poliméricos después de la biodegradación se pueden recuperar fácilmente en la

vermiculita activada que en el compost maduro (una materia orgánica muy compleja). Por
lo tanto, al final de la prueba se ha podido determinar el balance de carbono que es
teniendo en cuenta el CO2 desprendido y un residuo polimérico extraído de la vermiculita
(Singh & Sharma 2008).

7.3.3 En el suelo

El método de enterramiento del suelo es uno de los métodos frecuentemente utilizados

para la determinación de la biodegradabilidad del plástico. En este método, la prueba de
biodegradación se realiza en condiciones naturales o condiciones de laboratorio. La
muestra con el peso y dimensión definitiva se entierra a una profundidad específica en el
suelo durante diferentes intervalos de tiempo. Después de un tiempo especificado, la
muestra se desentierra, se enjuaga bien con agua destilada y se seca a 50 °C durante 24
h en un horno de vacío. Se permite que la muestra se equilibre a temperatura ambiente y
humedad durante al menos 24 h antes de la medición (Singh & Sharma 2008).

7.4 Técnicas para evaluar la biodegradación

7.4.1 Espectroscopia infrarroja transformada de Fourier (FTIR)

La técnica de FIRT denota cuantitativamente la reducción de los índices de carbonilo (C-

O) y de las terminaciones con doble enlace (C=C) de una molécula cuando ésta sufre
algún cambio. Durante el proceso de fotodegradación, el grupo funcional carbonilo es
liberado por acción de la luz UV y rápidamente asimilado como fuente de energía por los
microorganismos, lo que a la vez podría permitir la mayor degradación de la estructura
principal de la molécula del polietileno, también compuesto por cadenas de enlaces
dobles. Es por esto que la reducción del índice de carbonilo obtenida en cultivos a pH 7,0
guarda relación con la disminución del índice de terminaciones C=C, aunque en esto
también está involucrado el tipo de microorganismos presentes en el cultivo (Uribe et al.
2010; Esmaeili et al. 2013; Bonhomme et al. 2003; Yamada-Onodera et al. 2001). El
espectro infrarojo (IR) se analiza separando dos zonas referenciales; la primera es
llamada la región de los grupos funcionales que va de 1200 a 3600 cm-1 y la segunda
denominada región de huella digital que se despliega desde 600 a 1200 cm-1; esta última
es una zona muy específica, donde los picos no varían para un polímero, a menos que
este haya sufrido el efecto de algún agente químico, físico o biológico (Gulmine 2002).
En el estudio de Zahra et al. 2010, películas de PEBD irradiadas y no irradiadas con UV,
se incubaron con Aspergillus terreus, Aspergillus fumigatus y Aspergillus solani. Los
cambios estructurales en la superficie de PEBD se investigaron mediante-FTIR. La figura
7 muestra los espectros de FTIR de películas de PEBD antes y después de la irradiación
UV y la incubación con cada hongo durante 100 días. Los cambios del C=O se
magnificaron en la figura 8. Se observó un enlace principal característico para el PEBD
irradiado que no se observó en las muestras que no fueron irradiadas. Esta diferencia se
presentó en la proximidad de 1.720 cm-1 y se asignó al grupo C=O que se formó por la
irradiación UV. La intensidad del enlace C=O en 1700-1760 cm-1 se redujo
significativamente durante el proceso con hongos debido a la utilización del grupo

23
carbonilo por los hongos para la degradación del PEBD. De acuerdo con los resultados,
Aspergillus fumigatus fue el hongo más eficaz para la degradación de PEBD.

Figura 7. Espectros de FT-IR de películas de PEBD antes y después de la irradiación UV y la

incubación con cada hongo durante 100 días desde 400 a 4000 números de onda cm -1. Tomado de
(Zahra et al. 2010).

