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Equipo—

Carmen Aida Palafox Juárez 220051


Fryda Ahidaly Luján Méndez 213130
Evangelina Aldrete Godoy 212883
Margarita Sarai Escalante Torres 213000
Paloma Nicole Gutiérrez López 213074

Asignación—
Uso de la técnica de bioaumentación para remediar suelos contaminados por
hidrocarburos

Fecha—
29 de noviembre de 2022

Materia—
Biotecnología Ambiental

Profesor—
Vianey Ariadna Burboa Charis

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA


Introducción
La biorremediación existe aproximadamente desde el año 600 A.C.; cuando los antiguos romanos
dirigían sus aguas residuales a pozos o tanques fuera de la ciudad donde eran tratadas por la
actividad microbiana. Los microbiólogos han estudiado el proceso desde la década de 1940, ZoBell
en 1946 revisó la acción de microorganismos sobre hidrocarburos, donde la base principal para tratar
estos contaminantes era la bioaumentación de microorganismos que fueran capaces de metabolizar
estos. ZoBell reconoció que muchos microorganismos tienen la capacidad de utilizar hidrocarburos
como única fuente de energía. Identificó, además, que existía una relación altamente dependiente
entre la naturaleza química de los compuestos del petróleo y los microorganismos dentro de la
mezcla. La bioaumentación se dio a conocer con mayor amplitud en Estados Unidos a finales de la
década de 1980 como una tecnología para la limpieza de las costas contaminadas con petróleo
(Hoff, 1993).

Los hidrocarburos son compuestos orgánicos formados por carbono e hidrógeno, los átomos de
carbono unidos forman la columna vertebral de este compuesto, mientras que los átomos de
hidrógeno se unen a los de carbono formando distintas configuraciones. Los hidrocarburos son los
principales componentes del petróleo (hidrocarburos de origen geológico natural, extraídos como
líquidos) y del gas natural (extraídos en forma gaseosa) y sirven como combustibles y lubricantes,
además, sirven de materia prima para producir plásticos, fibras, hules, explosivos y una variedad de
productos químicos usados en la industria (Carey, 2018).
En general, este compuesto es el constituyente principal del petróleo crudo, pero es de importancia
resaltar que el número de hidrocarburos individuales que estén presentes en diferentes crudos y
combustibles derivados del petróleo pueden variar, por lo que se le da al petróleo crudo una
composición diferente según su lugar de procedencia. De esta forma, la proporción de estos
compuestos químicos, formados exclusivamente por átomos de hidrógeno y carbono, puede variar
entre un 50 y un 95% del total. La fracción restante (no-hidrocarburos) está constituida por
compuestos orgánicos que contienen nitrógeno, azufre, oxígeno y trazas de metales pesados como
el níquel o el vanadio.

Los hidrocarburos se dividen en dos clases principales según su estructura química: los
hidrocarburos alifáticos y los hidrocarburos aromáticos (Morrison y Boyd, 1998; Olah et al., 2018). De
acuerdo a su capacidad química para mezclarse con otros compuestos pueden separarse en polares
(asfaltenos y resinas) o no polares (alifáticos y aromáticos) (Borges, 2013).
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Planteamiento del problema
Daños o impactos ambientales de los contaminantes
La contaminación del suelo por hidrocarburos afecta la flora, fauna y microorganismos del suelo
(Madigan et al., 1999), la fertilidad de los suelos, el crecimiento de las plantas, así como la existencia
y sobrevivencia de los animales que se alimentan de éstas (Infante, 1998). En México existen
extensas áreas contaminadas con hidrocarburos procesados del petróleo, debido principalmente a
derrames, así como a las actividades propias de la industria petrolera.
Las principales consecuencias ambientales que se presentan después de un evento de
contaminación por hidrocarburos son: la reducción o inhibición del desarrollo de la cobertura vegetal,
cambios en la dinámica poblacional de la fauna y la biota microbiana, contaminación por infiltración
de cuerpos de agua subterránea, al igual que, el deterioro de la calidad del aire por venteado y otras
malas prácticas, además del incremento de lluvias ácidas y del perjuicio a la red fluvial. (Cohen,
2013).

