ENSAYO POR ABSORCIÓN

(ELISA)
→ Inmuno ensayo por absorción ligado a enzimas

● Técnica: ELISA (sensible y específica) por eso se le considera una prueba de

diagnóstico.
● Si recordamos: La inmunoprecipitación, inmunoaglutinación, inmunocromatografía
tendían a ser técnicas de apoyo en el diagnóstico ya que eran poco sensibles, poco
específicas por lo cual nos daba un diagnóstico de falsos positivos o negativos.
● En cambio la técnica de ELISA al ser mucho más específica y sensible se le atribuye el
nombre de técnica, es por eso que muchas pruebas que se emplean para la detección
ya sean virus o bacterias se basan en la técnica de ELISA porque es eficaz.
● Esta técnica también es compleja por la cantidad de reactantes y reactivos que emplea
para que se pueda realizar la detección, es un procedimiento bastante largo y requiere
a un personal capacitado para su ejecución.

● La técnica de ELISA como ya se mencionó, hoy en día se utiliza para el diagnóstico de

muchos patógenos, por ejemplo, lo que es la prueba llamada TORCH.
● La prueba TORCH que aplica la prueba de ELISA detecta anticuerpos IgG e IgM de
estos cuatro virus:

1. TO: Toxoplasma
2. R: Rubéola
3. C: Citomegalovirus
4. H: Herpes simple (tipo 1)

● Detección de antígenos contra la hepatitis B, C, detección de anticuerpos para Hepatitis

B, C, Rotavirus, Epstein Bar. Un sin fin de patógenos que se pueden detectar con esta
prueba.

Las técnicas superiores, más sensibles y Las que están por debajo (BAJA
específicas (ALTA CALIDAD) CALIDAD)

● Inmunofluorescencia ● Inmunoaglutinación
● Western Blot ● Inmunocromatografía
● PCR

● Esta prueba vendría a ser el punto medio de las pruebas de alta y baja calidad.

● Al hacer un diagnóstico con esta prueba pero si queremos corroborar podemos usar
otras pruebas.
 ● La técnica de ELISA tiene 3 tipos, la técnica se realiza en unos pocitos de acrílico o
plástico

● La placa de ELISA viene con varios componentes y reactivos, vienen 96 pruebas

para realizar. En la base de estos pocitos vienen adheridos anticuerpos o antígenos.
● Llega listo para hacer lo que necesitemos, entonces representaremos el primer tipo
de Elisa. Se aplicó el emolisito que se mostró.

1.- ELISA DIRECTA: detecta antígenos (AG) y anticuerpos (AB), cualquiera de los dos, no
a la vez, bien puede detectar antígenos o puede detectar anticuerpos.

➔ Si quiero detectar antígenos (AB), una proteína

viral, que tendría que tener aquí para que haya
interacción antígeno - anticuerpo
➔ /// lo que tendría que estar presente aqui para que
exista una interacción inmunitaria serían los
antígenos y anticuerpos ////
➔ Tengo aquí un anticuerpo (AB) y este va ser
específico para el antígeno que estoy tratando de
detectar
➔ El anticuerpo (AB) ya viene pegado a la placa o
pósito cuando yo añado la muestra, pueden ser
suero suero, plasma, orina, heces fluidas.
● Entonces cuando yo hago cualquier tipo de muestra y tengo la presencia del antígeno
(AG), ese antígeno (AG) tiene que ser específico para el anticuerpo (AB).
● El epítope del anticuerpo (AB) se unirá con el paratope del antígeno(AG). Se tiene la
reacción antígeno-anticuerpo.
● Como la técnica se llama enzima inmunoensayo o ensayo ligado a enzimas,
entonces se añade una enzima, son 2 tipos: la fosfatasa alcalina o la peroxidasa
de rábano picanto (HRP).
● Esta enzima lo que hace es reaccionar solamente cuando el antígeno y el anticuerpo
se han unido al complemento.
● Pero para que esta enzima reaccione necesita de un sustrato (le añadimos un
sustrato a la solución)
● La enzima consume ese sustrato cuando haya habido interacción antígeno-
anticuerpo
● Producto de la activación de esa enzima el medio que estaba de un color traslúcido
(u otro color característico) según el kit cambia de color, gracias a la acción de la
enzima que encuentra una reacción favorable.
● Si quiero detectar anticuerpos, debo tener adheridos antígenos al pocito, añado la
muestra del paciente que ha formado anticuerpos, se unirá específicamente al
anticuerpo del paciente, se añade la enzima, la cual tiene un sustrato.

¿Por qué se le conoce cómo directa? porque para que haya la reacción
enzimática no hay ningún intermediario, es directo.
2. ELISA INDIRECTA: Detecta Anticuerpos (AB),

➔ Cómo detecta anticuerpos (AB) sobre la base del pocillo debe haber antígenos
ESPECÍFICOS para el Anticuerpo (AG)
➔ Se le añade la muestra de mi paciente y si tiene los anticuerpos contra el antígeno
se unen y se llama anticuerpo primario; luego se añade un segundo anticuerpo es
específico para detectar al primer anticuerpo (o sea el anticuerpo que formamos
con el antígeno del paciente) y este es un anticuerpo secundario unido a una
enzima y esa pareja es el CONJUGADO.

¿Qué característica tiene el segundo anticuerpo?

Es específico para detectar el anticuerpo que estoy buscando

➔ Necesitamos que la enzima tenga que reaccionar así que añadimos el sustrato en el
medio, el segundo anticuerpo (anticuerpo secundario) cumple la función de detectar
específicamente la unión del antígeno con el anticuerpo, al hacer eso la enzima
consume el sustrato y hace que el medio cambie de coloración y tengamos esa
reacción.
➔ Si el paciente no produce anticuerpo es porque no esta contagiado, y sin anticuerpos
el conjugado no reaccionara porque no tiene a quien detectar y la enzima no va a
poder actuar entonces no habra cambio de color.
➔ El primer anticuerpo es el que produce el paciente, al anticuerpo secundario también
se le llama anti-anticuerpo

3. ELISA SANDWICH: Detecta antígenos

➔ Si detecta antígenos necesito anticuerpos debido a la placa, entonces tenemos al

anticuerpo que es un anticuerpo primario específico para el antígeno, se añade la
muestra del paciente y si este se encuentra infectado se obtiene el antígeno.
➔ Se reconoce el anticuerpo como reacciones proteicas, luego viene un anticuerpo
secundario, este se une también al antígeno.
➔ El segundo anticuerpo está unido a una enzima, ambos juntos se denominan
CONJUGADO. Y obviamente se añade el sustrato.
➔ En síntesis, ELISA sandwich: anticuerpo (pan) - antígeno (hamburguesa) -
anticuerpo (pan).