Figura 8. Espectros de FT-IR de películas de PEBD irradiadas con UV antes y después de la

incubación con cada hongo por 100 días. (a) En blanco (sin irradiación UV, sin incubación); (b)
después de irradiación UV, sin incubación; (c) después de la irradiación UV, la incubación con
Aspergillus terreus; (d) después de la irradiación UV, la incubación con Aspergillus fumigatus; (e)
después de la irradiación UV, la incubación con Fusarium solani. Tomado de (Zahra et al. 2010).

24
En el estudio de Uribe et al. 2010 el FTIR permitió evidenciar una reducción del 83,89%
del grupo funcional C-O (cercano a 1700-1735 cm-1) a pH 7,0 y del 19,77% a pH 5,5 para
la forma C=C (cercano a 1340-1410 cm-1) de un polietileno sometido a la acción de un
consorcio bacteriano a pH 7.0 y fúngico a pH 5.5. Se obtuvo una reducción de 5,4% del
peso total de polietileno con bacterias y de 4,8% con hongos (Figuras 9a y 9b).

Figura 9a. Análisis FTIR del PEBD sin inoculación.

Figura 9b. Análisis FTIR del PEBD después de 2 meses de incubación con el consorcio MP3 a pH
5,5. Tomado de (Uribe et al. 2010).

7.4.2 Microscopía de epifluorescencia

La fluorescencia es un tipo de luminiscencia que se produce cuando una sustancia es

excitada por radiación luminosa. La longitud de onda de la luz emitida es normalmente
más larga que la luz de excitación (Sampedro et al. 1995). Cuando un objeto fluorescente
se expone a la luz ultravioleta, puede ser percibido como un cuerpo brillantemente
coloreado sobre un fondo negro. Este es el fundamento de la microscopía de
fluorescencia (Stanier et al. 1996).
La microscopía de epifluorescencia consiste en que una serie de filtros que selecciona un
segmento específico del espectro de luz excitando una preparación teñida y así la luz
excitada, pasa a través de los lentes oculares. Típicamente, un filtro de paso de banda de
excitación (BP) se utiliza en combinación con microscopía de epifluorescencia para
iluminar la muestra preparada que puede contener manchas de pigmentos, con la luz en
longitudes de onda que causa que el fluorocromo emita fluorescencia. Un divisor de haz
dicromático se utiliza entonces para dirigir el haz de excitación a través del lente del
objetivo, pero las propiedades del divisor del haz son tales que sólo fluoresce pasando a
través de él y a las lentes oculares. Un filtro de emisión de paso largo (LP) elimina

25
longitudes de onda no deseadas antes de que la luz pase a través de las lentes oculares
(Kemp et al. 1993). Bonhomme et al. 2003 a través de microscopía de fluorescencia,
evidenció la colonización de la superficie de películas de plástico no sometidas a
envejecimiento térmico en presencia de Rhodococcus rhodochrous (Figura 10).

Figura 10. Exploraciones de microscopía de fluorescencia de muestras de películas LC

compactadas no termo oxidadas incubadas con R. rhodochrous (Rr) para los diferentes tiempos.
Tomado de (Bonhomme et al. 2003).

7.4.3 Cromatografía de exclusión o permeación en gel de alta temperatura (HT-GPC)

La cromatografía de exclusión o permeación en gel (GPC), que se ha denominado de

tamices moleculares o filtración en gel, es un tipo de cromatografía sólido-líquido que
separa los polímeros polidispersos en fracciones por tamizado mediante un gel de
poliestireno con enlaces cruzados u otro de características semejantes. El gel de
poliestireno, que sirve de fase estacionaria, se puede obtener comercialmente en una
gran variedad de tamaños de poro (1 a 106 nm). Puesto que las moléculas pequeñas
penetran más fácilmente en las películas de gel, las fracciones de más alto peso
molecular se separarán antes. De esta manera, la GPC separa las fracciones con su
tamaño (Seymour & Carrager 1995).

