Curso de especialización de Cultivos Celulares.

Unidad 6: Técnicas producción biomoléculas Curso 2020/2021

UNIDAD 6: APLICACIONES DE LAS TÉCNICAS DE PRODUCCIÓN DE

BIOMOLÉCULAS.

1. BIOMOLÉCULAS QUE SE PUEDEN PRODUCIR MEDIANTE CULTIVOS

CELULARES.
Actualmente una de las aplicaciones más interesantes de los cultivos celulares es la obtención de
productos de uso terapéutico mediante el desarrollo de procesos de producción y purificación de
sustancias bioterapéuticas. Estas sustancias pueden ser DNA o células y proteínas con actividad
terapéutica tales como hormonas, enzimas y anticuerpos. Algunos de los tipos de biomoléculas
que se pueden producir son:

a. Factores sanguíneos: son utilizados para tratamiento de enfermedades de la sangre tipo

hemofilia, trombosis, etc. Algunos ejemplos son:
- Factor VIII: que se utiliza como tratamiento de la hemofilia A para prevenir o detener las
hemorragias que están causadas por la falta de dicho factor
- Factor IX que está indicado para el tratamiento y profilaxis de hemorragias en pacientes
con hemofilia B (déficit congénito de factor IX).
- El activador del plasminógeno tisular (tPA)se emplea en el tratamiento de enfermedades
que provocan coágulos sanguíneos, como el embolismo pulmonar, el infarto de miocardio
y la isquemia cerebral.

b. Factores de crecimiento:
- Eritropoyetina recombinante (rHuEp),Se usa para el tratamiento de la anemia del paciente
con insuficiencia renal crónica (IRC) para el tratamiento de la anemia de otros pacientes no
renales como anemias del prematuro, padecimientos oncohematológicos, infección por el
virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y reducción de las transfusiones de sangre
alogénica en cirugía.
- El G-CSF o factor estimulante de colonias de granulocitos ayuda a que la médula ósea
produzca más glóbulos blancos. Se utiliza para tratar la neutropenia (afección por la que
hay menos glóbulos blancos que lo normal), prevenir infecciones y preparar la sangre para
la recolección de cierto tipos de glóbulos sanguíneos. El G-CSF se utiliza en pacientes con
determinados cánceres y neutropenia causados por algunos tipos de quimioterapia y se usa
en pacientes con neutropenia crónica grave que no es causada por un tratamiento del
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cáncer. Además, se utiliza en pacientes que recibirán un trasplante autógeno de células

madre.
- La eficacia del uso de otros Factores de Crecimiento se basa en la capacidad que poseen
de provocar un potente estímulo regenerativo de los tejidos, alterados por procesos
inflamatorios, degenerativos, por lesiones traumáticas o deportivas. Su uso se ha extendido
a diversas especialidades: traumatología y reumatología, odontología, dermatología,
estética, neurología, etc. En concreto, el tratamiento con factores de crecimiento se aplica
para frenar la progresión de la artrosis, especialmente en grandes articulaciones de carga
como la rodilla o la cadera. También promueven la regeneración del cartílago y reducen
los síntomas característicos de la artrosis: inflamación de la sinovial, derrame, deformidad,
dolor, pérdida de movimiento, etc. Asimismo, se aplica en lesiones de hueso, tendón y
músculo para reducir su tiempo de recuperación.

c. Citoquinas: son proteínas de señalización elaboradas por los glóbulos blancos que actúan
como moduladores clave de la respuesta inmune e inflamatoria normal del cuerpo y en la
capacidad del sistema inmunitario para responder al cáncer. Inducen una diversidad de
respuestas biológicas tales como la proliferación, diferenciación, activación, inflamación y
muerte celular. Algunos ejemplos de citocinas que se usan para tratar el cáncer son las
siguientes:
- Interferones (INF): el interferón alfa (INF α) mejora la respuesta inmunitaria a las células
cancerosas mediante la activación de algunos glóbulos blancos, como los linfocitos
citolíticos naturales y las células dendríticas y también también desacelera la
multiplicación de las células cancerosas o estimula su destrucción.
- Interleucinas (IL): hay más de una docena de interleucinas y la IL-2 o factor de
crecimiento de células T aumenta el número de glóbulos blancos en el cuerpo, incluso las
células T citolíticas y los linfocitos citolíticos naturales y promueve una respuesta
inmunitaria contra el cáncer. También ayuda a que las células B (otro tipo de glóbulo
blanco) produzcan sustancias que atacan las células cancerosas. Otro ejemplo es la
interleucina IL-11 que aumenta la producción de plaquetas y se puede usar en el
tratamiento de la trombocitopenia.

