INGENIERÍA DE BIORREACTORES

REPORTE DE PRÁCTICA DE LABORATORIO

PRÁCTICA No. 3: OPTIMIZACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
Miguel Ángel Ferrer Hernández
Tecnológico Nacional de México; Campus Morelia
Fecha de realización de la práctica: 06/10/2022
Fecha de entrega del reporte: 01/11/2022

Después de realizar la selección de la cepa para el bioproceso, el siguiente paso es la optimización de

un medio de cultivo, para que sea apropiado para el microorganismo. Los sistemas biológicos
requieren de sustratos que contengan carbono, hidrógeno, nitrógeno, oxígeno, fosforo y azufre, para
que estos puedan realizar sus funciones y, por lo tanto, generar un producto deseado. Sin embargo, el
medio de cultivo representa el principal costo en un bioproceso. Es por ello, que se requiere encontrar
una relación donde el costo de la obtención de producto sea razonable en contraste con el beneficio
económico del producto. Es así que, no sólo se necesita de conocimientos de bioquímica,
microbiología y cinética, sino que se requiere de otras áreas propias de las matemáticas como la
estadística inferencial, geometría analítica, cálculo vectorial, además de conocimientos básicos en
diseños de experimentos.
En esta práctica se propone analizar el crecimiento de una levadura de panificación, la biomasa será
analizada mediante valores de absorbancia, y la formación de productos (Etanol) por medio de un
refractómetro. Las variables de interés, diferentes concentraciones de sacarosa y sulfato de amonio,
necesarias para el desarrollo de la levadura. Como resultados, obtendremos una superficie de
respuesta para la formación de producto en base a las variables y valores de significancia que podrán
ser comparados con el resto de nuestros compañeros y con la bibliografía reportada.
OBJETIVO
Optimizar un medio de cultivo para la producción de etanol.
MATERIALES Y MÉTODOS
Un día anterior a la práctica, se inocularon 0.1 gramos de levadura de panificación en un matraz con
200 mL de medio de cultivo estéril YPD. Posteriormente esta suspensión madre, fue llevada a
incubación 𝑎 25℃, por 12 horas.
El día de la práctica, fueron preparados suspensiones en tubos de ensaye de sacarosa y sulfato de
amonio, variando las concentraciones para un volumen final de 8 mL.

No. Sacarosa g/L Sulfato de amonio g/L No. Sacarosa g/L Sulfato de amonio g/L
1 4 2 1 0.03 0.016
2 4 2 2 0.03 0.016
3 4 8 3 0.03 0.064
4 4 8 4 0.03 0.064
5 20 2 5 0.16 0.016
6 20 2 6 0.16 0.016
7 20 8 7 0.16 0.064
8 20 8 8 0.16 0.064

Tabla 1; Concentraciones de sacarosa y Tabla 2; Concentraciones de sacarosa y

sulfato de amonio para 1 L sulfato de amonio para 8 mL (Una regla
de 3) 1
Después de preparar las suspensiones de acuerdo a la tabla no. 2, fueron inoculados 0.1 mL de la
suspensión madre y se procedió a agitarlos suavemente por alrededor de 30 segundos (Para evitar la
aireación, pero propiciar la proliferación de los microorganismos). Enseguida fueron llevados a
incubación en una gradilla por 24 horas a 25℃. Transcurrido este tiempo, se miden las absorbancias
(A 600 nm) de cada uno de los tubos, procurando los cuidados de uso de un espectrofotómetro UV-
vis. Enseguida se colocaron alrededor de 3 gotas de cada una de las suspensiones en el refractómetro,
para medir el %v/v de etanol presente en la muestra.

RESULTADOS
No. SACAROSA SULFATO DE %V/V ABSORBANCIA
Tubo g/mL AMONIO g/mL ETANOL BIOMASA

1 0.03 0.016 0.1 0.045

2 0.03 0.016 0.1 0.047
3 0.03 0.064 2 0.025
4 0.03 0.064 2.5 0.084
5 0.16 0.016 5.5 0.069
6 0.16 0.016 6 0.088
7 0.16 0.064 7 0.085
8 0.16 0.064 7.6 0.059
TABLA NO. 3; Valores obtenidos para el %V/V de etanol, y la absorbancia para biomasa, según
las diferentes concentraciones de sacarosa y sulfato de amonio.