¿Qué tipo de ELISA se emplea para diagnosticar?

- ELISA sandwich y directa, ambas detectan antígenos. Pero se recomienda
más la sandwich por ser más específica

OJO: ELISA Directa: Puede detectar en esos positos solamente antígenos y en otro kit la
directa puede detectar anticuerpos, no en un solo pósito ambos. (Detecta tanto antígenos
como anticuerpos pero en pósitos distintos)
En la técnica de ELISA SANDWICH, al antígeno hay un anticuerpo que lo detecta pero
también se añade otro control de anticuerpo, detecta dos veces, es más específico,
por eso es más específica .

¿Qué sucede con cualquier tipo de enfermedad que estás previniendo y hay una
vacuna de por medio?
Producen anticuerpos contra el patógeno o el tipo de vacuna que te hayan colocado,
cuando dio dos de anticuerpos probablemente van a absorber a la vacuna.
Normalmente esos anticuerpos que se producen por las vacunas son otros tipos de
anticuerpos que se presentan en comparación a los anticuerpos que nosotros
generamos propios de la infección. Entonces no necesariamente son identificados
los anticuerpos producidos por la técnica de Elisa.
Los tipos de Elisa se diferencian por su estructura, cuando se producen en el
laboratorio estos Kits se trabaja por las estructuras de los anticuerpos, entonces yo
puedo producir anticuerpos los cuales se estudian y también puedo detectar
anticuerpos formados por la producción de las vacunas qué son otro tipo de
anticuerpos con diferente estructura.

Si quiero hacer diagnóstico:

● Necesito antígenos o el material genético
● De preferencia el más específico

CASO CLÍNICO : “Paciente de 45 años de edad que a los 8 años de edad sufre de varicela,
acude a consulta debido a la presencia de erosiones a nivel de la cabeza, espalda media
baja y estas erupciones no son normales de la varicela, sino que se convierten en ampollas
más grandes que abarcan más superficie del cuerpo.

★ A esto se le conoce como Varicela Zoster, paciente que posiblemente lo padezca,

pero se le pregunta “¿usted ya tuvo varicela de pequeño?” y responde que sí.
Entonces se corrobora con una detección de anticuerpos contra la Varicela
(anticuerpos de memoria) para ver si ya tuvo la varicela y ahora está teniendo la
Zoster.
★ Para esto se pide el tipo indirecta de ELISA porque es más específico, normalmente
en los diagnósticos y pronósticos se utilizan los tipos indirectas y las de sandwich.
La ELISA de tipo directa se utiliza para hacer indistinción.
★ Si yo encontrase anticuerpos contra la varicela en ese paciente indicaría que lo que
tiene ahora es una varicela zoster porque a la persona que ya le dio varicela cuando
es adulto y se infecta de nuevo con la varicela no le va a dar varicela zoster. Entonces
así se van detectando los patógenos.
En la inmunocartografia podría darme un falso positivo, en cambio la prueba de ELISA
detecta anticuerpos inducidos por vacunas y anticuerpos producidos por la defensa.

El margen de error de la ELISA es mínimo (3 - 5% de error), las ELISAS que puedan salir
positivas probablemente tendremos que colocarlas en espacios de inmunofluorescencia
como un Western Blot (es con la que se determina).

Te puedes apoyar con el diagnóstico de ELISA SANDWICH pero si tu quieres por tu

seguridad tienes que hacerlo aplicando otras técnicas superiores a esa.

Por ejemplo:

Caso Clínico: Tenemos un paciente que debuta con HIV, a este paciente normalmente se
le hace la prueba rápida, si se le vuelve a hacer otra prueba que se le llama contraprueba,
entonces si sale positivo nuevamente se aplica rápidamente una técnica de ELISA para
detectar los antígenos de HIV, si esta técnica sale positiva se informa que el paciente
presenta este virus para que se lo registre. Pero por seguridad nos aseguraremos con un
examen de inmunofluorescencia.
 SEGUNDA SEMANA

Detección de HIV antígeno y anticuerpo

ELISA SANDWICH: Ag
Entonces debemos recordar que la ELISA que vamos a trabajar hoy día es la ELISA tipo
SANDWICH, la cual detecta antígenos, entonces para que esto suceda, el pocito debe tener
adheridos los anticuerpos.

¿Qué características tenía este primer anticuerpo en

ELISA SANDWICH?
El primer anticuerpo tiene la característica de ser
específico para el antígeno.

La proteína P24 es la más utilizada en el

diagnóstico de VIH , entonces este primer
anticuerpo va a detectar una región específica del
P24; la muestra que se utilizara será suero o
plasma y es en estos que pueden haber
antígenos para detectar y es aquí donde tendrá
contacto específico con el primer anticuerpo.

Si seguimos con la ELISA TIPO SANDWICH, se

añade un segundo anticuerpo (anticuerpo
secundario), el cual lleva una enzima, es específico
para el Ag(p24), y lo último que nos faltaria para que
la reacción se complete sería el sustrato.
De esa manera nosotros aseguramos la detección
del antígeno p24 en los pacientes que queremos
diagnosticar, recuerda: si se hace diagnóstico
necesitamos detectar antígenos NO PUEDEN SER
ANTICUERPOS.
Pero qué sucede, la OMS nos dice que cuando se
quiere hacer una detección de HIV, lo ideal es
detectar antígenos y anticuerpos, entonces este
kit al inicio solo detectaba antígenos entonces al
recibir esa orden de la OMS lo que han hecho
ellos es añadir un reactivo en el cual se añade un
antígeno..
Se añade un antígeno que se pega a la fase del
pocito, este antígeno hará que el anticuerpo que
se ha formado producto que el paciente tuvo la
enfermedad. Este anticuerpo puede ser Ig G, Ig M o Ig A, cualquiera de estos tres
anticuerpos puede ser detectado en este kit.