d. Enzimas terapéuticas:
- Se pueden utilizar enzimas lisosomales recombinantes por biotecnología para el
tratamiento de enfermedades de depósito lisosomal en las que existe un déficit en el
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organismo de dichas enzimas provocando acumulación de grandes moléculas dentro del

lisosoma.Algunos ejemplos son:

- La uricasa es una enzima utilizada en el tratamiento de la gota (acumulación del ácido

úrico por un exceso de producción o una alteración en la eliminación por los riñones). El
cuerpo produce ácido úrico cuando descompone purinas.Normalmente, el ácido úrico se
disuelve en la sangre y pasa por los riñones a la orina. Si se produce demasiado ácido úrico
o los riñones excretan muy poco, éste se acumula y forma cristales de urato con forma de
aguja puntiaguda en una articulación o el tejido que la rodea, y esto causa dolor,
inflamación e hinchazón.
- También está extendido el uso de las enzimas en dermatología (hialuronidasa, colagenasa,
lipasa).

e. Las hormonas recombinantes: se usan en toda clase de terapias de sustitución hormonal

para aquellos afectados de enfermedades en las cuales la persona no produce la cantidad
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necesaria de una determinada hormona. Algunos ejemplos son: glucagón, hormona de

crecimiento humana (hGH) , insulina)
f. Anticuerpos monoclonales: son muy utilizados actualmente debido a su alta
especificidad, su versatilidad a la hora de ser modificados química o biológicamente y a la
alta biodisponibilidad para producirse a partir de cultivos celulares. Algunos ejemplos
sobre anticuerpos monoclonales aprobados por la FDA a fecha de mayo de 2016 son :
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g. Vacunas: la primera vacuna recombinante que se aprobó para su uso farmacéutico fue la
vacuna contra el virus de la hepatitis B. Hasta entonces la vacunación contra esta
enfermedad se hacía con virus atenuados. La vacuna recombinante se produce en levaduras
recombinantes que portan un gen que codifica una proteína de la cubierta del virus.
Algunas toxinas que se utilizan para vacunas también se obtienen actualmente mediante
Ingeniería Genética. La categoría más importante de los productos biofarmacéuticos que
están actualmente en desarrollo es el de las vacunas, con casi 100 productos diferentes. La
mayoría se están desarrollando para tratar o prevenir el cáncer. El resto se están
desarrollando contra el SIDA y diferentes infecciones, fundamentalmente del aparato
respiratorio.
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2. TIPOS DE CÉLULAS QUE SE UTILIZAN PARA LA PRODUCCIÓN INDUSTRIAL DE

BIOMOLÉCULAS (CHO, NSO, Sp2/o, PER.C6 e hibridomas).

Algunos de los tipos de células más utilizadas para la producción de biomoléculas a gran escala ,
concretamente anticuerpos monoclonales recombinantes para su uso en terapia humana, son las
células :

- Las células CHO son células derivadas del ovario de hámster chino (Cricetulus griseus) y cuyo
uso está ampliamente extendido en el campo de la biotecnología como cultivos celulares para
la expresión y producción de proteínas terapéuticas. Esta línea celular tiene alta capacidad para
alcanzar grandes densidades celulares. El factor tPA (activador de plasminógeno tisular) es la
primera proteína recombinante derivada de CHO aprobada en 1986.
- Las células NSO y Sp2/0 son células linfoides murinas y al igual que las células CHO también
son muy utilizadas para la producción de anticuerpos usando la tecnología de ADN
recombinante.
- Los hibridomas son líneas celulares obtenidas de la fusión de células plasmáticas tumorales de
mieloma con linfocitos B (productores de anticuerpos), obtenidas de animales previamente
inmunizados contra un determinado antígeno.
- Las células PER.C6 son células obtenidas por Fallaux y Bout en 1995 de cultivos de retina
embrionaria. De esta forma, a partir de los retinoblastos se obtuvieron siete líneas (PER.C1,
PER.C3, PER.C4, PER.C5, PER. C6, PER.C8 y PER.C9), de las cuales se eligió el clon 6
(PER.C6) . Estas células crecen en cultivos en suspensión sin suero utilizando un medio
desprovisto de proteínas derivadas de humanos o animales y se transfectan fácilmente, lo que
da como resultado una alta expresión del gen transferido. Esta línea celular es usada para la
producción industrial a gran escala de proteínas terapéuticas, especialmente la IgG humana.

3. TIPOS DE REACTORES QUE SE UTILIZAN PARA LA PRODUCCIÓN DE

BIOMOLÉCULAS.