TABLA No. 4; Valores referentes al efecto y a la significancia obtenidos para el % V/V de etanol
con base en Chemoface.

Gráfico No. 1; Superficie de

respuesta para el % V/V de
etanol, a partir de sulfato de
amonio y sacarosa; Con base
en Chemoface

2
TABLA No. 5; Valores referentes al efecto y a la significancia obtenidos para la absorbancia en
función de la concentración de biomasa con base en Chemoface

Gráfico No. 2; Superficie de

respuesta para la absorbancia que
está en función de la concentración
de biomasa; Con base en
Chemoface

Para tener un análisis completo, hay que revisar los resultados obtenidos por nuestros compañeros
Ruiz Toledo et. Al. (2022), obtuvieron los siguientes valores;

TABLA No. 4A; Valores referentes al efecto y a la significancia obtenidos para el % V/V de etanol
con base en Chemoface, Ruiz Toledo et. Al. (2022)

Gráfico No. 1A; Superficie de

respuesta para el % V/V de
etanol, a partir de sulfato de
amonio y sacarosa; Con base
en Chemoface
Ruiz Toledo et. Al. (2022)

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TABLA No. 5A; Valores referentes al efecto y a la significancia obtenidos para la absorbancia en
función de la concentración de biomasa con base en Chemoface. Ruiz Toledo et. Al. (2022)

Gráfico No. 2A; Superficie de

respuesta para la absorbancia que
está en función de la concentración
de biomasa; Con base en
Chemoface
Ruiz Toledo et. Al. (2022)