Luego, como estamos haciendo diagnóstico, necesitamos una ELISA bastante robusta y
añadimos un segundo anticuerpo. En el gráfico se muestra una ELISA de tipo indirecta, se
añade sustrato y se va a detectar antígeno p24 y anticuerpos (G, M o A), si es que el
paciente ya estuvo infectado. Esta técnica detecta ambos.

OJO: La ELISA inicial es de tipo sándwich o sea solo detecta antígenos; pero la OMS
recomendó identificar ambos por eso se le añadió un paso de adición de antígenos.

Aquí tenemos el protocolo del kit que estamos utilizando nos dice:

1. Toma de muestra de sangre, nos llevará a separar suero o plasma, cualquiera

de esos dos líquidos biológicos son los que vamos a utilizar para hacer la detección.

2. Agregue 75 uL de la muestra y 75uL de controles positivos o negativos, bueno

nosotros vamos a trabajar con 4 pozos
 · El primer pozo será control positivo , se agregó 75uL del control positivo (el
control positivo es el antígeno p24 pero sintetizado), ese antígeno si tú te lo
tomas o te cae en una herida que está expuesta no te va a contaminar, porque
está trabajando en el laboratorio de tal forma que no es contaminante.

· El segundo control negativo , 75 uL de control negativo recordemos que los

controles negativos no reaccionan porque están hechos de cualquier agente que
no tenga que ver con la prueba.

· El tercer pozo (será la muestra 1) Aquí pondremos suero 1

· El cuarto pozo (será la muestra 2) Aquí suero 2

Suero 1 y Suero 2 de dos pacientes x, miren si ustedes siguen el gráfico que habíamos
hecho hace un momento tenemos aquí el anticuerpo y ahora nos dice que añadamos la
muestra que es suero o plasma, en ese suero o plasma puede haber antígenos, así es que
si hay antígenos, este antígeno se debe unir aquí al anticuerpo.

3. Nos dice agregar 25uL de Biotinlayed que es un reactivo a cada pozo

Este Biotinlayed contiene el antígeno que se va a añadir para detectar un anticuerpo,

entonces se añade también el antígeno.

Si es que el paciente está infectado recientemente va a ver presencia de los antígenos y va

a ser detectado a tiempo, es decir que el paciente ya estuvo expuesto al virus ya formó
anticuerpos, así que va a poder reaccionar.

4. Incubar a 37°C por una hora

· Durante ese tiempo el antígeno o anticuerpo (cualquiera que se encuentre en la

célula del paciente) va unirse específicamente al anticuerpo

· Se incuba para que haya una unión específica antígeno-anticuerpo

5. Eliminar el contenido de los pozos y lavar 3 veces con 350 uL de buffer de lavado

· Se lava con un detergente para eliminar el exceso de reactivos o componente que

haya en el medio

6. Añadir 100uL del conjugado HRP mixture a cada pozo

· Conjugado: Anticuerpo secundario más enzima

· HRP: Peroxidasa de rábano picante.

Eran dos tipos de enzima:

Fosfatasa alcalina
Peroxidasa de rabano picante HRP, se usa en ELISA
Nos faltaría añadir el sustrato pero antes nos dice:
7. Incubar 37°C por 30 minutos para que la unión específica entre el anticuerpo
secundario y el antígeno y/o el anticuerpo sea fuerte.

8. Lavar 3 veces para eliminar el exceso

9. Añadir 50uL de TMB Sustrato A y 50uL de Sustrato B

10. Incubar en OSCURIDAD por 10 min a 37°C

Si es que la union especifica de antígeno - anticuerpo se ha dado, la enzima va a consumir

ese sustrato, al ser este consumido, se verá que el medio donde se está dando a cabo la
reacción va a cambiar a color amarillo que va ser observable e incluso cuantificable.

11. Finalmente: Añadir una solución de STOP 50uL: solución STOP la cual va detectar
la actividad enzimática.

*El doctor ya agregó las muestras, los controles, el Biotinylated y se está incubando a 37°C
por hora.*
El Biotinylated tiene el antígeno que se va a encargar de detectar anticuerpos contra
el HIV.

DETECCIÓN DE Ag p24 → HIV

● Primero se toma una muestra del paciente para realizar una inmunocromatografía, el
descarte es por esta técnica, es una prueba rápida en forma de sachets.
● Si la prueba sale positiva se tiene que hacer una segunda prueba de
inmunocromatografía, es decir una contraprueba, y si sale positiva esta segunda vez,
necesitamos confirmar este resultado porque la inmunocromatografía no es un prueba
diagnóstica sino una de apoyo. La prueba diagnóstica a usar sería la técnica de ELISA
que detecta anticuerpos.
● Si esta técnica que detecta anticuerpos sale positiva entonces yo a mi paciente ya lo
puedo dar como diagnosticado de HIV. Y si sale negativa pues se informará negativo
para HIV
● Ahora hasta allí es suficiente para considerar a un paciente positivo o negativo para
este virus, pero si ustedes quieren ir más allá y asegurarse de sus resultados pueden
utilizar una inmunofluorescencia, Western Blot o la prueba molecular PCR.

En resumen el orden sería el siguiente:

Inmunocromatografía → ELISA → Inmunofluorescencia → Western Blot y prueba
Molecular PCR

● Ahora ya tenemos diagnosticado al paciente, el paciente es seropositivo (HIV positivo)

y probablemente luego desarrollará el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida
(SIDA).
 ● Entonces este paciente tiene que iniciar el tratamiento con los retrovirales o
antirretrovirales.
● Para el tratamiento con retrovirales se necesita saber que cantidad de virus están
infectando a nuestras células, entonces hacemos una carga viral para VIH, entonces
extraemos sangre de nuestro Px, separamos el suero/ plasma y de este extraemos RNA
viral y en base de eso hacemos la cuantificación del virus, se aplica los antivirales.
¿Qué es lo que debe pasar luego de 6 o 12 meses de tratamiento?
La carga viral debe bajar.
¿Qué pasa si la carga viral se mantiene o se eleva?
No están haciendo efecto los antirretrovirales porque genera resistencia al
tratamiento debido a que el VIH tiene genes: PR (proteasa), RT (transcriptasa
reversa), Gal, Pol. Todos estos genes pueden mutar,pero PR(proteasa) y RT
(transcriptasa reversa),estos dos primeros, son los genes más mutables del HIV.
Tienen muchas posibilidades de mutar y al mutar obviamente se hacen más
resistentes al tratamiento retroviral y por eso es que el px no puede recuperarse
porque siempre irá aumentando la carga viral.

