UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA

ESCUELA DE POSTGRADO
CIENCIAS AMBIENTALES

BIODEGRADACION IN SITU

CONTAMINAION Y TRATAMIENTO DE SUELOS Y

AGUAS SUBTERRANEAS

PROFESOR:

Ing. RENATO UMERES CACERES, M.S.c.

Piura - Per

2009
I. INTRODUCCION

El manejo inadecuado de los materiales y residuos peligrosos ha generado a escala

mundial, un problema de contaminacin de suelos, aire y agua. Entre las ms
severas contaminaciones se destacan las que se produjeron y todava se producen
a causa de la extraccin y el manejo del petrleo en todos los pases productores
de hidrocarburos y en el uso indiscriminado de pesticidas en la actividad agrcola,
procesos de alimentos, y en todo proceso que busca la eliminacin de plagas.

Problemas causados por el derrame de petrleo

En el suelo los hidrocarburos impiden el intercambio gaseoso con la atmsfera,

iniciando una serie de procesos fsico-qumicos simultneos como evaporacin y
penetracin, que dependiendo del tipo de hidrocarburo, temperatura, humedad,
textura del suelo y cantidad vertida puede ser mas o menos lentos, ocasionando
una mayor toxicidad, adems de tener una moderada, alta o extrema salinidad,
dificultando su tratamiento. Altos gradientes de salinidad pueden destruir la
estructura terciaria de las protenas, desnaturalizar enzimas y deshidratar clulas,
lo cual es letal para muchos microorganismos usados para el tratamiento de aguas
y suelos contaminados.

En el agua, al llegar a la mancha generada por los hidrocarburos vertidos, flota por
diferencia de densidades impidiendo la entrada de luz y el intercambio gaseoso,
dando comienzo a la solubilizacin de compuestos hidrosolubles y a la afeccin de
diferentes poblaciones: la primera poblacin afectada por un derrame es el
plancton, en segundo lugar son afectados los macroinvertebrados, y la ltima
poblacin afectada son los bentos o poblacin de macroinvertebrados que viven en
los fondos de los ros y cinagas. Diferentes estudios han determinado el efecto de
la contaminacin con hidrocarburos en la germinacin y crecimiento vegetativo de
diferentes especies de pastos sometidos a diferentes concentraciones de
hidrocarburo, concluyendo que hay una inhibicin en la germinacin del trbol
comn y un marcado retras en el crecimiento de todas las plantas evaluadas.

As mismo, otros estudios evaluaron el efecto de los hidrocarburos poliaromticos

(PHA) en ecosistemas forestales y plantas madereras, demostrando un efecto de
necrosis foliar y reportando que aproximadamente 3200 hectreas son afectadas
por los derrames y el 90% de estos son pantanos o zonas inundables aledaas a
plantas con tuberas corrodas por tener mas de 50 aos de antigedad, al igual
que se emplean pozos sin crudo para almacenamiento de los cules un 30% estn
contaminados con desechos aceitosos.

Sin embargo, lo que complica la problemtica actual de los sitios contaminados con
hidrocarburos, es que hasta hace pocos aos, prcticamente no exista una
conciencia del grado de dificultad y del enorme costo de la remediacin de suelos,
cuerpos de agua y atmsfera contaminados, lo que representa hoy para la sociedad
un gran costo econmico. Dicha contaminacin esta ocasionando el deterioro
progresivo de la calidad del medio ambiente y genera una amenaza real a la salud
publica, as como la extincin de gran cantidad de especies vegetales y animales.

La contaminacin por pesticidas

Los pesticidas cumplen un efecto poco selectivo porque el efecto generalmente es

atacar a cualquier ser vivo, y estos txicos no son buenos en biodegradarse,
dejando en el suelo remanentes y/o residuales, que son aun mas txicos que el
mismo insumo en su propiedad de veneno. Residuales como metales, metales
 pesado y compuestos de alta complejidad que son bioacumulables en cualquier ser
biolgico generando enfermedades a largo plazo. Por eso ahora se buscan
pesticidas que cumplan una funcin mas especifica, con respecto al ser vivo a
atacar y que sus remanentes sean amables con el medio, degradndose.

