Microbiología Ambiental

Determinación de Interacciones Microbianas

Informe de laboratorio N°1
Docente: Andrea Melissa Sánchez Garibello
Presentado por: Jairo Escruceria
Fecha: 18/03/2019
Universidad El Bosque
Microbiología

l.RESUMEN
El Objetivo de esta práctica fue determinar las interacciones microbianas entre organismos por medio del uso de diferentes
técnicas, que pueden ser utilizados para bacterias y hongos. Metodología, se realizaron tres diferentes técnicas de
interacciones, la primera fue la enfrentamiento DUAL, en agar PDA donde se sembró por punción a una distancia de 3 cm a
Trichoderma sp y Fusarium, la segunda fue la técnica IGARASHI, esta consistió en dibujar un cuadro de 3cmx3xm en el
centro de las cajas Petri correspondiente a los agares Avena y PDA, haciendo uso de Trichoderma sp por siembra masiva a
los alrededores del cuadro y Fusarium por punción central en el cuadro elaborado y por último la técnica GAUZE, esta se
basó en realizar una siembra masiva de Streptomyces sp y en forma de triángulo se sembró los microorganismos E.Coli,
Bacillus sp y S.aureus. Resultados, se pudo establecer y observar las interacciones de los microorganismos según su
medio y con el microorganismo que estén enfrentados, Conclusión. A partir de los diferentes fundamentos de las técnicas
de interacción, se puede realizar diferentes aplicaciones en la vida diaria evaluando las interacciones que se producen en
entre los microorganismos y su posible inhibición en otros.
Palabras clave: Crecimiento libre, crecimiento influenciado, micoparasitismo, controlador, patógeno