La cromatografía de exclusión o permeación en gel (GPC) se ha utilizado en estudios de

la degradación de PEBD y polietileno de alta densidad bajo condiciones de alto
cizallamiento indicando que la mayoría de los cambios en distribución de peso molecular y
ramificación de cadena larga se han producido a partir de la degradación térmica o termo-
oxidativa (Singh & Sharma 2008). Dado que la radiación UV produce fragmentos de
polímero, el peso molecular de los fragmentos liberados se revela mediante GPC y la
cromatografía de exclusión o permeación en gel de alta temperatura HT-GPC se utiliza

26
para determinar los cambios en la distribución del peso molecular del polietileno (Johnson
et al. 1993).

En el estudio de Yamada-Onodera et al. 2001, la distribución de pesos moleculares del

polietileno fue examinado por HT-GPC, mostrando que algunos de los enlaces dobles de
carbono del polietileno podían ser cortados por Penicillium simplicissimum YK (Figuras 11
y 12).

Figura 11. Resultados de HT-GPC del polietileno no tratado en cultivo liquido por 1 mes con hifas
de P. simplicissimmum YK. (a) Antes de la incubación; (b) después de 1 mes de incubación.
Tomado de (Yamada-Onodera et al. 2001).

Figura 12. Resultados de HT-GPC del polietileno no tratado en cultivo liquido por 3 meses con
hifas de P. simplicissimmum YK. (a) Antes de la incubación; (b) después de 3 meses de
incubación. Tomado de (Yamada-Onodera et al. 2001).

En el estudio de Zahra et al. 2010 el análisis de HT-GPC reveló una reducción de 66.739
a 54.686 KD en el peso molecular del PEBD irradiado, durante la incubación con una
mezcla de hongos (Figura 13).

27
Figura 13. Resultados de GPC de películas de PEBD irradiados por UV. (a) Antes de la incubación
con la mezcla de los hongos; (b) después de la incubación con la mezcla de los hongos. Tomado
de (Zahra et al. 2010).

7.5 Evaluación de las propiedades físicas del PEBD

7.5.1 Microscopia electrónica de barrido (SEM)

La morfología de los polímeros puede determinarse mediante la microscopia electrónica
de barrido (SEM), en la cual las imágenes se observan con una resolución de 5 a 10 nm
(Seymour & Carraher 1995). Esmaeili et al. 2013 empleó SEM para verificar
características de la superficie del PEBD irradiado y no irradiado, después de incubarse
con una cepa de bacterias denominada S7-10F y una cepa de hongos F1,
respectivamente. El análisis mostró erosión y formación de picaduras y cavidades en la
superficie de las muestras, lo que sugiere que el hongo (cepa F1) penetró en la matriz de
polietileno de baja densidad durante la degradación. Esta penetración de las hifas en la
matriz y la formación de una biopelícula bacteriana de la cepa S7-10F se observó en
ambas superficies. La presencia de pozos y cavidades puede ser debido a la ausencia de
una distribución uniforme de productos fotodegradables de la matriz del polímero (Manzur
et al. 2004).

En el estudio de Zahra et al. 2010 las fotomicrografías del SEM de las muestras de PEBD,
antes del proceso de fermentación tenían una superficie lisa sin defectos. Sin embargo,
después de un proceso con Aspergillus terreus y Aspergillus fumigatus, las muestras
poseían superficies erosionadas. Las cavidades fueron observadas en la superficie, lo que
sugiere que los hongos penetran en la matriz del polímero durante la degradación. La
superficie del plástico después de un ataque biológico fue físicamente débil y fácilmente
desintegrado bajo presión leve (Figura 14).

28
Figura 14. Micrografías SEM de las películas de PEBD antes y después de la incubación con cada
hongo por 100 días. (a) En blanco (sin irradiación UV, sin incubación); (b) después de la irradiación
UV, incubación con Fusarium solani; (c) después de la irradiación UV, la incubación con Aspergillus
terreus; (d) después de la irradiación UV, la incubación con Aspergillus terreus (penetración de
hifas en la matriz PEBD); (e) después de la irradiación UV, la incubación con Aspergillus fumigatus;
(f) después de la irradiación UV, la incubación con Aspergillus fumigatus (penetración de las hifas
en la matriz PEBD). Tomado de (Zahra et al. 2010).

