Control laboratorio biocel

Compartimentalización en la célula eucarionte

- Características de los organismos
1) Complejidad estructural → esto refleja la diversidad de funciones de los
organismos vivos
- Existen organismos unicelulares (una célula) y multicelulares, siendo estos últimos
los que presentan especializaciones estructurales y funcionales
Estructuras especializadas en células eucariotas:
1) RE → conjunto de membranas, derivado de la envoltura nuclear, el cual se extiende
a través del citoplasma, siendo que aquellas membranas delimitan un espacio central
llamado lúmen → estructural y funcionalmente se diferencia el REL (encargado de la
detoxificación síntesis de lípidos y esteroides, estando muy desarrollado en las
células del hígado y glándulas) y el RER (en su cara externa o citoplasmática hay
unidos ribosomas, encargados de la síntesis de proteínas de transmembrana y de
secreción, etc.), teniendo estos en común que ambos tienen continuidad estructural y
están formados por una única membrana
2) Complejo de golgi → constituido por cisternas (serie de sacos aplanados y apilados)
en torno a la cual hay una serie de vesículas → posee 3 zonas o dominios
● Cis o zona de formación → Conjunto menbranoso cercano al RE, en
donde llegan vesículas del RER, las cuales al fusionarse con el CNG
le da membranas y glicoproteínas (estas sufrirán modificaciones)
● Medial o zona media → recibe las vesículas del golgi cis, ocurriendo
nuevas glicosilaciones o desglicosilaciones
● Trans o zona de maduración → recibe las vesículas del golgi medial,
las que serán modificadas de nuevo y desde aquí se desprenden
vesículas que tendrán distintos destinos según un proceso de
segregación (propio del golgi)
3) Mitocondria → Posee una membrana interna y una externa → su función principal es
la respiración celular (para ello tiene sistema de macromoléculas altamente
especializado) → tiene su propio material genético, duplicable y capaz de sintetizar la
> de sus proteínas → su n° depende de las necesidades energéticas de la célula
4) Peroxisomas → organelos membranosos que en su interior poseen enzimas que
participan en reacciones oxidativas → participan en metabolismo de lípidos →
glioxisomas (especializados en metabolismo vegetal)
5) Lisosomas → vesículas polimórficas (diferente estructura y composición) → tiene un
membrana y en su interior hay enzimas hidrolíticas o hidrolasas que degradan
compuestos orgánicos → su función es la degradación por heterofagia (desde fuera
de la célula) y la autofagia
6) Cloroplastos y plastidios → los plastidios son organelos membranosos con función
metabólica y de almacenaje , destacándose entre ellos los cloroplastos que hacen la
fotosíntesis y tienen color verde gracias a pigmentos como la clorofila → amiloplastos
son plastidos incoloros y los leucoplastos almacenan sustancias de reserva (almidón)
y los cromoplastos tienen presencia de pigmentos coloreados
7) Núcleo → contiene el material genético → + fácil de ver en microscopía óptica , da
lugar al núcleo verdadero, el cual puede tener diversas formas (esféricos, ovoides,
planos, lobulados, etc.) → durante la interfase presenta una conformación
● Envoltura nuclear, membrana nuclear o carioteca → esto limita y
separa del citoplasma → tiene una doble membrana que delimita un
 espacio perinuclear → cada cierta distancia las dos membranas se
fusionan y delimitan el complejo del poro nuclear que regula el
traspaso de sustancia de núcleo - citoplasma → la MNE se continúa
con la membrana del RE → en la superficie interna está la lámina
nuclear (engrosamiento proteico, capa electrodensa)
● Cromatina → ADN + histonas (proteínas básicas) → las histonas se
agrupan en unidades globulares en torno a la que se enrolla una fibra
de ADN dando 2 vueltas formando, los nucleosomas que dan la forma
de cuenca dee collar a la cromatina y se tiñen débilmente → zonas +
compactas, + condensadas y que se tiñen con mayor intensidad
corresponde a la heterocromatina → la cromatina se compacta por el
enrollamiento de los nucleosomas, formando así los cromosomas
● Nucléolo → cuerpo esférico - ovoide, tamaño variable y sin membrana
→ compuesto por ribonucleoproteínas ( ARN + proteínas) → aquí se
hace el 1° armado de las subunidades de ribosomas que completan
esto en el citoplasma