ll.INTRODUCCIÓN
Es Importante conocer el término control biológico, debido a que ha sido utilizado en diferentes campos de la biología, en la
entomología se ha utilizado para describir el uso de predadores, nematodos entomopatógeno o patógenos microbianos para
suprimir las poblaciones de diferentes pestes de insectos. En la patología de plantas, el término aplica a al uso de
antagonistas microbianos para suprimir enfermedades (Pal & McSpadden, 2006). El control biológico se refiere a cualquier
actividad de una especie que disminuya los efectos adversos que son causados por otro tipo de especie. En el control de
plagas, el control biológico usualmente hace referencia a la acción de parásitos, predadores o patógenos en una población
de pestes que reduce su número de individuos. Este hace parte de un control natural y puede ser aplicado a cualquier tipo
de organismo, son introducidos por humanos o manipulados por ellos (Alston, 2011). En interés en el control biológico ha
incrementado últimamente debido a la preocupación sobre el uso de químicos en el ambiente en general, y la necesidad de
buscar alternativas para usar esos químicos en el control de enfermedades (Whipps, 2000).
Desde la perspectiva de las plantas el control biológico puede ser considerado un resultado neto positivo de una variedad
de interacciones específicas y no específicas. Con el uso del espectro de Odum de conceptos es posible clasificar y
delimitar funcionalmente los diversos componentes de los ecosistemas que contribuyen al Biocontrol, los cuales son,
mutualismo, ambas especies se benefician, protocooperación, es una forma de mutualismo pero los organismos
involucrados no dependen uno del otro para sobrevivir, comensalismo, es una interacción simbiótica entre dos organismos
vivos, neutralismo, describe las interacciones biológicas cuando la densidad de la población de una de las especies no tiene
efecto en la otra, antagonismo, resulta en consecuencia negativa para uno o los dos, competición, dentro o fuera de las dos
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especies resulta en la disminución del crecimiento, parasitismo, es una simbiosis en donde dos organismos
filogenéticamente relacionados coexisten por un largo periodo de tiempo, usualmente uno de los dos organismos es más
pequeño que el otro, y depredación, se refiere a la caza y la matanza de un organismo por consumo y mantenimiento. (Pal
& McSpadden, 2006).
Se han estudiado una gran variedad de diferentes enfoques para el control biológico y son comparativamente complejos,
estos incluyen la administración de tierra, agua y residuos de cosechas; modificación de modelos de cosechas,
manipulación de vegetales no cultivados y directa provisión de recursos para enemigos naturales. En general estos
enfoques tienen como objetivo mejorar la densidad de las poblaciones de enemigos naturales residenciales (Orr, 2009)
Se ha descubierto en la microbiología que la actinobacteria es una bacteria Gram positiva que constituye uno de los phylum
más grandes dentro de las bacterias (Ventura, y otros, 2007). Estas son un grupo importante de bacterias saprófitas y de
crecimiento filamentoso capaces de producir una gran variedad de enzimas extracelulares y metabolitos secundarios que
tienen interés comercial e industrial. Producen compuestos de uso biotecnológico como antibióticos, enzimas industriales,
agentes antitumorales y agentes inmunosupresores (Cuevas & Martínez, 2011)
Dentro géneros de los microorganismos considerados antagonistas de patógenos de las plantas, se encuentran
Pseudomonas, Burkholderia, Bacillus, Serratia, Actinomycetes, Trichoderma, Penicillium, Gliocladium, Sporidesmium, y
especies no patogénicas de Fusarium spp. , los mecanismos a través de los cuales inhiben a los patógenos se han dividido
en: competencia por nutrientes, amensalismo, antagonismo microbiano, parasitismo, depredación (Garbeva y Elsas, 2004)
Para evaluar posibles biocontroladores, in vitro, se utilizan técnicas en las que se ponen en contacto los microorganismos a
evaluar con un patógeno, dentro de estas técnicas se encuentran: Técnica de Igarashi, se enfrenta el patógeno frente al
biocontrolador, para evaluar el amensalismo; técnica de enfrentamiento dual, en la cual se evalúa la competencia por
espacio y nutrientes.
Es importante conocer los agentes biocontroladores, pues estos son organismos vivos cuyas actividades dependen de las
diferentes condiciones fisicoquímicas a las que están sujetas. Por esta razón, el biocontrol ejercido por Trichoderma a veces
es impredecible (Benítez, Rincón, Limón, & Codón, 2004). Los hongos del género Trichoderma, potenciales agentes
biocontroladores, pueden ser aislados de su hábitat natural por determinados patógenos (Chet & Inbar, 1994). Este es un
hongo de vida libre que comúnmente se encuentra en el suelo y en ecosistemas de raíz, recientes descubrimientos que
estos son ativirulentos y oportunistas simbiontes de plantas (Harman, Howell, Viterbo, Chet, & Lorito, 2004). El biocontrol
resulta por la competición por nutrientes y el espacio o como el resultado de la habilidad del Trichoderma para producir o
resistir metabolitos que, o bien impiden la germinación de la espora (fungistasis), mata las células (antibiosis) o modifica la
rizósfera por la acidificación del suelo, así los patógenos no pueden crecer. (Benítez, Rincón, Limón, & Codón, 2004). El
objetivo de esta práctica fue determinar las interacciones microbianas entre organismos por medio del uso de diferentes
métodos, que pueden ser utilizados para bacterias y hongos.
Especies de Trichoderma son considerados controladores de otros hongos patógenos (biofungicida), entre sus modos de
acción se encuentran: micoparasitismo, consiste en la producción de enzimas extracelulares que degradan la pared celular ,
las cuales pueden facilitar la reducción de la infección inicial (Abdullah y Suleman, 2008), entre las enzimas excretadas se
encuentran: proteolíticas, glucanoliticas, quitinasas, durante el micoparasitismo Trichoderma desarrolla estructuras similares
a un apresorio que le permiten a la hifa de Trichoderma una mayor adherencia a la superficie del hongo parasitado, la
penetración se facilita por la secreción de enzimas líticas (como exoquitinsas, las cuales se difunden en el medio y
disuelven fragmentos celulares y sustancias fungicidas que lograr la degradación de la pared celular (Schubert et al, 2008).
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Es de gran valor conocer la definición de Antibiosis como la secreción de compuestos antimicrobianos o antibióticos por el
hongo antagonista que suprimen o matan el hongo patógeno en el área de crecimiento, algunos de estos metabolitos
pueden causar disrupción en las membranas lipídicas o pueden inducir la resistencia de la planta. Competencia: por
nutrientes comunes, por iones de hierro, (Verma et al, 2007)) El micoparasitismo consiste en: reconocimiento del huésped,
adhesión, penetración y muerte del huésped, durante este proceso Trichoderma secreta celulosas, quitinasas, glucanasas
que hidrolizan la pared del hongo huésped. La competencia por nitrógeno, carbono y otros factores de crecimiento, junto
con la competencia por espacio, (Vanale et al, 2008). Se emplea Trichoderma harzianum como un controlador efectivo
sobre Fitopatógenos como Fusarium, el cual causa la muerte de la planta adulta (Rojo et al, 2007).