29
 7.5.2 Medición de la tensión

La resistencia a la tensión, es la medida de la capacidad de un polímero a resistir

esfuerzos de estiramiento (Seymour & Carraher 1995).
La resistencia a la tensión puede determinarse aplicando una fuerza al material de ensayo
hasta que se rompa. Se define mediante la siguiente relación (Formula 1):

[1]
La elongación o deformación se mide mediante el ensayo de tracción. Una elongación o
deformación recuperable se llama deformación elástica. El porcentaje de elongación es
igual a la variación dimensional dividida por la longitud original de la muestra y
multiplicado por 100 (Ecuación 1):

Seymour & Carraher 1995

En el estudio Esmaeili et al. 2013 la resistencia a la tensión (porcentaje de elongación) se

determinó usando un medidor de tensión (Gotech, modelo U 60) después de una
incubación con microorganismos. Debido a que las películas se volvieron frágiles y ligeras
en peso, indica esto etapas preliminares de una descomposición microbiana. La
irradiación UV de las películas causó una reducción en el porcentaje de elongación de 95.
8%. Labuzek et al. 2004 determinó la propiedad mecánica a la tensión de las películas de
PEBD usando un medidor de tensión (Instron 4466), los valores de tensión se calcularon
a partir de la media aritmética de cinco mediciones. Los rendimientos de la resistencia a la
tensión y porcentaje de elongación de la película de Bionolle tipo no. 3001 fueron 52,5
MPa y 878%. La película del PEBD que fue usado en este estudio tenía propiedades
menores que el de Bionolle tipo no. 3001. También fue interesante que se observó que en
presencia de un copoliéster, la resistencia a la tensión y la elongación de la película del
PEBD mejoro hasta 17,8MPa y 616,1%, respectivamente (Tabla 4).

Tabla 4. La composición y propiedades mecánicas de las muestras de películas (Labuzek et al.

2004)

30
 7.5.3 Difracción de rayos X (XRD)
Los polímeros amorfos con grupos voluminosos irregulares son raramente cristalizables, y
a menos que se usen métodos especiales, los polímeros ordenados rara vez son 100%
cristalinos. La velocidad de cristalización puede observarse mediante técnicas de
difracción de rayos X (XRD) o por dilatometría (medida del cambio de volumen). La XRD
se ha utilizado para determinar la estructura cristalina y las conformaciones de los
polímeros (Seymour & Carraher 1995).
En el estudio de Esmaeili et al. 2013 los patrones de difracción de rayos X de películas de
PEBD irradiadas y no irradiadas, antes y después de 126 días de incubación en el suelo
en presencia y ausencia de microorganismos seleccionados, se midieron con un
difractómetro de rayos X (D5000, Siemens Difractómetro) usando radiación de Cu Kα (λ=
1,5418 A°) con una radiación dispersada en el intervalo angular (2θ) desde 2° a 40°,
usando una corriente de 30 mA y una tensión de 40 kV.
El análisis XRD, mostró que la intensidad de los picos de las películas irradiadas con UV
fue mayor que las no irradiadas. Esta diferencia claramente ha demostrado que el
tratamiento previo de oxidación aumenta el grado de cristalinidad del polietileno (Figura
15).