Los biorreactores son los vehículos contenedores de cualquier proceso de producción basado en la
biotecnología (ya sea para la fabricación de cerveza, compuestos orgánicos o aminoácidos,
antibióticos, enzimas o vacunas, etc.). Siempre se debe diseñar el sistema contenedor más
apropiado para crear el entorno adecuado para optimizar el crecimiento y la actividad metabólica
del biocatalizador. Los biorreactores varían desde simples recipientes abiertos con o sin agitación
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a sistemas integrados asépticos complejos que implican niveles variables de control avanzado por
computadoras.
Para alcanzar la optimización del sistema biorreactor hay que tener en cuenta:
- El biorreactor debe diseñarse para evitar la entrada de organismos contaminantes y para
contener los organismos deseados.
- Todas las partes del biorreactor deben someterse a las mismas condiciones.
- El volumen de cultivo debe permanecer constante, es decir que no haya escapes ni
evaporación.
- Los nutrientes incluido el oxígeno deben ser proporcionados para que difundan dentro de
cada célula.
- Los parámetros ambientales tales como la temperatura, pH, etc., deben controlarse, y el
volumen del cultivo debe estar bien mezclado.

En función al tipo de proceso que se aplica para la producción de biomoléculas, podemos

diferenciar los siguientes tipos de biorreactores:
- Discontinuo: la producción se realiza por lotes o tandas, sin alimentación. Se introduce en
el biorreactor la carga total de cada proceso de cultivo y se deja que se lleve a cabo el
proceso productivo por el tiempo que sea necesario, denominado tiempo de retención. En
este tipo las células se cultivan en un recipiente con una concentración inicial sin que ésta
sea alterada por nutrientes adicionales por lo que el volumen permanece constante y solo
las condiciones ambientales del medio son controladas (ph, temperatura, etc.)
- Semicontinuo: en este caso la producción se realiza por lotes, pero con una línea de
entrada o alimentación para que el sistema de cultivo tenga un producto con máximo de
crecimiento (exponencial) y aumente la productividad.
- Continuo: el biorreactor tiene un suministro constante de nutrientes y una eliminación de
subproductos, mientras se mantienen las células en el biorreactor. Esto crea una situación
bastante estable para el producto y las células, con un tiempo de retención del producto
corto para preservar su calidad.

4. MEDIOS DE CULTIVO ESPECÍFICOS PARA LA PRODUCCIÓN DE

BIOMOLÉCULAS.

Para la optimización de los procesos de producción a gran escala de biomoléculas (con células
eucariotas en cultivo o con bacterias) mediante biorreactores, se requiere una adecuada
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formulación del medio de cultivo específico para cada proceso. Para definir los medios de cultivo
óptimos se debe realizar un estudio de la cinética de crecimiento y una caracterización del
metabolismo de los microorganismos o de las líneas celulares eucariotas utilizadas. Con estos
procesos de optimización es posible definir la densidad celular máxima para lograr una
producción óptima y estable.
Los medios de cultivo celular tienen una composición compleja y resulta difícil optimizar los
componentes individuales de los medios. La mayoría de los medios de cultivo clásicos se
diseñaron para cultivos de baja densidad a pequeña escala y suelen requerir suero como nutriente
principal. Sin embargo, en la industria de la biotecnología, donde existe la necesidad de mantener
altas densidades celulares y aumentar la productividad celular, el desarrollo y la optimización de
los medios de cultivo es muy crítico. Normalmente, los medios para la industria biotecnológica no
contienen suero y tienen una concentración mucho mayor de nutrientes que los medios clásicos.

La formulación final del medio de cultivo a utilizar va a depender de:

- Tipo de biomolécula que se producirá.
- Densidad Celular: Así, por ejemplo, si se pretende la producción de virus para el
aislamiento final de alguna biomolécula viral, serán necesarias altas densidades celulares,
además de una elevada concentración de nutrientes en el medio, para lograr una buena
replicación del virus después de la infección. Por otro lado, si lo que se pretende es
producir una proteína recombinante, se requiere una alta densidad celular pero los
nutrientes necesarios para el crecimiento celular pueden competir con los necesarios para
la producción de proteínas. Por lo tanto, es muy importante determinar cuidadosamente las
densidades celulares máximas que un medio dado puede sostener para un nivel requerido
de productividad.
- Líneas celulares que se utilizarán para la producción: Las diferentes líneas celulares tienen
diferentes requisitos nutricionales debido a la diferencia en el metabolismo. Además,
ciertas líneas celulares tienen requisitos nutricionales específicos, como el colesterol para
las células de mieloma NS0 y los fibroblastos diploides normales requieren factores de
unión para adherirse y extenderse sobre una superficie para su crecimiento.
- Proceso de fabricación: Las peculiaridades del proceso de fabricación no solo afectaría la
elección del medio de cultivo celular, sino también a la optimización del proceso.
Si se utiliza un único medio para mantener el crecimiento y la productividad celular, el
medio debe ser rico en nutrientes pero permanecer en los límites fisiológicos de las células.
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Si se utilizan varios medios durante el transcurso del cultivo celular, según la etapa del
proceso. Así el medio de crecimiento se diseña de tal manera que tiene concentraciones de
nutrientes más bajas cuando las densidades celulares son bajas durante la inoculación, pero
mantienen altas tasas de crecimiento celular durante la ampliación del cultivo y la
producción temprana. También se puede utilizar un medio de producción separado que
tenga concentraciones elevadas de nutrientes cuando el cultivo alcanza la etapa de
producción.