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 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
La sacarosa presenta un mayor efecto sobre la producción de etanol, pero el sulfato de amonio es
necesario para la producción. De acuerdo con la gráfica no. 1 (Superficie de respuesta para el % V/V
de etanol, a partir de sulfato de amonio y sacarosa; Con base en Chemoface), podemos observar que
las bandas siguen una tendencia “diagonal” hacia las mayores concentraciones de etanol, pero que
aún dependen del sulfato de amonio. Los valores obtenidos por Ruiz Toledo et. Al. (2022), reflejan
está tendencia “diagonal” a una mayor concentración, pero con una menor pendiente. (Gráfico no.
1A). Esta tendencia diagonal, nos representa gráficamente que la sacarosa presenta un mayor efecto
sobre la producción de etanol, sin embargo, matemáticamente, esta relación gráfica puede ser
expresada con base a las tablas no. 4 y 4A. En la tabla no. 4 podemos observar que el efecto para la
producción de etanol es de 5.35 en contraste con el efecto del sulfato de amonio (1.85), por lo que la
relación es de aproximadamente 3, es decir que la sacarosa presenta un efecto 3 veces mayor, que el
sulfato de amonio para la producción de etanol. Ruiz Toledo et. Al. (2022), obtuvieron valores
similares (4.9, y 1.3; efecto para sacarosa y sulfato de amonio respectivamente), dando un valor en la
relación de aproximadamente 3.5, es decir, que, la sacarosa presenta un efecto 3.5 veces mayor, que
el sulfato de amonio, para la producción de etanol. Finalmente, de acuerdo a la bibliografía reportada,
Riza Porro et. Al. (2015), obtuvieron una relación de 3.2 en un medio rico en sacarosa. Ahora, de
acuerdo a la bioquímica del microorganismo la glicolisis es la vía por la cual la glucosa es oxidada a
piruvato, para la obtención de ATP, después para regenerar cofactores como el NAD+, el piruvato se
reduce a etanol. Posteriormente, el etanol es segregado por la levadura para evitar intoxicación. La
sacarosa al ser un dímero de glucosa y fructosa, aumenta la producción de etanol, más sin embargo,
las enzimas involucradas en la vía de la glicolisis son proteínas. La síntesis de proteínas requiere de
sustratos ricos en nitrogéno, como el sulfato de amonio. Por lo tanto, y con base a los argumentos
mencionados anteriormente, podemos decir que; la sacarosa presenta un mayor efecto sobre la
producción de etanol, pero el sulfato de amonio es necesario para la producción.
Para la producción de etanol, la sacarosa y el sulfato de amonio presentan efectos positivos de manera
independiente, pero de forma dependiente tienen un efecto negativo, un error experimental. De
acuerdo la tabla no. 4, el efecto de la sacarosa presenta un efecto de 5.35 para la producción de etanol,
en contraste con el efecto del sulfato de amonio con un efecto de 1.85. Sin embargo, ambos efectos
en conjunto tienen un efecto negativo; -0.3, pero el programa lo marca como un efecto no
representativo, esto quiere decir que, los resultados experimentales que afectan esta variable no tienen
una válides científica suficientemente representativa, para afirmar que el resultado obtenido es
correcto. Ruiz Toledo et. Al. (2022), obtuvieron un efecto dependiente positivo (0.1), por lo que
algunas de las posibles causas del efecto negativo pueden ser errores experimentales, como una
mezcla no homogénea, errores de operación con el refractómetro. Por lo tanto, Para la producción de
etanol, la sacarosa y el sulfato de amonio presentan efectos positivos de manera independiente, pero
de forma dependiente tienen un efecto negativo, un error experimental.
El efecto de las concentraciones de sacarosa y sulfato de amonio sobre la concentración de biomasa,
no era el que esperábamos, pero hubo errores de operación y de metodología. Como se mencionó
anteriormente la sacarosa, al ser un dímero se glucosa y fructosa, se metaboliza hasta piruvato y
posteriormente a etanol. El sulfato de amonio, proporciona nitrógeno para la síntesis de proteínas.
Las proteínas en el microorganismo, cumplen funciones como catalizar reacciones de síntesis y
degradación en el metabolismo intracelular, pero también degradan compuestos que se encuentren en
el exterior para que puedan entrar al microorganismo, se encuentran en la membrana, en el ADN (En
forma de histonas), dan rigidez estructural, funcionan como una reserva de energía etc. Son necesarias