Distintos tipos de glóbulos blancos o leucocitos

Son un tipo de glóbulo sanguíneo (célula de la sangre) que se produce en la médula ósea y
se encuentra en la sangre y el tejido linfático. Los glóbulos blancos son parte del sistema
inmunitario del cuerpo y ayudan a combatir infecciones y otras enfermedades. Los tipos de
glóbulos blancos son los granulocitos (neutrófilos, eosinófilos y basófilos), los monocitos y
los linfocitos (células T y células B)

Los glóbulos blancos son los encargados de defender al organismo de las infecciones. Se
producen a partir de la célula madre en la médula ósea, donde se almacenan, y se liberan al
torrente sanguíneo cuando el organismo los necesita. Los glóbulos blancos viven en la
sangre unas doce horas. Se diferencian de los glóbulos rojos porque poseen núcleo y son
más grandes. El recuento total de glóbulos blancos es de 5.000 a 10.000/mm3 y hay cinco
tipos distintos: neutrófilos, eosinófilos y basófilos, que forman el grupo llamado granulocitos,
los linfocitos y los monocitos.

Granulocitos
Se llaman así porque poseen gránulos en su citoplasma. Constituyen aproximadamente el
60% del total de glóbulos blancos. Hay tres tipos:
1) Los neutrófilos son los glóbulos blancos más numerosos (lo normal es un recuento
entre 3.000 y 7.000/mm3) y son los primeros en acudir a una infección. Su función
consiste en localizar y neutralizar a las bacterias, de tal forma que cuando las
encuentran en un tejido se rompen y liberan sustancias que hacen que aumente la
circulación de sangre en la zona y atraen a más neutrófilos, lo que provoca que la
zona está enrojecida y caliente.
2) Los eosinófilos son los encargados de responder a las reacciones alérgicas. Lo que
hacen es inactivar las sustancias extrañas al cuerpo para que no causen daño, y
también poseen gránulos tóxicos que matan a las células invasoras y limpian el área
de inflamación.
3) Los basófilos también intervienen en las reacciones alérgicas, liberando histamina,
sustancia que aumenta la circulación sanguínea en la zona para que aparezcan otro
tipo de glóbulos blancos y, además, facilitan que éstos salgan de los vasos
sanguíneos y avancen hacia la parte dañada. También liberan heparina, una
sustancia que disuelve los coágulos.

Agranulocitos
Estos tipos de glóbulos blancos no poseen gránulos en su citoplasma y constituyen
aproximadamente el 40% del total de los glóbulos blancos.

1) Los linfocitos, constituyen un 30% del total de glóbulos blancos (entre 1.000 y
4.000/mm3). Se forman en la médula ósea, pero luego emigran a los ganglios
linfáticos, bazo, amígdalas, timo y en realidad a cualquier parte del cuerpo. Al
contrario que los granulocitos, viven mucho tiempo y maduran y se multiplican ante
estímulos determinados. No sólo luchan contra las infecciones. Por ejemplo, los
linfocitos T matan a las células extrañas o infectadas, bien directamente o liberando
linfocinas. Los linfocitos B producen anticuerpos, que nos dan inmunidad frente a
varias enfermedades. Los anticuerpos son proteínas fabricadas para unirse y matar a
un antígeno específico. Por ejemplo, el virus del sarampión. Los antígenos son
sustancias que el organismo reconoce como extrañas y forma anticuerpos para
matarla y conserva linfocitos con memoria para recordarla, así cuando vuelva a
atacar el virus el cuerpo le reconocerá y le atacará más rápida y eficazmente. Los
linfocitos son los glóbulos blancos de menor tamaño y representan del 24 a 32% del
total en la sangre periférica. Presentan un gran núcleo esférico que se tiñe de
violeta-azul y en su citoplasma frecuentemente se observa como un anillo periférico
de color azul. Los linfocitos son células de alta jerarquía en el sistema inmunitario,
principalmente encargadas de la inmunidad específica o adquirida. Los linfocitos B,
que son los responsables de la respuesta humoral, es decir, de la producción de
 anticuerpos, proteínas (inmunoglobulinas) se adhieren a un antígeno específico (al
cual reconocen de manera unívoca). Son capaces de reconocer antígenos de lípidos,
proteínas y glúcidos. Es importante resaltar que los linfocitos B dan lugar a una serie
de células especializadas en la producción de anticuerpos. La más característica es
la célula plasmática o plasmocito.