Daños a la salud
Los suelos contaminados con hidrocarburos representan un riesgo para la salud humana, por lo que
antes de ubicar núcleos poblacionales en zonas impactadas con estos compuestos, es necesario
realizar un diagnóstico del área. Los compuestos poliaromáticos presentes en el diésel y en el
petróleo crudo se consideran potencialmente carcinogénicos para una amplia variedad de
organismos entre los que se encuentran los mamíferos superiores (Agencia de Protección Ambiental
(2010). Así como también la ingestión humana de algunos productos de petróleo tales como gasolina
y kerosén, produce irritación de la garganta y el estómago, depresión del sistema nervioso, dificultad
para respirar y neumonía debido al paso de líquido hacia los pulmones, afectar la sangre, el sistema
inmunitario, el hígado, el bazo, los riñones, y los pulmones.

Cuando la cantidad de petróleo en el ambiente es mayor de la que puede ser reciclada, se convierte
en un contaminante de impacto negativo, ya que entre sus componentes existen altas
concentraciones de sustancias consideradas como residuos peligrosos por su efecto dañino a la
salud. Ejemplos de estos son: benceno, tolueno, etilbenceno, xileno, naftaleno, antraceno,
fenantreno, cresoles, fenoles, ciclopentano, ciclohexano y etileno. En la siguiente tabla se muestra el
número de INE y concentración máxima permitida de algunas sustancias orgánicas:

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Tabla 1. Concentración de hidrocarburos máxima permitida.

Otros tratamientos utilizados


Otros tratamientos a utilizar para la biorremediación de suelos contaminados por suelos
contaminados por metales pesados son:

• Bioestimulación: Es la práctica de eliminar los factores que limitan la biodegradación de los


contaminantes, introduciendo habitualmente nutrientes (nitrógeno y fósforo) y oxígeno en la
zona saturada y en el agua subterránea para aumentar el número y la actividad de los
microorganismos autóctonos capaces de realizar la biodegradación. El proceso de
bioestimulación se usa típicamente para tratar niveles de contaminación de bajos a
moderados. Los compuestos tratados más comúnmente con biorremediación aeróbica son los
constituyentes de hidrocarburos de petróleo.

• Biolabranza: Durante el proceso de biolabranza, la superficie del suelo contaminado es


tratado en el mismo sitio por medio del arado. El suelo contaminado se mezcla con agentes
de volumen y nutrientes, y se remueve periódicamente para favorecer su aireación. Las
condiciones del suelo (pH, temperatura, aireación) se controlan para optimizar la velocidad de
degradación y generalmente se incorporan cubiertas u otros métodos para el control de
lixiviados (Riser-Roberts, 1998). La diferencia entra le biolabranza y composteo, es que, en la
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biolabranza, se mezcla el suelo contaminado con suelo limpio, mientras que el composteo
generalmente se realiza sobre el suelo (Van Deuren y col., 1997). Los contaminantes tratados
con éxito por biolabranza, incluyen diésel, gasolinas, lodos aceitosos, PCP, creosota y coque,
además de algunos pesticidas y HTPs (Alexander, 1994). Es una tecnología de gran escala,
que se practica en los Estados Unidos, Canadá, Reino Unido, Holanda, Suiza, Dinamarca,
Francia y Nueva Zelanda (Reiser-Roberts, 1998).

• Bioventeo: Es una tecnología relativamente nueva, cuyo objetivo es estimular la


biodegradación natural de cualquier compuesto biodegradable en condiciones aerobias. El
aire se suministra en el sitio contaminado a través de pozos de extracción, por movimiento
forzado (extracción o inyección), con bajas velocidades de flujo, con el fin de proveer
solamente el oxígeno necesario para sostener la actividad de los microorganismos
degradadores (Van Deuren y col., 1997). Se utiliza para tratar compuestos orgánicos
biodegradables semivolátiles (COSs) o no volátiles. Además de favorecer la degradación de
contaminantes adsorbidos, pueden degradarse COVs, por medio de su movimiento a través
del suelo biológicamente activo (Eweis y col., 1998). Se ha utilizado con éxito para remediar
suelos contaminados con HTPs, solventes no clorados, pesticidas y conservadores de la
madera, entre otros químicos.