Cuando fracasan los retrovirales, se recurre a las pruebas moleculares:

Pruebas moleculares →
ARTÍCULO: Determinación del genotipo y resistencia al tratamiento del VIH-1
Descripción del análisis:
- Determina el genotipo del VIH-1
- Basado en la secuenciación del genoma del VIH-1
- Detecta mutaciones en las regiones que codifican para la Proteasa (PR, codones 1
a 99) y Transcriptasa Reversa (RT, codones 40 a 299) del virus
- Ambas regiones codifican para los principales blancos del tratamiento con anti-
retrovirales.
- Mutaciones en esas regiones → Resistencia a tipos específicos de drogas
- Su identificación sirve en la monitorización y tratamiento de la infección por VIH-1
- Utilidad: Brindar medicina personalizada al paciente

Genotipo Proteasa (PR): Vamos a encontrar mutaciones de menor y mayor resistencia,

nos va a brindar el siguiente cuadro en donde se encuentran una lista de anti-retrovirales
indicándonos que ese virus según la secuenciación genética y las mutaciones encontradas
puede ser resistente a susceptible al tratamiento.

Genotipo Transcriptasa Reversa (RT): Vamos a encontrar otras mutaciones y también si

es que son susceptibles o resistentes al tratamiento.
¿Qué gano con esto?
Gano bastante tiempo y eficacia en el tratamiento, ya no estoy probando los primeros
antirretrovirales en donde espero 6-12 meses si le fue bien genial, si no le fue bien (hizo
resistencia) tenemos que probar con otros antirretrovirales.
En cambio si evaluamos de esta manera tenemos un abanico de posibilidades de que darle
al paciente y que no darle según la resistencia o sensibilidad del virus que está infectando
al paciente.
Tienen varias posibilidades para poder detectar, monitorear y aplicar tratamiento a un
paciente con HIV.

Si nosotros no añadimos la solución STOP a la reacción, no inhibimos la actividad de la

enzima y la enzima seguirá consumiendo al sustrato (estará activa), la coloración que se va
a dar en el medio se va a tornar cada vez más oscura, porque la enzima sigue trabajando.

Imagina a un paciente que recién está iniciando la enfermedad, la coloración del medio será
más clara porque no tendrá tanta cantidad de antígenos, pero si dejamos que actúe la
enzima va a hacer que ese color sea más fuerte, haciendo que el médico interprete que el
paciente ya está en una enfermedad totalmente aguda; es por eso, que debemos de colocar
la solución STOP para que detenga la actividad de la enzima.

CARACTERÍSTICAS DE LA REACCIÓN:
CUALITATIVO: Cuando la enzima trabaja
● Hay 2 pozos de color azul (son Positivos) al encontrar el antigeno la enzima a
cambiado la coloracion del medio.
● otros 2 pozos translúcidos. (Negativo) la enzima no encontró nada, no actúa.

→ Hasta ahora es un análisis cualitativo en donde nos indica que la enzima trabajó
(positivo) y la enzima no trabajo (negativo).
Probablemente nos puedan pedir que se amplifique este ensayo:
Debemos fijarnos del color en el medio:
Cambia a un color amarillo: nos permite medir una longitud de onda de la solución entre
310 - 560 nm. En el color turquesa no se puede medir en cambio con este si.

¿A mayor desarrollo de color, mayor absorvancia?

Al colocar en el espectrofotómetro en donde quiero medir las observancias de las
muestras de mayor concentración de color voy a obtener mayor absorbancia. Por
ende voy a tener un valor mayor número de antígenos y anticuerpos.

→ A mayor absorción o concentración de color, mayor absorvancia por ello voy a tener un
mayor número de antígenos y anticuerpos.

Entonces los dos pozos que estan de color amarillo, será mayor por una mayor cantidad de
canalitos, es cuantitativa.

Cuantificación: Se hace en solución STOP (para que no haya un cambio) está hecha en
base a ácido sulfúrico.

Preguntas de compañeros:

TERCERA SEMANA

EL MICROBIOMA, LA MICROBIOTA Y EL SISTEMA

INMUNITARIO
¿Qué es Microbiota? Conjunto de microbios que residen en el humano (en nuestro
cuerpo).

¿Qué es Microbioma? Conjunto de genes que codifican en forma colectiva.

En nuestro cuerpo hay una importante cantidad de microorganismos, generalmente

bacterias, y esas bacterias que habitan en ciertas partes del cuerpo están formando la mal
llamada flora normal (pueden ser beneficiosos, pero si hay una desregulación aparecen
diferentes enfermedades…)porque flora normal está relacionado a la parte vegetal y no
tenemos, ningún tipo de vegetal en nuestro cuerpo, debería decir.

nosotros estamos rodeados de bacterias, microorganismos. y esas bacterias las hemos ido
adquiriendo en nuestro nacimiento, en nuestra alimentación con la leche materna, pero
también las hemos ido adquiriendo en el transcurso del desarrollo de nuestra vida.

Desde el siglo XVI-XVII ya habían experimentos en los cuales los científicos de esa época
se daban cuenta que habían diferentes organismos que podían habitar nuestro cuerpo y los
iban clasificando dependiendo de dónde eran encontrados, finalmente nuestro cuerpo viene
a ser un ecosistema bacteriano es decir que residen muchas bacterias .

Esta imagen fue la que tuvo la revista de

National Geographic cuando se inició el
camino de la microbiota y microbioma y
representa a diferentes bacterias que
están habitando un medio.

- Microbiota: Conjunto de microbios que residen específicamente en una región

en el humano
- Microbioma: Conjunto de genes que codifican en forma colectiva.
El microbioma son los genes que se pueden regular e irregular y son propios de la
microbiota.

Si se quiere hablar a nivel genético, de los genes de un conjunto de bacterias tengo que
denominarlo microbioma.
Por ejemplo influirá los genes presentes en las bacterias que se encuentran en la cavidad
vaginal de las mujeres en cuanto a la fertilidad o infertilidad; influyen los genes de estas
bacterias, estas pueden modificar procesos que conlleven a la fertilidad o infertilidad.