Figura 15. Los espectros de difracción de rayos X de las películas no-irradiadas por UV y películas
de PEBD puras irradiados con UV antes y después de la incubación en el suelo con diferentes
tratamientos. (A) los espectros de difracción de rayos X de las películas de PEBD puras no
irradiadas con UV sin aditivos pro-oxidantes antes y después de 126 días de incubación en el suelo
con diferentes tratamientos: (a) blanco (sin irradiación UV, sin incubación); (b) PEBD no irradiada
con UV después de la incubación en el suelo en ausencia de los microorganismos seleccionados
(tratamiento SP); (c) PEBD no irradiada con UV después de la incubación en el suelo en presencia
de los microorganismos seleccionados (tratamiento SMP). (B) los espectros de difracción de rayos
X de las películas PEBD puras irradiadas con UV sin aditivos pro-oxidantes antes y después de
126 días de incubación en el suelo con diferentes tratamientos: (a) en blanco (después de la
irradiación UV 25 días ', sin incubación); (b) PEBD irradiada con UV después de la incubación en el
suelo en ausencia de los microorganismos seleccionados (tratamiento SUP); (c) PEBD irradiada
con UV después de la incubación en el suelo en presencia de los microorganismos seleccionados
(tratamiento SMUP). Tomado de (Esmaeili et al. 2013).

31
 7.5.4Calorimetría de barrido diferencial (DSC)
La DSC es una técnica de calorimetría de desequilibrio en la que se mide el flujo de calor
hacia y desde el polímero en función del tiempo o de la temperatura. Los equipos de DSC
disponibles actualmente miden el flujo del calor manteniendo un equilibrio térmico entre la
referencia y la muestra; esto se hace alterando la corriente que pasa a través de los
calentadores de ambas cámaras (Seymour & Carrager 1995).
En el estudio de Corti et al. 2010 las mediciones de DSC se llevaron a cabo bajo una
atmósfera de nitrógeno utilizando un equipo denominado Mettler-822. Las propiedades
térmicas tales como la temperatura de fusión (Tm), calor de fusión (ΔHm) y el grado de
cristalinidad, se calcularon a partir de las trazas de DSC registrados durante el segundo
calentamiento. Se mostró un ligero aumento en la cristalinidad y la temperatura de fusión
(Tm) en ambas películas con aditivos, después de 93 días de exposición al sol en
comparación con las muestras no expuestas (Tabla 5). Debido a que la oxidación se limita
principalmente a la porción amorfa de la matriz de polímero, el resto del polímero es más
susceptible a la reorganización molecular que puede explicar el aumento de la
cristalinidad de las películas foto-oxidadas que contienen pro-oxidantes. Adicionalmente,
no se evidenció un cambio en la cristalinidad o en la cantidad de residuos en el PEBD sin
aditivo pro-oxidante.

Tabla 5. Caracterización de la cristalinidad en películas expuestas a la luz del sol. Tomado de

(Corti et. al. 2010).

Tiempo de 1st calentamiento 2nd calentamiento

Muestra de
envejecimiento
prueba (Tipo) Cristalinidad Cristalinidad
(Días) Tma (°C) Tma (°C)
(%) (%)

0 115,122 42.7 111,222 44.7

PEBD-TD1
93 116,122 48.5 121 46.3

0 122 41.9 110,122 44.2

PEBD-TD2
93 118,122 52.4 122 47.5

0 122 43.4 112,121 42.9

PEBD-TD0
93 __ __ __ __

7.5.5 Conversión en CO2 ; Mineralización

En la actualidad, las pruebas de laboratorio utilizados para determinar la biodegradación

de plásticos se basan en la medición de carbono o desprendimiento de dióxido por el
consumo de oxígeno cuando el polímero original se expone a condiciones ambientales
controladas (por ejemplo, tierra, compost, lodos activos, etc.). En general, la
biodegradación es medida como el grado de mineralización, a saber, la conversión en
CO2. Este método se considera el enfoque óptimo para confirmar la biodegradabilidad