Justificación
Eficiencia o rendimiento de la técnica o tecnología seleccionada
El propósito de la bioacumulación es facilitar un cambio gradual en la población microbiana y no el
de reemplazar a la biomasa existente, para lograrlo, y para lograrlo se requiere un manejo planeado
y controlado para poder mantener la integridad del ecosistema microbiano.
Diversos estudios y casos de aplicaciones han demostrado que el uso de esta técnica para la
biorremediación de hidrocarburos resulta beneficiosa ya que favorece la degradación de compuestos
específicos, pues al adicionar organismos seleccionados se pueden lograr bajos niveles de
compuestos que no sería posible reducir con poblaciones nativas, algunos de estos compuestos
pueden ser fenoles o hidrocarburos aromáticos, siendo estos algunos de los compuestos que
pueden ser reducidos mediante la bioacumulación.
Actualmente los problemas a causa de la contaminación por hidrocarburos es una situación
alarmante ya que no solo puede afectar a los suelos sino también a los cuerpos de agua y este tipo
de problemas va en aumento, es por ello que se deben emplear y seguir investigando diferentes
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técnicas y tecnologías que ayuden a remediar estos problemas, así pues, la bioaumentación tiene la
ventaja de ser una técnica económica a corto o mediano plazo con el fin de mantener las
reducciones de los contaminantes.

Costos
Respecto a los costos de la técnica de bioaumentación, se consideran para gastos de inversión de
equipo y materiales de investigación un aproximado de $153,397.70 pesos mexicanos, para el
trabajo realizado de recursos humanos de investigación sería un presupuesto aproximado de
$472,833.01 dando un total aproximado de $626,230.71 pesos mexicanos.

Tipo de tratamiento
Proceso de biorremediación, biotransformación o biodegradación (fases o etapas).
El proceso elegido para llevar a cabo la biorremediación de suelos por hidrocarburos es la
biodegradación, la biodegradación consiste en la reducción de las sustancias químicas mediante
reacciones biológicas; es utilizada como parte de la biorremediación, que puede definirse como el
uso de microorganismos para llevar a cabo la transformación, degradación y eliminación de
contaminantes, siendo dependiente de las actividades enzimáticas de las bacterias. En el caso de
compuestos orgánicos, comúnmente la biodegradación, aunque no en todos los casos, tiende a la
transformación del compuesto original en dióxido de carbono (CO2) y productos inorgánicos que son
liberados por el microorganismo.

Para que el tratamiento sea más efectivo se realiza en dos etapas:


● Fase 1
Tratamiento del suelo mediante hidrolavado:
Al suelo y a los sedimentos se les trata con una solución acuosa de biodesengrasantes compuestos
principalmente por aceites de origen vegetal, que logran es bajar la tensión superficial y disminuir las
fuerzas de capilaridad dentro de las partículas de hidrocarburo y/o minerales de las superficies
rocosas, limosas y arcillosas, crear una microemulsión que sea estable y solubilizar las moléculas
individuales para que formen micelas o una simple fase de microemulsiones. El hidrocarburo
desprendido se recupera utilizando sustratos vegetales oleofílicos en forma de barreras, evitando así
que los productos del lavado fluyan por los cuerpos de agua. En el procedimiento de lavado del suelo
se separa la tierra fina de la tierra gruesa. Si la arena y grava presentan vestigios de contaminantes,

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se puede someter el material a otro ciclo de lavado, recogerlo para aplicarle un tratamiento diferente
o disponerlo en otro lugar.

• Fase 2
Cualquiera de las siguientes técnicas se podrá aplicar siempre y cuando se haya realizado una
primera fase de tratamiento, es decir el lavado de suelos, ya que con este primer tratamiento es
posible disminuir la concentración del contaminante en al menos un 60%.