Los solventes, es otro caso de contaminacin, que pertenece a los compuestos

orgnicos.

En la presente revisin se analiza la biorremediacin in situ como una alternativa

saludable frente al deterioro progresivo de la calidad del medio ambiente por el
derramamiento de crudos, ya que esta problemtica genera una amenaza real a la
salud publica, as como la extincin de gran cantidad de especies vegetales y
animales.

II. OBJETIVO GENERAL

Utilizacin de actividad propia de algunos animales, microorganismos y/o plantas

para degradar compuestos orgnicos. Esta tecnologa esta basada en el uso de
organismos naturales o mejorados genticamente para recuperar sitios
contaminados y proteger el ambiente (Miller y Poindexter, 1994).

III. DEFINICION Y CARACTERISTICAS GENERALES

Las prcticas de biorremediacin consisten principalmente en el uso de diferentes

organismos naturales (plantas, levaduras, hongos, bacterias) del medio para
neutralizar (descomponer o degradar) sustancias toxicas, bien transformndolas en
sustancias de carcter menos txico o bien convirtindolas en inocuas para el
medio ambiente y la salud humana. La biorremediacin es una tcnica innovadora
que se a desarrollado en las dcadas de los 80 y 90, se viene aplicando con mucho
xito en la descontaminacin de suelos y aguas, pero una de las medidas
biocorrectoras ms empleada es la utilizacin de microorganismos para la
descontaminacin de hidrocarburos y pesticidas.

La Biorremediacin es considerada como la va ms efectiva para la remediacin de

suelos contaminados, en contraste a alternativas ms costosas como la
incineracin. Los tratamientos biolgicos de degradacin en suelos pueden ser
eficientes y econmicos si las condiciones de biodegradacin son optimizadas.
Entonces biorremediacin, se refiere, al proceso de aceleracin de la tasa de
degradacin natural de compuestos orgnicos por adicin de fertilizantes para
provisin de nitrgeno y fsforo. El proceso de degradacin requiere control de
variables operacionales tales como as como unas condiciones adecuadas de pH,
nutrientes, temperatura, humedad, textura, estructura del suelo, concentracin de
los contaminantes, nutrientes y oxgeno.

Estas tcnicas biolgicas pueden ser de tipo aerobio, si se producen en condiciones

aerobias (presencia de un medio oxidante), o bien de tipo anaerobio, en
condiciones anaerobias (medio reductor).

Estos sistemas de descontaminacin se basan en la digestin de las sustancias

orgnicas por los microorganismos, de la cual obtienen la fuente de carbono
necesaria para el crecimiento de sus clulas y una fuente de energa para llevar a
cabo todas las funciones metablicas que necesitan sus clulas para su crecimiento.
Para que estos procesos metablicos se lleven a cabo, y puedan ser utilizados como
una tcnica remediativa.
 Cada uno de estos sistemas, bioventing, Biosparging y atenuacin natural,
precisarn de unos parmetros de evaluacin adecuados a cada uno, que deben
encontrarse dentro de un intervalo ptimo para que la aplicacin de dicha tcnica
sea factible y efectiva. En general, se necesitar la existencia de determinadas
poblaciones de microorganismos autctonos capaces de utilizar los hidrocarburos,
pesticidas o un solvente de origen orgnico, como fuente nutricional y de energa. A
su vez, ser necesario un determinado nmero de aceptores de electrones que
enzimticamente oxide los carbonos procedentes de dichas sustancias.

En el presente informe se definir la tcnica in-situ, que se define cuando en el

lugar donde se encuentra el suelo contaminado, se aplica la tcnica.