32
total, es decir, la conversión total de carbono orgánico en carbono inorgánico. La cantidad
de CO2 generado se determina por titulación con NaOH (Esmaeili et al. 2013).
En el estudio de Esmaeili et al. 2013 se realizó cinco tratamientos con el PEBD en el cual
se realizaron mezclas con suelo + microorganismos seleccionados + PE irradiados y no
irradiados. Los niveles de CO2 alcanzaron 734 mg CO2.g suelo después de 126 días, que
era debido a la utilización de los grupos carbonilo de las películas irradiadas por UV de las
cepas S7-10F (Lysinibacillus xylanilyticus) y F1 (Aspergillus niger) (Figuras 16 y 17). La
mineralización de las películas de PEBD irradiadas en el tratamiento inoculado (SMUP
29,5%), cuando se compara con el correspondiente tratamiento sin inocular (SUP 8,6%),
fue más elevado. Esta diferencia demuestra claramente que los aislamientos bacterianos
y fúngicos seleccionados utilizan los productos de oxidación en las películas pre-oxidadas
(Esmaeili et al. 2013). El porcentaje de mineralización para el PEBD pre-oxidado y PEBD
conteniendo aditivos pro-oxidantes fue del 16% y el 24% después de 317 días de
incubación en compost, y el 9% y 12% después de 317 días de incubación en suelo.

Figura 16. La evolución de CO2 acumulado de las películas de PEBD irradiadas por rayos UV y
películas no irradiadas por UV incubadas en el suelo con varios tratamientos durante 126 días.
Cada punto de datos representa la media de tres repeticiones ± SD. (S: Suelo; SM: Suelo +
microorganismos seleccionados; SMP: Suelo + microorganismos seleccionados+ PE no irradiado
por UV; SMUP: Suelo + microorganismos seleccionados + PE irradiado por UV; SP: Suelo + PE no
irradiado por UV; SUP: Trabajo del suelo + PE irradiado por UV). Tomado de (Esmaeili et al. 2013).

33
Figura 17. Perfil de mineralización de las películas PEBD irradiadas por rayos UV y películas no
irradiadas con UV incubadas en el suelo con varios tratamientos durante 126 días. Cada punto de
datos representa la media de tres repeticiones ± SD. (SP: Suelo + PE no irradiados con UV; SUP:
suelo + PE irradiado por UV; SMP Suelo + PE irradiado por UV; SMUP: suelo + microorganismos
seleccionados + PE irradiado por UV). Tomado de (Esmaeili et al. 2013).

La generación del dióxido de carbono (en un metabolismo aeróbico) se traduce en la

disminución en la cantidad de carbono orgánico total (COT). Davis (2005) y Liang et al.
2003 mencionan que el contenido de humedad es un factor importante que afecta la
actividad microbiana en el proceso y en última instancia, la tasa de degradación. Por un
lado, la falta de humedad conduce a una disminución del metabolismo y la tasa de
desarrollo de los hongos, por el contrario, el exceso de humedad hace que la
disponibilidad de sustrato y anaerobiosis disminuya (Grima et al. 2012). El mejor
crecimiento de los hongos se da cuando la humedad está en un rango de 50-70% (Zahra
et al. 2010).

7.5.6 Titulación del NaOH

El hecho de agregar un ácido a una base o viceversa, es posible obtener una solución
neutra. Si se dispone de un método que permita establecer cuando se ha alcanzado esta
condición de neutralidad, es posible determinar la cantidad de ácido o de base mediante
un procedimiento que se denomina titulación, porque se trata de establecer el ¨titulo¨ del
ácido o de la base (Barrow 1975).
En el estudio de Ojeda et al. 2009 se realizó la titulación de NaOH, a muestras de PE que
contienen aditivos pro-oxidantes. Se introdujeron en forma de un polvo fino en los
matraces y las que no contenían los aditivos pro-oxidantes se cortaron en rectángulos de
aproximadamente 2x1 mm. Para atrapar el CO2 desprendido, el equipo biométrico fue
equipado con un vaso de precipitado que contenía 20 ml de unos 0,25 moldm-3 de
solución de NaOH, que se valora con 0,25 moldm-3 de solución de HCl. Antes de la
valoración, se añadió 1-3 ml de una solución de BaCl2 35 % (p/v) a la solución de NaOH

34