2) Los monocitos, constituyen un 5% del total de glóbulos blancos. Su función consiste

en acudir a la zona de infección para eliminar las células muertas y los desechos.
Contienen enzimas (un tipo de proteínas) especiales con las que también matan
bacterias. Se forman en la médula ósea y tras pasar por la sangre vigilan y cumplen
sus funciones en los diferentes tejidos como la piel, los pulmones, el hígado o el
bazo. Cuando existe una infección, se produce inflamación, dolor, enrojecimiento,
calor en la zona afectada, y fiebre. Eso significa que el organismo está luchando
contra las sustancias extrañas y aumenta la formación de glóbulos blancos, por eso,
es normal que sus cifras estén altas en una analítica. Pero hay veces, como ocurre
con el tratamiento de quimioterapia, que se ve afectada la médula y los leucocitos
bajan (se denomina neutropenia si bajan los neutrófilos, o leucopenia si bajan los
glóbulos blancos o leucocitos en general) y la producción medular se ve afectada.

Pasos de preparación de las muestras

1) Se debe enjuagar la boca sólo con agua y lavar muy bien las manos.
2) Luego, se extrae una muestra de la cara interna de la mejilla, con el dedo índice o
con una tórula, frotando suavemente (frotarlo por 5 segundos) → muestra de frotis
bucal
3) Depositar la muestra en el centro del portaobjeto y extender suavemente la muestra
(frotis bucal).
3.1) Fijar la muestra pasándola sobre la llama del mechero, con cuidado de que no se
queme. Es una fijación con calor.
4) Aplicar 1 gota de colorante (azul de metileno, verde jano rojo neutro) y dejar actuar
por 5 minutos. Luego, poner un cubreobjetos con mucho cuidado (sin aplastar).
5) Retirar el excedente de tinción con papel absorbente de ser necesario (el
cubreobjeto no debe moverse del portaobjeto).
6) Dejar actuar la tinción por 10 minutos
7) Observar al microscopio

Laboratorio
1) Muestra de frotis bucal → preparación fresca (se hace en el momento y no es
duradera) → teñida con azul de metileno
- Se puede notar que aquí se ven células epiteliales muertas (son desprendidas de la
mucosa bucal, las células epiteliales vivas deberían haber estado unidas, pero como
se encontraban muertas estaban desprendidas) → es necesario que estén muertas
ya que las vivas poseen enzimas que no permiten la tinción
- El azul de metileno tiñe bacterias (uso previo a procedimiento quirúrgico), es básico
(+) por lo que tiñe estructuras ácidas (-) como el núcleo ( ADN - azul fuerte), la
membrana (azul claro), las bacterias y el citoplasma (celeste)
 - La preparación muestra una visión parecida a un mosaico formado por
células planas, poligonales, más o menos irregulares y aisladas. La
preparación muestra el epitelio pluriestratificado de la mucosa bucal; en su
mayoría son células muertas. El azul de metileno tiñe intensamente el núcleo
(n) y con menos color el citoplasma (cp)
- Esta tinción se usa para poder observar mejor algunas estructuras
importantes de la células como es el núcleo

2) Frotis bucal - preparación fresca teñida con verde jano

- La mitocondria es organelo que realiza la respiración celular en las células
eucariontes → poseen ADN y ribosomas (pueden replicarse) → en su membrana
interna está la CTE → dentro de ellas hay enzimas oxidativas (matriz)
- La coloración verde jano (colorante básico - +) se aplica a la muestra y las enzimas
oxidativas van a oxidar esta coloración, gracias a la reducción de los electrones de la
CTE (gran cantidad de e presentes en ella), manteniendo la coloración por el sistema
de oxidasa citocromo de la mitocondria (azul- verde) → coloración incolora en el
citoplasma celular porque está reducida (azul) → se utiliza para evaluar la pureza,
integridad y actividad metabólica mitocondrial → la cantidad de oxígeno presente
hace más fuerte o débil la tinción → en ausencia de oxígeno el indicador se reduce a
rosa → conforme transcurre el tiempo, en partes no mitocondriales la coloración se
 va reduciendo por el oxígeno que se va eliminando → se detecta en presencia de
mitocondrias funcionales