El otro gráfico indica que definitivamente hay un

microbioma mucho más grande que el genoma
humano, ese conjunto de genes de la microbiota
es mucho más amplio que el mismo genoma
humano.
Estudio del microbioma ha sido posible gracias avances en tecnologías de
secuenciamiento de ADN

Entonces cuando uno quiere trabajar con la

microbiota y microbioma, la técnica más estudiada
y trabajada ha sido la técnica de secuenciación
genética tomó sus años e ingresos en la
investigación y la tecnología, la empresa llamada
ilumina.

Se escoge un lugar de trabajo donde habita una microbiota importante por ejemplo intestino,
cavidad bucal y a esa microbiota debo estudiarla, saber que tipo de bacterias hay en esa
microbiota, entonces se extrae el material genético de esa zona, extraemos ADN de las
bacterias y se trabaja con el gen 16S porque este gen está bastante conservado;
entonces para hacer estos estudios se necesita regiones bastante conservadas que no
sean mutables para que los resultados sean correlativos.

Vemos que se está amplificando la zona

conservada (zona amarilla) llamada gen 16S
del DNA ribosomal; una vez que se obtiene
esa región se hace la secuenciación
genética, se pasa por ese equipo de la marca
ilumina que hace ese trabajo normalmente y
nos bota diferentes tipos de secuencias
genéticas obviamente cada secuencia
genética es la de una bacteria que está
habitando en la muestra, las clasifica por
grados o familias y va formando los
denominados OTUs que son regiones
específicas por cada familia bacteriana, las agrupa y las dispersa creando diferentes
familias bacterianas que habitan una determinada región de nuestro cuerpo.

Los ratones gnotobióticos

→ El otro gran avance: Uso de ratones gnotobióticos permite experimentar con el
microbioma

Cuando hacemos algún experimento, por ejemplo para evaluar algún tipo de insulina que
nos vende un laboratorio “X”, lo que se hacia antiguamente se producía obesidad en las
ratas lo que conllevaba que la rata sea diabética y por eso se les administraba una comida
rica en grasas para poder probar el medicamento.
Hoy en día, se emplean ratones o ratas modificados a nivel de su genoma, estos animales
transgénicos ya nacen con diabetes porque se ha modificado su genoma, llegan a una edad
donde presentan todos los síntomas de la diabetes y se nos hace más fácil estudiarlos.
Hay otros ratones que nacen con cáncer, alzheimer, parkinson,etc, claro que son unos
animales muy costosos pero ya nos ayudan mucho para poder trabajar diferentes
experimentos.

¿Qué característica o qué particularidad les

llama la atención de esta foto?
Se observa que la persona está con sus
EPPS puestas porque tiene un cuidado de
bioseguridad, sin embargo no se sabe si la
persona se esté protegiendo de los
animales o esté protegiendolos. Pero en
este caso, como son animales
genéticamente modificados probablemente sea que la persona esté protegiendolos
para que no se contaminen.

En esta imagen podemos observar una especie

de globo en donde hay jaulas con animales, se
ha creado un microclima totalmente esteril para
que estos animales no se contaminen
Uso de ratones gnotobióticos permite
experimentar con el microbioma
Esto es porque a estos animales gnotobióticos son
animales a los que se les ha retirado su flora normal,
son animales totalmente estériles a cualquier bacteria
beneficiosa y no beneficiosa, también tienen
regenerada la mucosa intestinal y una actividad
enzimática digestiva diferente. Este animal está libre
de cualquier bacteria hace que podamos probar
cualquier bacteria y ver cómo puede influir en algún
proceso que se quiera estudiar.

Esta imagen muestra uno de los estudios que

apareció en el que se utilizaron ratones
gnotobióticos y ratones normales, y lo que se
hizo es tomar una muestra intestinal sacando
microbiota de una persona obesa y esta
microbiota se inoculó en el tracto digestivo del
animal gnotobiótico.

Este otro experimento se utiliza

una flora normal de una persona
no obesa y se inoculó en el ratón
gnotobiótico. Luego de una dieta
con las mismas caracteristicas la rata que recibió la microbiota del obeso se conviertio en
una ratita obesa y la que recibió de una persona normal vamos a decirle sin obesidad pues
esta como originalmente fue tratada.
Entonces qué quiere explicarme esto, que la microbiota también puede producir obesidad
y en ese experimento lo demostraron, ósea que la obesidad no solo es por una mala
alimentación, falta de ejercicio, etc., o algún problema hormonal, sino que está relacionado
también con la presencia de ciertos tipos de bacterias que influyen obviamente sobre
nuestros genes, relacionados a la alimentación y todo ello

Desarrollo del microbioma: De esterilidad a cientos de especies en 3 años

Otro ejemplo de la microbioma y microbiota es la esterilidad, como influye esta gran

cantidad de bacterias sobre el poder procrear o no, hay estudios en donde se han podido
demostrar ciertas bacteria influyen sobre la esterilidad en las mujeres, cierta microbiota
presente podría hacer que actives tus genes y estén relacionados a la infertilidad.

Antibióticos y factores ambientales alteran el desarrollo de la microbiota

Miren este estudio aquí, cómo alteran la presencia de las bacterias aquí tenemos 3 cuadros,
cada color aquí representa a un tipo de bacteria diferente.

→ En el diagrama superior, se tomaron

muestras en la cavidad vaginal de mujeres
vírgenes.

→ En el diagrama del medio, se tomó

muestras de mujeres que tuvieron su parto
por cesárea.

→ Y en el diagrama inferior, se tomó la

muestra de mujeres vírgenes, pero con
características atípicas

● Miren como los mapas de calor nos indican cómo van variando, van aumentando o
disminuyendo la presencia de ciertas bacterias, entonces hicieron este estudio para
luego comprobar que cuando nace un niño también hereda cierta microbiota
dependiendo como haya nacido.
● Las personas que nacimos por cesárea tenemos una microbiota distinta a las personas
que nacieron por parto normal, obviamente ya que estas pasan por la cavidad vaginal
y están en contacto con esa microbiota que está a nivel vaginal.
● Y se dice que esta microbiota presente, cumple funciones de defensas y se adhiere a
la piel y forma parte de una respuesta inmunitaria de la piel. Los nacidos por cesárea
no la tienen ya que no pasaron por la cavidad vaginal.
● Esta microbiota vaginal protege de las infecciones por bacterias atípicas, por ejemplo
al producir pH ácido. De igual forma las personas nacidas por parto normal también
tienen mayores defensas. Entonces la microbiota influye en los niños que nacen por
parto normal y niños nacidos por cesárea.
● La microbiota que aparece en una mujer virgen es totalmente diferente en mujeres que
ya han iniciado su vida sexual.