lll.MATERIALES Y MÉTODOS
Se realizaron tres diferentes tipos de interacciones microbianas, Dual, Igarashi y Gauze
-Enfrentamiento Dual:
Para la técnica de enfrentamiento Dual su utilizaron dos microorganismos, Trichoderma sp y Fusarium, se sembraron
ambos hongos por medio de punción, a una distancia de tres centímetros de las paredes de la caja de Petri en un medio de
cultivo PDA, finalizando se llevaron a incubar a 22°C durante 7 días. Al pasar los días estipulados se calculó el Porcentaje
Inhibición Micelial (PIM), por medio de la fórmula:
𝐶𝑟𝑒𝑐𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑙𝑖𝑏𝑟𝑒 − 𝐶𝑟𝑒𝑐𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝐼𝑛𝑓𝑙𝑢𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎𝑑𝑜
𝑃𝐼𝑀 =
𝐶𝑟𝑒𝑐𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑙𝑖𝑏𝑟𝑒
-Técnica IGARASHI:
El segundo enfrentamiento, es decir IGARASHI, se realizó en PDA y Avena, en el centro de la caja de Petri se dibujó un
cuadro de 3x3 cm, se sembró masivamente el controlador, Trichoderma s.p y se colocó un disco del patógeno, Fusarium
s.p, posterior a esto se incubó por un lapso de 7 días a una temperatura de 22°C.
-Técnica GAUZE
Finalmente en cultivo nutritivo se realiza el enfrentamiento Gauze, se realizó en el medio de cultivo Avena. En el cual se
realizó una siembra masiva de la bacteria Streptomyces sp y por encima de la siembra de manera invertida se sembró los
microorganismos E.Coli, Bacillus sp y S.aureus, posteriormente se llevó a incubar a 22°C durante 7 días.
Como fin se realizó el conteo de las bacterias y hongos presentes en las cajas petri y su respectivo análisis macroscópico y
microscópico de todas las muestras obtenidas de las anteriores técnicas.

lV.RESULTADOS
Técnica enfrentamiento Dual
Se desarrolló una confrontación microbiana en el medio de cultivo PDA, en esta técnica se realizó una observación de las
características macroscópicas del Trichoderma, donde se pudo contemplar que este era de color verde y tenía una textura
pulverulenta. Mientras que Fusarium tenía una textura algodonosa y era de color blanco. En esta interacción se pudo
evidenciar que Fusarium tuvo un leve crecimiento pero Trichoderma, el cual actúa como controlador, inhibiendo el
crecimiento del patógeno Fusarium, debido a que este tiene mecanismos de espacio, nutrientes y micoparasitismo ,como
se puede observar en la Imagen N°1. Se realizó la medida de crecimiento del patógeno, dando como resultado 2cm.
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Agar PDA

Imagen N°1 Enfrentamiento DUAL: Fusarium-Trichoderma

Microorganismo Crecimiento libre Crecimiento influenciado

Fusarium sp. 41mm 20mm

Trichoderma s. NO APLICA NO APLICA

De esta manera se puede calcular el porcentaje de inhibición micelial (PIM)

𝐶𝑟𝑒𝑐𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑙𝑖𝑏𝑟𝑒 − 𝐶𝑟𝑒𝑐𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑖𝑛𝑓𝑙𝑢𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎𝑑𝑜

𝑃𝐼𝑀 = 𝑥 100
𝐶𝑟𝑒𝑐𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝐿𝑖𝑏𝑟𝑒

41𝑚𝑚 − 20𝑚𝑚
𝑃𝐼𝑀 = 𝑥100
41 𝑚𝑚

𝑃𝐼𝑀 = 51.2%
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Técnica de Igarashi.
En los medios de cultivo PDA y Avena, se pudo observar que Trichoderma tenía una contextura pulverulenta, era de color
verde y en el centro blanco, mientras que Fusarium, no tuvo un crecimiento tan alto ya que Trichoderma tuvo un
crecimiento mucho mayor. Con esta técnica se pudo calcular el crecimiento patógeno que dio como resultado 1 cm en
Avena y igualmente 1cm en PDA . Como se puede observar en la Imagen N°2.