3) Frotis bucal - muestra fresca teñida con rojo neutro

- Colorante básico (+) y anfipático (extremo hidrofóbico y otro hidrofílico) que
atraviesa la membrana plasmática por difusión pasiva (no iónica) y se
acumula en los lisosomas (unión por enlaces hidrofóbicos electrostáticos a
grupos aniónicos o fosfatos de la matriz mitocondrial) → causado por el bajo
pH de los lisosomas que es de aproximadamente de 4,8-5 (cambia de rojo a
amarillo en pH de 6.8-8, o sdea es un indicador de pH) → Es uno de los
colorantes más usados en experimentos de citotoxicidad (reacción inmunitaria
por la que una célula o microbio determinados se recubren con anticuerpos y
son destruidos por ciertos tipos de glóbulos blancos) puesto que sólo las
células vivas lo incorporan, pero no aquellas que están muertas o muriendo
→ tiñe núlceo y lisosomas de rojo
Separación de componentes subcelulares
- Procesos metabólicos de las células eucariontes realizados en organelos
(compartimentos)
- Elementos comunes de los organelos
1) Compuestos por 1 o 2 membranas con diferentes propiedades fisicoquímicas
2) Presencia de proteínas, ácidos nucleicos, azúcares y otros metabolito en su
interior
- Diferencia entre organelos
1) Organización de sus membranas
2) Procesos metabólicos
3) Composición de proteínas y enzimas en ellos para cumplir sus actividades
- En la mitocondria, el núcleo y los cloroplastos ocurre la duplicación y transcripción
del DNA, pero hay enzimas involucradas en las mitocondrias que son propias de ella
→ proteínas exclusivas en los organelos
- Características moleculares, bioquímicas y las formas de los organelos que
componen un ser uni o pluricelular han permitido su aislamiento y purificación por
medio del fraccionamiento celular
- El fraccionamiento celular utiliza una serie de técnicas y procedimientos que permiten
separar - aislar y purificar uno o varios tipos de organelos → 3 procesos comunes →
El tubo eppendorf se mete a la centrífuga y permite separar los organelos celulares a
altas velocidades
1) Homogeneización → romper células y tejidos de modo controlado →
liberación del contenido intracelular suspendido en una solución isotónica
(igual cantidad de soluto y solvente) por agitación mecánica o sonicación
(frecuencias de sonido altas) → componentes subcelulares suspendidos +
restos de membrana → el resultado o caldo espeso o homogeneizado posee
(si se hizo bien) la mayor parte de los organelos intramembranosos intactos
 → nosotros usarmos molienda mecánica con mortero→ formas de
procedimientos mecánicos suaves
● Diferencia de presión → se fuerza a las células a pasar por
pequeño orificio por medio de presiones altas
● Detergente → rompe la membrana (estructura lipídica disuelta
en sus enlaces hidrofóbicos) → orificios en MP
● Por ondas de sonido de alta frecuencia → sonicador
● Émbolo → pistón hace la molienda por presión con paredes
de tubo de cristal
2) Separación → se separa el homogenizado en fracciones subcelulares → 1°
etapa del fraccionamiento → técnica de centrifugación diferencial, donde el
homogenizado es expuesto en diferentes etapas a diferentes fuerzas
centrífugas en un tiempo determinado → producto de esto se obtienen
fracciones separadas de organelos de tamaño y densidades similares
(fracciones puras o enriquecidas de un determinado componente celular, una
de membrana, de complejos multiproteicos) → Se obtiene
● Núcleos
● Mitocondrias, lisosomas y peroxisomas (+cloroplastos en
vegetales)
● Membranas plasmáticas, fracción microsómica (fragmentos del
RE), polirribosomas grandes y vesículas pequeñas
● Subunidades ribosómicas, polirribosomas pequeños,
ribosomas
● Parte soluble del citoplasma (citosol)
3) Purificación → separa los organelos de una fracción subcelular por tipo → los
organelos de un tipo quedan aislados así de otros → centrifugación por
gradiente de densidad permite esto → Una vez resuspendida la fracción, se
coloca en la parte superior de una solución que contiene un gradiente de una
sustancia densa no iónica (sacarosa o glicerol), luego se centrifuga a altas
velocidades (40000 rpm) por varias horas, lo que le permite a cada partícula
migrar a una posición de equilibrio donde la densidad del líquido circundante
es igual a la de la partícula
Procedimiento
*Hígado debe estar frío para que no se descomponga (detención de procesos celulares)
1) Se parte hígado a la mitad (debe ser esto ya que es grande y esto disminuyen el uso
de suministros de animales)
2) Se pesa lo anterior, ya que cada 1 gramo de hígado se deben agregar 5 mililitros de
buffer para la homogeneización
3) Se pone en hielo
4) Con tijeras se corta y se trata de dejar lo + pequeño posible (así será más fácil de
moler por molienda mecánica, aplicando más presión)
5) Se pasa a mortero todo y se + un poco del buffer (no todo o saltará al molerlo) → se
va homogeneizando poco a poco (mientras se haga pastoso se va + buffer) → esto
hasta completar los 34 mL del buffer → esto rompe la unión célula - célula, liberando
el contenido intracelular
6) Filtrado con gasa → esto ya que la molienda no fue 100% efectiva (grasa difícil de
romper y hay tejidos que no se han roto)
7) Se pasa todo a 2 tubos (todo debe estar en frío si no se utiliza de inmediato)
 7.1) Fijarse que la centrífuga esté balanceada, o sea que ambos tubos con muestra
deben tener el mismo peso para que rotor no oscile, para esto se usa la balanza granataria
o analítica → rotor tiene espacio para 6 tubos, los que pesan lo mismo se enfrentan en rotor
y así quedan balanceados (uno frente a otro, en horizontal). No posee tapa ya que tiene baja
velocidad y el tubo no sale eyectado, a más velocidad si debe tener. Se cierra y se espera
10 minutos
8) Ahora se lleva esto a centrifugación de baja velocidad (3500 rpm - pellet no queda
fijo) por corto tiempo, refrigerada (4°C) obteniendo un pellet (FN → organelo más
pesado) y un sobrenadante (FC1)
9) El sobrenadante o FC1 se saca sin tocar el pellet o FN y se pone en tubo de 15 mL
10) El pellet se pone de nuevo en 5mL de buffer
*Pasteur se usa para resuspender el pellet