Comunidades en distintas partes del cuerpo son

estables y diferenciales

Tanto en el hombre como en la mujer, vamos a encontrar

en diversos lugares donde tenemos una microbiota
adecuada distinta que cumple funciones diferentes y que
muchas veces está relacionado con la actividad del
sistema inmunitario.
Factores que afectan la composición de la microbiota

Tenemos diversos factores que nos ayudan a que la

microbiota/microbioma se altera o pueda cambiar,
como es el:

• Sistema inmunitario del hospedero

Desarrollo del microbioma: Sobre la importancia de la leche materna

¿Habrá microbiota en la leche materna?

Sí, y esa microbiota nos la hereda nuestra madre cuando
estamos lactando y eso hace que se forme nuestra
microbiota a nivel del estómago y los intestinos.

Todo lo que se habló de microbiota y microbioma se está relacionando con el cáncer y el

sistema inmunitario

Aquí se observa el Ranking de cáncer por país

en Latinoamérica, por ambos sexos. Donde el
mayor cáncer que se observa se da en varones
es el Cáncer de próstata, luego le sigue el cáncer
de mama en mujeres, y finalmente el cáncer de
cuello uterino con mayor prevalencia a nivel del
país de Bolivia . Y el cáncer de pulmón que no
se puede percibir porque tiene una baja
incidencia.
El cáncer de mama en mujeres, se da en casi
toda latinoamérica, y Bolivia tiene muchos más
casos de cuello uterino.

Toda esta información se da con un

diagnóstico temprano:
Países que hacen tal diagnóstico: EEUU
60%, BRASIL 20%, MÉXICO 10%, demás
países de latinoamérica 10%

En el Perú el cáncer:
● Primera 1era Causa de muerte cáncer de mama
● 66 mil nuevos casos, y 33 mil muertes
● En arequipa 84 fallecidos hasta el año pasado en el primer semestres del 2021
● Cáncer de mama compromete el 19% de la población

Cáncer: (minuto 21:11)

● Las células se diseminan a los tejidos que las rodean
● Errores cuando las células se multiplican.
● Daños en el ADN
● Se pasan por herencia de padres a hijos
● El cuerpo elimina células con daños en el ADN antes de que se vuelvan cancerosas
● En cada persona es una combinación única de cambios genéticos
● Respuesta diferente.
Es necesario que reconozcan los riesgos que puede provocar un cáncer de mama, es
importante el dato HEREDITARIO DEL BRCA 1 y 2, Mutaciones en estos genes BRCA 1 y
2 desarrolla que tengas cáncer de mama en mujeres.
En un estudio las mismas mutaciones de mujeres peruanas con cáncer de mama eran
idénticas a las de mujeres asiáticas, se cree que es resultado de las migraciones, donde
las mutaciones remotas también hayan llegado a esta zona y se tenga mucha relación
mutagénica en cáncer de mama con los asiáticos ¡dato importante!
CÁNCER DE MAMA:
A parte de la genética,
tenemos:
La Nuliparidad: cuando una
mujer no tiene hijos.
Embarazo tardío: factor
importante.
Hoy en día muchas mujeres
jóvenes (24-30 años) no
desean tener hijos. En
EE.UU e Inglaterra y todos los
países de Europa las mujeres
tienen hijos por encima de los
35-40 años, por lo que los índices de cáncer aumentan en mujeres.
El comienzo del ciclo menstrual y la aparición de la menopausia también forman parte
de los factores que pueden llevar al cáncer de mama. Otros factores son: mala alimentación,
uso de bebidas alcohólicas, dieta rica en grasas, estos factores ayudan a que el cáncer se
incremente.
CLASIFICACIÓN MORFOLÓGICA E HISTOLÓGICA

Se pueden ver dos panoramas:

CARCINOMA DUCTAL: Aparición de miomas in situ, prácticamente solo hay bolitas de
grasa, ganglios, que se convierten en tumoraciones localizadas y son muy pequeñitas y son
totalmente formadas y no representan un problema. Prácticamente el 100% de las señoritas
tienen estos pequeños miomas que son normales y benignos.
..son muy pequeños y no es necesario revisarlos, el detalle es cuando empiezan a aumentar
como racimo de uvas y perder la morfología, eso ya es deterioro- CÁNCER ya se tiene que
operar,ya es invasivo .
qué es lo que cambia el microbioma en nuestro cuerpo?pues desde el nacimiento, ya que
nacemos diferente, el medio ambiente, estilo de vida ( alimentación), las enfermedades, ya
que se desregula y los medicamentos ( pueda que se reduzcan la microbiota, por el uso
indiscriminado de los antibióticos).
MICROBIOMA INTESTINAL : el microbioma presente en los intestino ya se esclareció que
tipo de bacterias tenemos en los intestinos dentro de estas tenemos: clostridium,
lactobacilos,estreptococos,etc.
Este tipo de bacterias que tenemos presentes en nuestros intestinos ayudan a potenciar
diferentes acciones en nuestro cuerpo, ayudan en la digestión. La Protección modulación
del sistema inmunitario adquirido ,lo regula,lo potencia.
Reconocimiento de patógenos cuando potencia a las células presentadoras del antígeno
para poder eliminar al patógeno, el 80% de células inmunitarias están alrededor del tubo
digestivo, estas células siempre se van a ver afectadas por la microbiota que está en el tubo
digestivo, teniendo una relación directa y otros como el cáncer.
¿Qué es la Disbiosis? Es la desregulación de la microbiota,es cuando la microbiota de
una región de nuestro cuerpo se ve afectada y esa cantidad de bacterias o microorganismos
se aumenta o reduce, varía totalmente.
¿Qué es lo que se ha podido observar en los estudios del cáncer de mama y la
microbiota del intestino?
que cuando se altera la microbiota del intestino ocurre una disbiosis y esta hace que se de
el cancer de mamam con mayor riesgo, ( en un cáncer de mama los estrógenos se van
incrementando y estos ingresan a la circulación sanguínea) ,estos estrógenos pasan por
nuestro hígado por nuestro sistema de control de tamizaje y existe una conjugación de los
estrógenos con una enzima llamada beta glucoronidasa
… Los estrógenos activan una enzima: beta glucoronidasa por medio de una hidroxilación.
Esto altera la microbiota en los intestinos. Por lo tanto, altas cantidades de beta
glucoronidasa ocasionan una disbiosis que permite que el cancer de mamá avance más
rápido

BIOMARCADORES Y MICROBIOMA
Un biomarcador ayuda a identificar una desregulación en el cuerpo.

