PRÁCTICA No.

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Determinación de la enzima peroxidasa por método cualitativo
Introducción:
La mayor parte de las enzimas tienen un nombre que se forma
adicionando el sufijo "-asa" al nombre del sustrato sobre el cual actúan
o a un término que describe las reacciones que catalizan. Las
oxidorreductasas catalizan reacciones de oxidación-reducción. La
mayor parte de estas enzimas se conocen como deshidrogenasas,
pero algunas de ellas reciben el nombre de oxidasas, peroxidasa,
oxigenasas, o reductasas. La temperatura debido a la naturaleza
proteínica de las enzimas éstas pueden desnaturalizarse a
temperaturas elevadas y, en consecuencia, disminuir su velocidad de
reacción. Aproximadamente hasta los 45°C se acelera la reacción, tal
como lo establecen las leyes de la termodinámica; por encima de este
límite aparece el factor de desnaturalización proteínica, el cual
aumenta significativamente hasta los 55°C, en donde una brusca
desnaturalización destruye la función catalítica.
La peroxidasa es la enzima más resistente al calor en frutas y
verduras. Tanto que se controla mediante la prueba de la enzima
peroxidasa si las enzimas se inactivan durante el procesamiento de
frutas y verduras. Esta cataliza la oxidación de compuestos como
fenoles ya sea el guayacol o el pirogalol.
Casi todos los profesionales médicos conocen los usos prácticos del
peróxido de hidrógeno, un subproducto de ciertas enzimas
peroxidasas. Este compuesto es extremadamente potente y puede
matar muchos tipos de bacterias, virus e incluso algunas células
cancerosas. La mayoría de las aplicaciones médicas del peróxido de
hidrógeno implican el uso de una enzima para descomponer el
compuesto en sus componentes básicos: agua y oxígeno. Por lo tanto,
casi todas las aplicaciones médicas involucran el uso de una enzima
para producir peróxido de hidrógeno. Este potente compuesto se
puede utilizar de muchas maneras diferentes sin efectos secundarios
negativos.
El guayacol es un líquido incoloro y es el sustrato oxidable más usado,
el cual es oxidado por un complejo coloreado de tetraguayacol en
presencia de la enzima peroxidasa. Estas enzimas dañan o deterioran
la calidad de los productos en este caso las frutas y verduras es por
esto que la industria alimentaria utiliza métodos de preservación como
el enlatado o en algunos casos el escaldado. Por ello la actividad
sobrante debe de inactivarse hasta que la actividad inicial de la
peroxidasa disminuya. Esto varía según el tipo de verdura y fruta.

Objetivo:
Determinar la actividad enzimática inicial del vegetal escaldado,
conocer los componentes químicos necesarios para llevar a cabo esta
identificación y calcular los valores de actividad enzimática residual
para el producto evaluado en las condiciones de tiempo y temperatura
utilizados en el laboratorio.
Hipótesis:
Los vegetales evaluados en este caso la zanahoria, la papa y el ejote
tendrán diferentes tiempos de inactivación de la peroxidasa.
Materiales y métodos:
Material
 1 baño maría
 1 tripie
 1 mechero
 1 termómetro
 1 matraz aforado de 100 ml
 1 matraz erlenmeyer de 250 ml
 2 pipetas serológicas de 5 ml
 8 capsulas de porcelana
 1 probeta de 50 ml
 1 piceta de agua destilada
 1 propipeta
  2 pinzas de disección
 1 mango de bisturí
 Gasas
Reactivos
 Peróxido de hidrogeno al 3%
 Guayacol
 Etanol
 Agua destilada
Vegetales
 Papa
 Zanahoria
 Ejote
Metodología
1. Para la prueba de la inactivación de enzimas se requiere una
solución de guayacol y agua oxigenada al 1%. La solución de
guayacol se obtiene disolviendo un gramo de guayacol en 50 ml
de alcohol etílico; se completa el volumen hasta 100 ml con agua
destilada.
2. Para obtener agua oxigenada al 1%, se diluye el agua oxigenada
al 3% con dos partes de agua destilada. Una vez que se tiene
disponible las soluciones se procede al análisis de las muestras
preparadas.
En el análisis se siguen los siguientes pasos:
1. Se deposita el material cortado en agua a temperatura de
ebullición; midiendo los diferentes tiempos de escaldado (1, 2, 3
minutos etc.) hasta que se haya inactivado la enzima peroxidasa.
2. Para verificar la inactivación se hace lo siguiente: se adicionan 5
ml de la solución de guayacol al 1%, cubriendo el material
cortado; después se le adicionan 5 ml de agua oxigenada al 1%.
En el análisis se siguen los siguientes pasos:
1. Poner a calentar el agua destilada a ebullición
2. Cortar el primer vegetal con dimensiones similares (tamaño y
grosor).
3. Se deposita el material cortado en diferentes paquetes
elaborados con gasas cada uno contendrá una pequeña
proporción similar del vegetal.
4. Se introducen todos los paquetes con el primer vegetal al mismo
tiempo en el agua a temperatura de ebullición del baño maría.
5. Sacar el primer paquete al primer minuto, midiendo las
reacciones que se van a llevar a cabo, se le quita la gasa y se
colocan en la cápsula de porcelana la muestra de vegetal
escaldado a la que se le adicionan 5 ml de la solución guayacol
al 1% y 5 ml de peróxido de hidrógeno al 1 %.
6. Después de tres minutos, se controla el desarrollo del color en
las superficies cortadas de la solución. La efectividad del
escaldado se mide, según el color que se ha desarrollado como
sigue:

7. Continuar con los otros paquetes de muestras del primer vegetal,

sacando el 2do al minuto 2, el 3ero al minuto 3 y así
sucesivamente. Hasta identificar a que tiempo se inactiva la
enzima peroxidasa (Reacción negativa).
Resultados y discusión
La siguiente tabla se muestran los resultados obtenidos de los
diferentes tiempos en los que tardo la peroxidasa en inactivarse en
cada vegetal y las diferentes temperaturas de los escaldados
correspondientes.
TIEMPO 1 2 3 4 5 6 TEMPERATURA

(MINUTOS) DEL

ESCALDADO

PAPA POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POCO NEGATIVO 89°C

TENUE TENUE INDICATIVO

ZANAHORIA POSITIVO POSITIVO POCO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO 89°C

TENUE INDICATIVO

EJOTE POSITIVO POSITIVO POSITIVO POCO POCO NEGATIVO 88°C

TENUE TENUE TENUE INDICATIVO INDICATIVO

Tabla 1. Reacción, tiempo y temperatura de inactivación de la enzima

peroxidasa

En la tabla 1 podemos observar que el tiempo de inactivación de la

enzima peroxidasa de la papa se dio en el minuto 6, la papa escaldada
fue cortada en trozos cuadrados de un grosor de aproximadamente
5mm y con una temperatura estable de 89°C, en la zanahoria el
tiempo de inactivación de la enzima peroxidasa se dio en el minuto 4,
la zanahoria escaldada fue cortada en círculos de aproximadamente
4mm, con una temperatura de 89°C estables, en el ejote el tiempo de
inactivación de la enzima peroxidasa se dio en el minuto 6, el ejote
escaldado fue cortado en cilindros pequeños con un tamaño
aproximado de 4mm con una temperatura de 88°C estables, el tiempo
de inactivación de la enzima peroxidasa en el ejote pudo haber sido
afectado debido a que la temperatura era 1°C más baja que en las
anteriores pruebas con la papa y la zanahoria.
Conclusión
El propósito de esta práctica fue identificar que los vegetales tuvieron
un diferente tiempo de inactivación de la enzima peroxidasa,
identificando que en la zanahoria el tiempo de inactivación de la
enzima peroxidasa fue más rápido en comparación con el de la papa y
el ejote.
Referencias
Christopher k. Mathews (2002). bioquímica, tercera edición. Addison
Wesley
Eduardo Z. Meza (2002). Introducción a la bioquímica. Trillas
Plou Francisco J. (2008). Las enzimas. Catarata
McKee T. (2016). Bioquímica. Las bases moleculares de la vida.
McGraw Hill
Alan Fersht. (2000). Estructura y mecanismo enzimas. Reverte