Biorremediación in situ:
El tratamiento biológico de suelos contaminados involucra el uso de microorganismos y/o vegetales
para la degradación de los contaminantes orgánicos. La actividad biológica altera la estructura
molecular del contaminante y el grado de alteración determina si se ha producido biotransformación
o mineralización, se realizan las siguientes tareas:

a. Se Construye un canal de drenaje en el área de confinamiento del material contaminado a fin de


eliminar la mayor cantidad de agua posible del bajo existente; este canal de drenaje deberá
atravesar los pantanos.
b. Remover el suelo y sedimentos de los pantanos con la finalidad de recuperar el hidrocarburo libre,
facilitar la homogeneización del material y permitir la evaporación del exceso de agua presente.
c. Incorporar material de soporte: Este puede ser residuos vegetales que permitirán una fácil
aireación y oxigenación del medio en tratamiento.
d. Aplicación de fertilizantes: Se usarán fuentes de nitrógeno, fósforo y potasio necesarios para el
incremento y desarrollo de población microbiana con capacidad degradadora de petróleo.
e. Aplicación de fertilizantes orgánicos: Estos pueden ser gallinazas, estiércoles y otros que a más
de aportar con cepas microbiana con capacidad de degradación de petróleo, proporcionan fuentes
de nutrientes y oligoelementos necesarios para el desarrollo biológico en el suelo en tratamiento.
f. Aireación mecánica. A fin de incrementar la disponibilidad de oxígeno para el crecimiento
microbiano y para el proceso de evapotranspiración del agua existente.
g. Aplicación de caldos y medios de cultivo provistos de cepas endémicas de organismos
degradadores de petróleo, aisladas del sitio de remediación, clasificadas, potenciadas y
bioaumentadas. Esta técnica de Biorremediación in situ se puede aplicar siempre y cuando los
niveles de hidrocarburos no sean tan altos y no haya presencia de hidrocarburo intemperizado.

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Productos de valor agregado derivados del tratamiento
Los productos de valor agregado derivados del tratamiento son aquellos valores añadidos al conjunto
de características adicionales del producto o tratamiento para ser más atractivo al momento de
utilizar ese método, tal es el caso de Lysinibacillus Sphaericus, que después de degradar los
hidrocarburos puede permanecer en el suelo, en una especie de “hibernación”, donde puede durar
periodos de tiempo largos sin dañar al medio ambiente. Además de devorar el petróleo, la
Lysinibacillus Sphaericus produce toxinas mortales para las larvas de los mosquitos Anopheles,
Aedes y Culex, vectores de enfermedades tropicales como la malaria, el dengue, la chikunguña y la
fiebre amarilla, entre otras.

En el caso del microorganismo de Bacillus Thuringiensis tiene la habilidad de producir una amplia
variedad de proteínas insecticidas activas para distintos órdenes de insectos, con una gran
especificidad de acción, ya que afectan solamente a un número reducido de organismos. Produce
durante su fase de esporulación una o varias formas cristalinas, que contienen las proteínas “Cry”.
Desde el punto de vista del control de plagas, las principales toxinas insecticidas utilizadas son las
proteínas formadoras de poro “Cry” por su alta especificidad de acción.

Residuos
Para los residuos del tratamiento de biodegradación con técnica de bioaumentación en Lysinibacillus
Sphaericus después de la biorremediación se obtiene CO2 y H2O que se ha demostrado no ser
dañino en el medio ambiente. En el caso de la Bacillus Thuringiensis genera un residuo en donde se
transformó el petróleo en biomasa y dióxido de carbono. Una de las hipótesis más aceptadas
propone que los fenómenos de transferencia de contaminantes constituyen la etapa limitante del
bioproceso (Nocentini et al. 2000). En tales situaciones, la concentración residual del contaminante
depende mayormente de las partículas finas de los suelos y del intemperismo del contaminante.

Descripción de organismos utilizados (los más típicos o comunes):


Características físicas, químicas y biológicas
1. Lysinibacillus Sphaericus
Es una bacteria aeróbica, gram-positiva, con espora circular terminal, la cual está ampliamente
distribuida en el suelo y en ambientes acuáticos. Este bacilo mide de 1.5 a 5 micras de largo, con
bordes redondos; macroscópicamente puede observarse que forma colonias beta hemolíticas, color
blanco crema translúcido y bordes regulares (Realpe et. al 2002). Este microorganismo presenta un
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metabolismo aerobio, se desarrolla en amplios rangos de temperatura, su temperatura máxima ronda
entre los 30-45°C y su temperatura mínima de 5-15 °C, es catalasa positiva, no fermenta la glucosa,
no reduce nitratos y es fenilalanina positiva.