Características de un biomarcador:
- Específico
- Sensible
- De bajo costo
- Constante y reproducible
Análisis de la Troponina y deshidrogenasa láctica: Marcador bioquímico del corazón,
detecta daño cardiaco (infarto)
MICROORGANISMOS CON POTENCIAL BIOMARCADOR

959 430 051 00:45:00 - 00:48:00 (CRISTHIAN SALAZAR)

PERSPECTIVAS A FUTURO:
uso de probióticos que ayuden al tratamiento para evitar desregulación de la microbiota
(disbiosis). Por ejemplo el yogurt que prevenga el cáncer de mama o cualquier producto
que inhiba la beta glucoronidasa.
se debe tener cuidado con las interacciones microbio-microbio

¿Cuál es la idea del paper?

● Hay una relación indirecta entre la composición del microbioma de nuestro organismo
con el desarrollo de enfermedades como la diabetes van a ver ciertos factores que
van a alterar la composición
 ● El uso de probióticos, donde señala específicamente al lactobacillus johnsonii que
ayuda en la prevención y en el tratamiento de pacientes obesos. Además, habla de la
fisiopatología y como se podría mejorar el tratamiento en sí, que es básicamente es
utilizando anticuerpos para bloquear receptores TLR-4 o quizás el CLR.
● Las cascadas de señalización independiente de interleucina 17, es un mecanismo
indirecto que promueve una respuesta antimicrobiana combinada con mecanismos de
reparación de la mucosa.

¿Cuáles son las interleucinas que afectan/desregulan o regulan en el caso de la

diabetes y su relación con el microbioma?
● Debido al aumento de la expresión del factor de regulación linfocítico FOXP3 en
células T en el páncreas, a su descenso en el íleon y colon y al aumento de IL-7 e
IFN-y en linfocitos CD4+ de los nódulos linfáticos pancreáticos, es que se altera la
composición del microbioma intestinal.

¿Cuáles son las bacterias más comunes que se presentan en los casos de diabetes y su
desregulación?
● Altas proporciones de Clostridium, Bacteroides y Veillonella y bajas de Bifidobacterium y
Lactobacillus, además de tener menor diversidad en la composición de la microbiota en
comparación con los controles sanos.
Con respecto a la figura 2 del papper: “Mecanismo de señalización dependiente de TLR4 en
diabetes tipo 1 y obesidad”

● La activación de TLR4 por elementos exógenos, como el lipopolisacárido bacteriano,

induce una cascada de señalización que implica a los reguladores MyD88, IKKβ y NF-κB.
Este último es responsable, junto con PI3Kγ y JNK, de la activación de genes implicados en
la respuesta inflamatoria, la resistencia a la insulina y el desarrollo de obesidad. (información
del papper)

Analizar el esquema:
● TLR4 es activado por el LPS
● ¿Cuál es la función de PI3Ky?
● ¿Función de NfXb sobre la expresión genética, que respuestas se dan cuando está activo?
 CUARTA SEMANA

VACUNA PFIZER, INMUNIDAD Y VARIANTES DE SARS

CoV-2

Todas estas cosas que se conocen como “fake news” solo desinformaron a las personas, pero la
empresa Pfizer y otras empresas que empezaron a trabajar en las vacunas tenían que cumplir
ciertos requisitos como hacer estudios preclínicos y clínicos, cuando uno tiene que introducir algún
fármaco necesita una evidencia científica que esta dado en estudios preclínicos que está
relacionado en estudio in vitro, células e in vivo con animales de experimentación y si estos estudios
preclínicos tuvieron una buena respuesta pasamos a los estudios clínicos que tienen diferentes
pases que se diferencian en los voluntarios, generalmente en la fase I hay muy pocos voluntarios
(40-60) y ya en las otras fases van ampliando hasta llegar a la fase III donde ya se habla de miles
de voluntarios y se van agrupando en diferentes grupos

por ejemplo: grupos etarios, grupos de mujeres o de hombres, grupo de personas que podrían tener
algún riesgo de una enfermedad hereditaria, grupo de personas con enfermedades autoinmunes u
oncológicas para poder ver cómo se comportaba esta vacuna y qué efectos podría tener.
Para inocularse una vacuna, esta tiene que tener eficacia (que te genere inmunogenicidad, que te
genere respuesta inmune frente a la infección) y seguridad. OJO: la VACUNA NO PREVIENE
CONTAGIO, SOLO PREVIENE QUE NO DESARROLLES LA ENFERMEDAD DE FORMA GRAVE.

Para poder ver como se comportaba esta vacuna y que efectos causaba

¿Pero una vacuna para que ustedes se la inoculen que tiene que tener? Porque ustedes se
colocaron la vacuna una dos y tres dosis

- Eficacia

- Seguridad
La vacuna debe de tener esas dos cosas, si no es eficaz ni segura no nos podemos colocar

Eficacia que quiere decir que genere inmunogenicidad, que genere respuesta frente a la
infección

OJO la vacuna no previene la enfermedad….

Y a pesar de eso ¿Por qué siguen inoculándose si tienen dudas?