5. ANTICUERPOS MONOCLONALES GENERADOS MEDIANTE EL CULTIVO DE

HIBRIDOMAS.

Las empresas biofarmacéuticas tienen líneas de producción de anticuerpos monoclonales (mAb)

con las que intentan mantener la rentabilidad de los procesos y la calidad con el menor costo. La
capacidad de fabricación suele ser un problema ya que los tratamientos con los mAb requieren
grandes dosis durante mucho tiempo. La gran demanda existente ha provocado la construcción de
plantas de fabricación a gran escala que contienen muchos biorreactores de cultivo celular de más
de 10.000 litros. Con la selección de clones altamente productivos y mediante la optimización del
medio de cultivo y del biorreactor se puede conseguir una mejora en la productividad.

Es frecuente el uso de hibridomas para la producción de mAb que proceden de la fusión de

Linfocitos B productores de un determinado mAb con una línea tumoral. Se ha observado que es
fundamental controlar metabolitos utilizados como fuentes de energía como la glutamina o
aminoácidos esenciales (isoleucina) para mantener una buena productividad de anticuerpos. Las
líneas de células de hibridoma son generalmente altamente dependientes de la glutamina. Por lo
general, carecen de una fase estacionaria después de alcanzar una densidad celular máxima y
luego disminuyen rápidamente en viabilidad. La optimización del medio, por tanto, reduciría la
disminución de la viabilidad y mejoraría la producción de anticuerpos monoclonales.

La industria farmacéutica ha desarrollado y adaptado novedosos sistemas de cultivo con

hibridomas para la producción de mAb:
- Biorreactor de lecho fibroso (FBB) para cultivar células de hibridoma para la producción
continua a largo plazo de anticuerpos monoclonales (MAb). Se utilizó una matriz fibrosa
de poliéster no tejido para inmovilizar las células para alcanzar una alta densidad celular
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viable de 3 x 108 células/cm. Esta matriz fibrosa altamente porosa, permitió la

transferencia de medio eficiente, la inmovilización celular y el crecimiento continuo y
regeneración que son fundamentales para mantener una alta densidad de poblaciones
celulares viables y productivas. Las células inmovilizadas en la matriz fibrosa tenían una
alta viabilidad, siendo capaces de producir hasta 1 g/litro/día.
- Uso de membranas cerámicas para la retención de hibridomas productoras de mAb,
alcanzando rendimientos de 690 mg /litro/día.

6. PURIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ANTICUERPOS.

La purificación industrial de mAb se lleva a cabo mediante métodos cromatográficos de afinidad,

captura e intercambio iónico. Con estos procesos de purificación se pretende producir de manera
fiable y predecible un producto adecuado para su uso en humanos, mejorar los procesos, mejorar
el rendimiento y los costes de producción.
Deben eliminarse las impurezas como las proteínas de la célula huésped, el ADN, los virus
endógenos, las endotoxinas, los agregados, etc., y también deben eliminarse las impurezas
introducidas durante el proceso de purificación (proteína A utilizada en resinas y filtros, tampones
de proceso y agentes tales como detergentes que pueden haber sido empleados para la reducción
de virus, etc.).

Los pasos que suelen realizarse de forma general en los procesos de purificación de mAb a nivel
industrial son:
- Recolección del cultivo del biorreactor.
- Centrifugación en condiciones estériles para la producción de un líquido filtrado y
clarificado adecuado para cromatografía.
- Cromatografía basada en proteína A para eliminación a gran escala de las impurezas.
- Cromatografía de intercambio iónico (catiónico o aniónico) para la eliminación de restos
de ADN, proteínas de la célula huésped y los agregados.
- Concentración del producto eluido en el tampón deseado.

Los rendimientos generales de purificación a partir del fluido de cultivo celular oscilan entre el 70
y el 80%, y el mAb concentrado se almacena congelado o en forma líquida y por último se envía
al lugar de fabricación del medicamento. Los recientes avances en los procesos cromatográficos
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de separación hacen posible purificar hasta 5 g /litro. Una vez finalizada la producción, los mAb
son cuantificados mediante ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), WB (Western blot),
Citometría de flujo o Inmunoprecipitación.

Bibliografía de ampliación:

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