Agar PDA Agar Avena

Imagen N°2 IGARASHI. PDA Y Avena: Fusarium-Trichoderma

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Mientras que en el medio avena, utilizando al Fusarium como patógeno y el Trichoderma como controlador, se pudo
observar que el Fusarium tuvo un pequeño crecimiento en el agar PDA y en el medio de cultivo Avena no tuvo un
crecimiento significativo , sin embargo el Trichoderma si creció, expandiéndose por toda la caja de Petri, además se puede
observar que cubrió al Fusarium, esto significa que en la prueba de Igarashi hubo micoparasitismo completo, el Trichoderma
creció sobre el Fusarium, hubo competencia por espacio y nutrientes. Como se puede observar en la Imagen N°2

Microorganismo mm en crecimiento radial agar Mm en crecimiento radial agar PDA

avena
Fusarium oxysporum 10 mm 10 mm

Técnica de Gauze
Para la interacción de microorganismos en Gauze se realizó en el medio de cultivo Avena. Basado en siembra masiva de la
actinobacteria Streptomyces y encima de esta la siembra de las bacterias; E.Coli, S.Aureus y Bacillus sp, de la cuales se
encontrando diferentes características significativas entre estas.

Agar Avena

Imagen N°3 GAUZE. Avena: Streptomyces- Bacillus sp-E.Coli-S.Aureus

En el medio nutritivo, Streptomyces fue capaz de producir antibióticos de amplio espectro el cual se evidencio en la
inhibición en las bacterias S.Aureus y E. Coli, a diferencia de la bacteria Bacillus sp que muestra resistencia a la
enfrentarse con la actinobacteria. Como se observa en la Imagen N°3.
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Streptomyces- Bacillus sp

Se puede observar cómo la bacteria Bacillus sp creció de forma cremosa y transparente a su alrededor. También cabe a
destacar que la muestra se contaminó por la muestra Trichoderma debido a su presencia en el aire ya que anteriormente
se había trabajado con esta.
Streptomyces- E.Coli

Esta interacción en el medio de avena con E. Coli y Streptomyces, se logra observar que esta no permitió crecer en gran
cantidad a Escherichia Coli. lo que indica que el Streptomyces logró controlar el crecimiento de la bacteria.

Streptomyces- S.Aureus

En este enfrentamiento se evidencia inhibición total con respecto a la bacteria A. Aureus al igual que pasó con la bacteria
E.Coli, Streptomyces logró controlar efectivamente sobre estas.

Microorganismo Halos de inhibición Halos de inhibición Halos de inhibición

en mm de E. Coli en mm de Bacillus en mm de S. Aureus
Sp.
Streptomyces 180 mm 220 mm 80 mm

V. DISCUSIÓN
El uso del hongo heterótrofo del género Trichoderma, como controlador de organismos, es aquel que puede alterar el
equilibrio microbiológico, es así como Trichoderma es un microorganismos con alta velocidad de crecimiento, alta
competencia por espacio y por consiguiente pueden alterar el crecimiento de los hongos y bacterias que descomponen la
materia orgánica, reduciendo la población microbial y de esta manera posiblemente disminuyendo los procesos biológicos.
(BORRERO & SILVA, 2005).
De esta manera “Complexity of Trichoderma-Fusarium interaction and manifestation of biological control”, evidencia que
Trichoderma es un mico-parásito que puede controlar a los agentes patógenos, de igual forma Trichoderma se puede
aplicar una combinación de mecanismos para controlar el crecimiento de patógeno, por medio de tres mecanismo son:
competencia por nutrientes, antibiosis, el parasitismo y mico-especies. (Poornima, 2011)
Según la bibliografía consultada de “Eficacia de Trichoderma harzianum a34 en el biocontrol de Fusarium oxysporum f.
Sp. cubense, agente causal de la marchitez por fusarium o mal de Panamá de los bananos en Cuba”, se encontró que
Trichoderma induce altos niveles de enzimas líticas sobre las células de las paredes de los patógenos R. solani, P.
aphanidermatum y Fusarium oxysporum. Dando así uneficacia estuvo relacionada al micoparasitismo, inhibición enzimática
y lisis con el Fusarium creando un control sobre este.(Pérez Vicente, Batlle Viera, Chacón Benazet & Montenegro Moracén,
2009). Debido a esto trichoderma, al ser un agente control es muy importante ya que afecta a diferentes especies, es así
como Escherichia Coli es un bacilo gram – y por estas características trichoderma puede controlar a Escherichia Coli al ser
un biocontrolador muy potente (Leelavathi, Vani, Reena, 2014).
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Streptomyces son bacterias filamentosas, Gram-positivas que son productores prolíficos de antibióticos y un significativo
reservorio de resistencia a los antibióticos, siendo esta bacteria Streptomyces, el género más grande productora de
antibióticos, el grupo dominante de actinomicetos. D esta manera Streptomyces varía extensamente en los recursos de los
que pueden crecer y en sus eficiencias de crecimiento relativo de los diferentes recursos. (Schlatter, D. C., & Kinkel, L. L,
2015).
Conclusiones
El éxito de las cepas de Trichoderma como agentes de control biológico se debe a su alta capacidad reproductiva, habilidad
para sobrevivir bajo condiciones ambientales desfavorables y su eficiencia en la utilización de nutrientes fueron los factores
que lograron ejercer un control sobre el Hongo patógeno Fusarium.
La actinobacteria Streptomyces se caracterizan por poseer un metabolismo secundario complejo y Producir
numerosos antibióticos, esto le permitió la capacidad de inhibir el crecimiento de las bacterias S.Aureus y E. Coli y Bacillus
sp.
Esta práctica de laboratorio fue de gran utilidad para nuestro papel como ingenieros ambientales ya que al conocer y
evidenciar lo que es y cómo actúa los agentes de control biológico como Trichoderma, esto refleja una de la grandes
prácticas que pueden lograr hacer los microorganismos para lograr mejorar la calidad del ecosistema.