Figura 1. Imagen de microscopía electrónica de transmisión de una cepa de Lysinibacillus Sphaericus.

1. Bacillus Thuringiensis
Es un bacilo gram-positiva, de flagelación perítrica, que mide de 3 a 5 µm de largo por 1 a 1,2 µm de
ancho y que posee la característica de desarrollar esporas de resistencia elipsoidales que no
provocan el hinchamiento del perfil bacilar. Es un microorganismo anaerobio facultativo,
quimioorganótrofo y con actividad de catalasa. Los distintos aislamientos de B. thuringiensis
presentan en general características bioquímicas comunes. Poseen la capacidad de fermentar
glucosa, fructosa, trealosa, maltosa y ribosa, y de hidrolizar gelatina, almidón, glucógeno, esculina y
N-acetil-glucosamina. Sin embargo, la característica principal de B. thuringiensis es que durante el
proceso de esporulación produce una inclusión parasporal formada por uno o más cuerpos
cristalinos de naturaleza proteica que son tóxicos para distintos invertebrados, especialmente larvas
de insectos. Estas proteínas se llaman “Cry” y constituyen la base del insecticida biológico más
difundido a nivel mundial.

Figura 2. Imagen de microscopía electrónica de transmisión de una cepa de B. Thuringiensis.

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Afinidad o tolerancia al contaminante a tratar
En una reconstrucción metabólica reciente a escala genómica, se identificaron genes implicados en
la degradación de hidrocarburos en L. sphaericus, lo que sugiere nuevos rasgos para la
biodegradación de compuestos derivados del petróleo. Se ha demostrado en estudios que algunas
de las cepas pertenecientes a esta especie son capaces de degradar hidrocarburos de petróleo y
producir biosurfactantes. Sin embargo, falta una caracterización de la gama completa de
hidrocarburos que L. sphaericus puede utilizar como fuente de carbono para creciente, gracias a que
en la cubierta de esta se encuentra una proteína que le permite la acumulación y metabolización de
este contaminante. En palabras simples, la bacteria Lysinibacillus sphaericus se “come” el
hidrocarburo, tomando las grandes cadenas de carbonos y fraccionándolas en pequeñas partes,
para después metabolizarlas, obteniendo como producto final agua y dióxido de carbono (CO 2).

Por otro lado, de acuerdo con Tao et al. (2016) la biodegradación de hidrocarburos depende de la
supervivencia de los microorganismos después de la inoculación; Bacillus thuringiensis, que tiene un
alto índice de supervivencia, puede utilizar el crudo de petróleo como única fuente de carbono y
energía, y tiene una gran capacidad para adaptarse al entorno que vive en él mediante el uso de su
propio sistema enzimático especial.

Rutas metabólicas
En la selección de microorganismos con capacidades metabólicas para degradar productos
refinados como hidrocarburos, se involucran genes, complejos enzimáticos y vías metabólicas
relacionadas. Este proceso es conocido como “aclimatación cruzada” y ha sido registrado por Leahy
y Colwell (1990) y Álvarez y Vogel (1991). La capacidad de un microorganismo para asimilar
diferentes mezclas de hidrocarburos como fuentes de carbono depende de la especificidad de sus
enzimas. Algunas monooxigenasas, dioxigenasas y lipooxigenasas tienen el potencial para convertir
el petróleo y sus derivados en enantiómeros que puedan ser asimilados, ampliándose de esta forma
el ámbito de sustratos disponibles para el metabolismo.

La Lysinibacillus Sphaericus posee características más importantes que son aeróbicas estrictas, son
incapaces de reducir nitrato a nitrito, carecen de actividad desnitrificante y de distintas enzimas
extracelulares como amilasas, quitinasas, gelatinasas y lecitinasas en cuanto a sus características
metabólicas: son incapaces de utilizar glucosa (y hexosas en general), pentosas y disacáridos como
únicas fuentes de carbono y energía. Esta incapacidad estaría asociada a la ausencia de un sistema
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de transporte para las mismas. Además, no se han detectado las actividades de algunas enzimas de
las vias Embden-Meyerhof-Parnas (glucólisis) y Entner-Doudoroff tales como fosfoglucoisomerasa,
fosfofiuctoquinasa, glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, glucosa deshidrogenasa, fosfogluconato
dehidratasa, fosfo 2-ceto-3-deoxigluconato aldolasa, hexoquinasa y glucoquinasa. Sin embargo,
pueden utilizar gluconato, glicerol, distintos intermediarios del ciclo de Krebs, acetato, algunos
aminoácidos, adenina y ácidos grasos.