• La organización mundial de la salud (OMS) emitió un comunicado dijo que todo laboratorio
que este produciendo vacunas y que este en las primeras fases de experimentación podía iniciar
su producción a gran escala por temas de pandemia y seguridad
• Era un tema de emergencia y ese tema de emergencia hizo que los laboratorios inicien su
producción con compromiso de completar e informar sus diversos experimentos
• Definitivamente estaba Sars Cov 1 y Mers y eso también ayudo
• Para marzo del 2020 ya estaba secuenciado todo el genoma Sars Cov 2, ya se tenia toda la
estructura del virus nuevo
• Entonces en base a eso empezaron el diagnostico y luego la prevención

Es un punto importante el conocimiento del hermano y primo hermano del SARS COVID 2 y a parte
la tecnología científica que ayudó mucho en la detección.
Todo eso nos lleva a tres fechas importantes: SE DAN CIERTOS CONOCIMIENTOS
● 05/2020: El laboratorio Barrinsents: crea dos tipos de vacunas
1. BNT 162b1: tenía mayores consecuencias efectos secundarios que la b2, no servirá
2. BNT 162b2: se uso esta por las falla de la b1, grandes producciones de esta vacuna
2 meses después el laboratorio pfizer inicia sus estudios FASE 3
● 07/2020:Estudios FASE 3, con 30 mil voluntarios …
2 meses después finaliza
● 09/2020: Finaliza FASE 3, 170 voluntarios positivo a COVID19…
● los inició con 30 mil voluntarios y luego se extendió a 43 mil voluntarios a los que se les
inoculó, dos meses después.
● Septiembre del 2020 finaliza la fase III de los 43 mil inoculados, 170 voluntarios dieron
positivo a COVID-19 se infectaron después de haberlos inoculado. En esa fase experimental
obtuvieron dos grupos:
○ Personas a las que se les inoculó el placebo (168 personas)
○ Personas a las que se les inoculó con la vacuna pfizer (2 personas)
Se hizo un estudio doble ciego, quiere decir
que las personas que inoculan reciben un sobre cerrado que lleva la jeringa con la dosis pero estas
personas no saben que están inoculando, la vacuna no lleva etiqueta para identificarla, y el paciente
voluntario tampoco sabe que está recibiendo.
De estos 170 voluntarios, a 168 se les inoculó el placebo, y solamente 2 tenian la vacuna BNT162b2,
y al resto de personas del estudio no les dio COVID tanto a las que recibieron el placebo como los
que recibieron la vacuna, así se evidenció una buena eficacia de la vacuna.
Hasta ese punto la vacuna era eficaz, aunque había que esperar unos meses más para ver las
consecuencias si es que las había. Esta vacuna es del tipo…
en emplear un fragmento del rna mensajero ,que fragmento se tomó del virus ? ...la proteína S..
sarco v2 tiene un genoma ,RNA viral que contiene en su interior exones de diferentes tamaños (5
prima -3 prima) y cada exón codifica para producir una proteína.. entonces lo que hicieron fue extraer
el exón que produce la proteína S la región que codificaba la producción de la proteína s.
 ● RNA mensajero que contiene a la proteína SPIKE, este lo incorporamos dentro de una
partícula lipídica → Nanopartícula, quien posee alta permeabilidad por lo que es fácilmente
absorbida

● La nanopartícula lipídica protege al material genético, si inoculamos sin esta protección las
RNAsas de nuestro organismo lo degradarían.
● ¿Por qué nos inoculan en el deltoides? Por su proximidad a la cadena linfática
● El fragmento de ARN de la vacuna solo produce proteína SPIKE, y esta llega a nuestras
células
● El pequeño fragmento de ARN viral, que es bastante permeable, llega a nuestras células y
se internaliza para inocular al RNA en el citoplasma.
○ Sobre el mito de que la vacuna modicifa nuestro AND: el fragmento de ARN viral de
la vacuna no esta en contacto con nuestro ADN; por lo que, no modifica nuestro ADN.
● El RNA se transcribe y traduce a través de los ribosomas de la célula y genera proteínas
SPIKE o espiga.
● La proteína SPIKE es llevada e inoculada en el RE donde CMH-1 (Complejo Mayor de
Histocompatibilidad 1) se expresa y presenta a la proteína SPIKE.

presenta a la proteína Spike (CMH-1) esa expresión hace que se active una célula importante, el
linfocito CD8 (LTCD8), específicamente los Th1: es un linfocito citotóxico es decir que produce
un receptor de contacto y va tratar de eliminar a la célula infectada.
A la vez se va activar la apoptosis que ayuda en la eliminación de las células infectadas.

Las proteínas SPIKE no solo interactúan a nivel del retículo, sino que salen por los ganglios a la
vía intersticial y se unen con células presentadoras de antígeno profesionales (CPA-P) como
pueden ser los linfocitos T.
Luego de eso las fagocitan, haciendo que la CPAP exprese el CMH-2 que va ser quien va
presentar a la proteína SPIKE a un Linfocito T CD4 (LTCD4).
El LTCD4 empieza a generar citocinas, mas especifico interleucinas 2 (IL2), interferón gamma
(IF-G)
Estas citocinas al empezar a producirse van a producir inflamación pero más importante producen
CD8, CD4, Linfocitos B (LB), Macrófagos.
En CD8 y CD4 aparecen las células de memoria
Estos linfocitos B, van a pasar a células plasmáticas y van a generar los anticuerpos de tipo IGG.
los Th1 van a producir una respuesta celular y la producción de IGG va ser en respuesta humoral
Esta es la idea de esta vacuna ya que es una de las vacunas más eficaz 95% vs otros tipos de
vacunas menos del 80%. Pero no significa que sea mala vacuna, cualquier vacuna que tenga más
del 70% de eficacia son vacunas aptas para protegernos. La vacuna no es la RAN, nosotros sí lo
somos.
Si nosotros no respondemos inmunitariamente de la forma más adecuada, cualquier vacuna que
nos pongan la respuesta será lenta o mucho más rápida.
En cuanto a las vacunas con virus atenuados, primero podría darse el caso que dentro de la célula
se replique genera una impresión mucho más rápida. La mayoría está dentro de la proteína spike.

Cualquiera de las vacunas que tenemos a la fecha han bajado su nivel de eficacia
Por ejemplo la Pfizer tiene una eficiencia del 30 al 40%, en cambio la Sinophar menos. Entonces
hoy en día estas vacunas ya no nos sirven mucho, nos protegen en una manera más lenta, al 95 -
100% de su eficacia inicial ya no lo hace.

Las vacunas que se están produciendo hoy en dia son vacunas …, van a inhibir más de un tipo de
variante, si las proteínas fallan, buen