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para el crecimiento del microorganismo, sin embargo, en la tabla no. 5, se puede observar que el
efecto de la glucosa, para el crecimiento del microorganismo, es de 0.0250, mientras que para el
sulfato de amonio, es de 0.0010, quiere decir que, el efecto de la glucosa es 25 veces mayor. Ruiz
Toledo et. al. (2022), obtuvieron un efecto un valor negativo independiente para el sulfato de amonio;
-0.1382 y un valor de 0.0767 para el efecto independiente de la sacarosa. (Tabla 5A), sin embargo,
ambos resultados no son representativos, por lo que no existe certeza de que sean científicamente
correctos. Por lo que, la aparición de estos singulares resultados, se pueden deber a que, cuando se
midieron las absorbancias, la sacarosa no había sido consumido completamente por la levadura,
estando suspendida en el líquido, por lo que, la sacarosa presenta un mayor efecto en cuanto la
absorbancia de la “biomasa”. Esto pudiera ser corregido si se duplica el tiempo de incubación, hasta
48 horas. Por lo tanto, podemos decir que la sacarosa y el sulfato de amonio, no tuvieron los efectos
deseados, pero se deben a errores experimentales y de metodología.
La preparación de las suspensiones, pudo haber afectado los resultados. Las suspensiones reportadas
en la tabla no. 2, fueron las preparadas para la experimentación, sin embargo, como se puede observar
son cantidades bastantes pequeñas, por lo que, su medición no es tan exacta. La masa había sido
cuantificada previamente utilizando una balanza y un arreglo de papel como recipiente contenedor,
por lo que, cuando se intentaba vaciar, parte de la sacarosa, por fuerzas de adhesión, quedaba retenida
en el papel. Esto pudo haber afectado las concentraciones de sacarosa y, por lo tanto, el experimento.
Es por ello, que la preparación de las suspensiones pudo haber afectado los resultados.
Algunas de las cosas que pueden mejorar para completar la práctica y obtener mejores resultados, es
la elaboración de una curva de absorbancia. El haber realizado una curva de absorbancia general para
todo el grupo, nos ayudaría a interpretar y analizar de una mejor manera, la concentración de biomasa,
es decir, el crecimiento del microorganismo. Si conocemos el valor de la ecuación de nuestra curva
de absorbancia, podemos determinar la concentración celular para cualquier muestra que haya
seguido el procedimiento con el cual fue elaborada la curva de absorbancia, optimizando el proceso
y obteniendo mejores resultados. Por lo tanto, la elaboración de una curva de absorbancia, es una
alternativa que puede complementar la práctica para la obtención de mejores resultados.
Sin duda, una de las cosas que más me llamó la atención, fueron los resultados arrojados por
Chemoface, en cuanto al efecto y la significancia. (Tabla 4 y 4A), ya que, adjuntos a ser un indicador
cuantitativo del experimento, representan, como se aprovecha lo que se invirtió económicamente en
el medio del cultivo y si los resultados obtenidos son confiables. De acuerdo a nuestro experimento
(Gráfico no. 1 y tabla no. 4). Para la producción de etanol, la sacarosa tiene un efecto 3 veces mayor
que el sulfato de amonio, esto quiere decir que nuestro medio de cultivo optimizado, en una analogía,
obtendremos el mejor rendimiento de etanol/sustrato, en un medio que, por cada unidad de
sulfato de amonio, debe haber el triple de sacarosa, para procurar la producción de etanol en base
al crecimiento del microorganismo. Por eso, ha llamado mi atención.
Por último, más que la utilidad de los resultados numéricos obtenidos en está práctica, creo que lo
más destacable es el conocimiento empírico acerca de la optimización de medios específicos de un
bioproceso. El principal costo en un bioproceso reside en el medio de cultivo, en el sustrato base, es
por ello que es importante, optimizar este medio de cultivo, con la mayor producción de sustrato
posible, al menor sustrato posible utilizado, con el fin de elevar las ganancias. Por lo tanto, considero
que el conocimiento empírico obtenido en está práctica, es lo de mayor utilidad en la misma.

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 CONCLUSIÓN

En nuestra formación integral como ingenieros, la optimización de medios de cultivo, es una parte
fundamental en el diseño de un bioproceso. Para ello, recurrimos a conocimientos previos, como
bioquímica, microbiológica y cinética química y biológica, pero también a ramas de las matemáticas
como la estadística inferencial, que nos ayuda a determinar el efecto de un a variable en un resultado
de una manera cuantitativa, y si los resultados del experimento son confiables. Por lo tanto, en efecto,
llevamos los conocimientos de la teoría a la práctica al ver que nuestro microorganismo responde a
un sustrato, pero también analizamos de una forma numérica cuanto influyen.
REFERENCIAS
A. Warren L. McCabe, Julian C. Smith,Peter Harriot . (2007). OPERACIONES UNITARIAS
EN INGENIERÍA QUÍMICA. México, DF: Mc Graw Hill Latinoamérica.
B. Francisco Castillo Rodríguez. (2005). Biotecnología Ambiental. Madrid, España: Tébar
C. M. T. Madigan, J. M. Martinko, J. Parker. Brock . Biología de los Microorganismos. 12a
(2009) o 10a (2004) Ed. Prentice Hall-Pearson Education
D. Ruiz Toledo et. Al. (2022); Optimización de medios de cultivo y condiciones de operación;
Instituto tecnológico de Morelia.
E. Riza Porro, et. al. (2015). Diseño de un medio de cultivo con base de sacarosa, Instituto
cubano de investigaciones de los derivados del azúcar de caña. Cuba
F. Trudy McKee, James R. McKee (2003). Bioquímica, la base de la vida, McGraw Hill, Madrid
España.