BIBLIOGRAFÍA
● Alston, D. (2011). General Concepts of Biological Control. Utah State University Extension And Utah Plant Pest
Diagnostic Laboratory.
● Benítez, T., Rincón, A., Limón, M., & Codón, A. (2004). Biocontrol mechanisms of Trichoderma strains. International
Microbiology.
● Chet, I., & Inbar, J. (1994). Biological Control of Fungal Pathogens. Applied Biochemistry And Biotechonology, 48.
● Poornima, S. (2011). Complexity of Trichoderma-Fusarium interaction and manifestation of biological control.
Australian Journal Of Crop Science, 5(8).
● Borrero & silva. (2005). Efectos de Trichoderma (in vitro) en los microorganismos no patógenos descomponedores
de la materia orgánica de un suelo oxisol clase IV del piedemonte llanero.
● Harman, G., Howell, C., Viterbo, A., Chet, I., & Lorito, M. (2004). Trichoderma species — opportunistic, avirulent
plant symbionts. Nature Reviews Microbiology.
● Leelavathi, M., Vani, L., & Reena, P. (2014). Antimicrobial activity of Trichoderma harzianum against bacteria and
fungi. International Journal Of Current Microbiology And Applied Sciences, 3(1).
● Medina Cuevas, H., & Evangelista Martínez, Z. (2011). AISLAMIENTO Y BÚSQUEDA DE ACTINOBACTERIAS
DEL SUELO PRODUCTORAS DE ENZIMAS EXTRACELULARES Y COMPUESTOS CON ACTIVIDAD
ANTIMICROBIANA. UNACAR TECNOCIENCIA.
● Pal, K., & McSpadden Gardener, B. (2006). Biological Control of Plant Pathogens. The Plant Health Instructor.
● Pérez Vicente, L., Batlle Viera, A., Chacón Benazet, J., & Montenegro Moracén, V. (2009). Eficacia de Trichoderma
harzianum a34 en el biocontrol de Fusarium oxysporum f. Sp . cubense, agente causal de la marchitez por
fusarium o mal de Panamá de los bananos en Cuba. Fitosanidad, 13(4), 259-264.
● Orr, D. (2009). Biological Control and Integrated Pest Management. Integrated Pest Management: Innovation-
Development Process.
 Microbiología Ambiental
● Schlatter, D. C., & Kinkel, L. L. (2015). Do tradeoffs structure antibiotic
inhibition, resistance, and resource use among soil-borne Streptomyces?. BMC
Evolutionary Biology, 15186.
● Ventura, M., Canchaya, C., Tauch, A., Chandra, G., Fitzgerald, G., Chater, K., & Sinderen, D. (2007). Genomics of
Actinobacteria: Tracing the Evolutionary History of an Ancient Phylum. MICROBIOLOGY AND MOLECULAR
BIOLOGY REVIEWS.
● Whippss, J. (2016). Microbial interactions and biocontrol in the rhizosphere. Journal Of Experimental Botany, 52,
487-511.