La Bacillus thuringiensis metaboliza los azúcares a través de la ruta de Embden-Meyerhof, para dar
ácidos, que luego son oxidados por las enzimas del ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Bacillus
thuringiensis no presenta actividad α-cetoglutarato deshidrogenasa, es decir que el ciclo de los
ácidos tricarboxílicos es incompleto, modificado por la presencia de la ruta del ácido y-aminobutírico.
La velocidad de catabolismo de los ácidos formados es menor si hay aminoácidos presentes en el
medio, pues estos pueden actuar como fuentes de carbono y de nitrógeno.

Resultados

Porcentajes de biodegradación Tiempo

Lysinibacillus Sphaericus 93 % 2 - 3 meses

Bacillus Thuringiensis 90.09 % 15 días

Tabla 2. Comparación entre Lysinibacillus Sphaericus y Bacillus Thuringiensis en porcentajes de


biodegradación y tiempos de respuesta.

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Figura 3. Resultados tras el proceso de biorremediación (L. Sphaericus) en campo abierto. Eficiencia de la degradación del TPH y
número de células viables. Los tratamientos en el suelo son IC: Recubierto con inóculo, IO: Abierto con inóculo, WC: Recubierto sin
inóculo, WO: Abierto sin inóculo.

Discusión de resultados
Para los datos de Bacillus Thuringiensis, se calculó un promedio de los resultados de los tres
tratamientos utilizados, en dónde la evaluación fue calculada por el método de DBO (mg/L),
calculando el promedio mediante una regla de tres, cabe destacar que el proceso para B.
Thuringiensis fue a nivel laboratorio, es por ello que los tiempos de degradación son menores.

Para Lysinibacillus Sphaericus se realizaron varios tratamientos para evaluar la biodegradación de


hidrocarburos de petróleo en el suelo. En donde se recogieron y analizaron las muestras recogidas
en el estudio a escala piloto. La figura 3 muestra los resultados de cada área de tratamiento. Como
se muestra en la gráfica, la eficiencia de la degradación y el recuento de células viables fueron
mayores en el suelo abierto inoculado (IO) que en el control. Esto podría deberse a que el
tratamiento abierto en campo los microorganismos tienen más aireación, lo que mejora la tasa de
biodegradación. La menor eficiencia de degradación de hidrocarburos totales del petróleo se dio en
el tratamiento sin inóculo de suelo (WC). Los resultados mostraron una mayor eficiencia en los
tratamientos con el consorcio seleccionado (IO: abierto con inóculo) que, en los tratamientos sin el
consorcio seleccionado, indicando el consorcio propuesto como una buena solución para
biorremediación de suelos contaminados.

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Conclusión
Basándonos en los resultados, el microorganismo con mayor eficiencia en reducción de suelos
contaminados por hidrocarburos es Lysinibacillus Sphaericus con un tiempo aproximado de 2 a 3
meses a escala piloto y una eficiencia de degradación de hasta el 93%. La bacteria degrada los
hidrocarburos del petróleo incluso en presencia de metales pesados dentro de suelo, así como del
agua, para posteriormente convertirlos en dióxido de carbono o en más bacterias, y esas bacterias
son fuente de alimento para otros organismos. Además, que sus residuos se quedan ahí por un
periodo largo de tiempo, sin llegar a dañar el medio ambiente.
Se propone el Lysinibacillus sphaericus para el futuro tratamiento de suelos contaminados por
petróleo debido a su capacidad de utilizar los hidrocarburos del petróleo como única fuente de
energía; su capacidad de producir biosurfactantes y su capacidad de persistir en el medio ambiente
debido a que es un microorganismo esporulado.

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