Procedimiento 2
- Control de calidad → Las muestras deben ser almacenadas en frío (hielo) y no
deben tener mucho precipitado de sal (dificultad de visión)
- Se usa el FC1 de la clase pasada
1) Se pone la FC1 a centrífuga (balanceada no debe sonar rotor) con mayor
sensibilidad y velocidad y con tubo eppendorf
2) Se preparan 100 microlitros de la FC1 (dividida en FC2 y FM) y se le agrega peróxido
(catalasa funcionando se ve agua y oxígeno visualizados como burbujas)

Preguntas
1)

Esta es una centrifugación diferencial

2) ¿Desde cuál pellet usted obtendría enzimas lisosomales para su estudio y
caracterización?
Desde el pellet que contiene la FM, o sea donde están contenidos los lisosomas
3) Definir
a) Pellet → sedimento compacto en el fondo del tubo tras un centrifugado
correspondiente a los organelos con similar masa y densidad
b) Homogeneizado → Rompimiento celular (membranas) y de tejido de manera
controlada
c) Sobrenadante → Solución remanente que queda sobre el pellet tras una
centrifugación y sedimentación
4) La enfermedad de Cori se produce por ausencia de una enzima lisosomal que
degrada el glucógeno. ¿Qué procedimiento experimental realizaría usted para
determinar el déficit de esta enzima? Una centrifugación diferencial o por gradiente
de densidad para comprobar la presencia o no de lisosomas que puedan poseer
estas enzimas capaces de degradar el glucógeno → se puede usar una muestra
control y la de prueba, agregar a ambas glucógeno y medir la actividad para
comparar