IV. FUNDAMENTO BIOQUIMICO DE LA DEGRADACION

El fundamento bioqumico de la biorremediacin se basa en que en la cadena

respiratoria, o transportadora de electrones de las clulas, se van a producir una
serie de reacciones de xido-reduccin cuyo fin es la obtencin de energa. La
cadena la inicia un sustrato orgnico (compuestos hidrocarburados) que es externo
a la clula y que acta como dador de electrones, de modo que la actividad
metablica de la clula acaba degradando y consumiendo dicha sustancia.

Los aceptores ms comnmente utilizados por los microorganismos son el oxgeno,

los nitratos, el hierro (III), los sulfatos y el dixido de carbono. Cuando el oxgeno
es utilizado como aceptor de electrones la respiracin microbiana se produce en
condiciones aerobias, y los procesos de biodegradacin sern de tipo aerobio; sin
embargo, si utiliza los sulfatos o el dixido de carbono se produce en condiciones
reductoras o anaerobias, y los procesos de biodegradacin sern de tipo anaerobio.

Esquema de las reacciones

La concentracin y composicin de la comunidad microbiana y la tasa de

transformacin de contaminantes est influenciada por diversos factores:

Necesidad de nutrientes: El metabolismo microbiano est orientado a la

reproduccin de los organismos y stos requieren que los constituyentes
qumicos se encuentren disponibles para su asimilacin y sinterizacin. Los
nutrientes principalmente requeridos son el fsforo y el nitrgeno. Por lo
general suele haber en el suelo una concentracin de nutrientes suficiente,
sin embargo, si estos no se encontrasen en el rango normal se puede
adicionar mayor cantidad al medio. El rango normal de C:N:P depende del
sistema de tratamiento a emplear, siendo de modo habitual 100:10:1.

pH del suelo: afecta significativamente en la actividad microbiana. El

crecimiento de la mayor parte de los microorganismos es mximo dentro de
 un intervalo de pH situado entre 6 y 8. As mismo el pH tambin afecta
directamente en la solubilidad del fsforo y en el transporte de metales
pesados en el suelo. La acidificacin o la reduccin del pH en el suelo se
puede realizar adicionando azufre o compuestos del azufre.

Temperatura: generalmente las especies bacterianas crecen a intervalos de

temperatura bastante reducidos, entre 15 y 40 C (condiciones mesfilas),
decreciendo la biodegradacin por desnaturalizacin de las enzimas a
temperaturas superiores a 45 C e inhibindose a inferiores a 0 C.

Humedad: los microorganismos requieren unas condiciones mnimas de

humedad para su crecimiento. El agua forma parte del protoplasma
bacteriano y sirve como medio de transporte a travs del cual los
compuestos orgnicos y nutrientes son movilizados hasta el interior de las
clulas. Un exceso de humedad inhibir el crecimiento bacteriano al reducir
la concentracin de oxgeno en el suelo. El rango vara en funcin de la
tcnica.

Estructura qumica del hidrocarburo: la inherente biodegradabilidad de un

hidrocarburo depende, en gran medida, de su estructura molecular. Siendo
los parmetros que ms van a afectar la halogenacin, la existencia de
ramificaciones, la baja solubilidad en el agua y la diferente carga atmica.

V. TIPOS DE BIORREMEDIACION

Marivela et al. (2002) sealan que el proceso de biorremediacin puede

clasificarse de acuerdo al organismo que efecte la degradacin del compuesto
xenobitico (compuestos cuya estructura qumica en la naturaleza no existe,
debido a que son sintetizados por el hombre) en los siguientes tipos:
a. Fitorremediacin: consiste en el uso de plantas verdes para contener,
remover o neutralizar compuestos orgnicos, metales pesados o
radionucleidos Sin embargo, no se conoce sobre la habilidad de esta en el
tratamiento de suelos con contaminantes orgnicos persistentes. Un ejemplo
de la fitorremediacin la constituye el uso de la especie Thlaspi caurulencens
en suelos contaminados con zinc y cadmio encontraron que el uso de esta
especie lograba eliminar ms de 8 mg/Kg de cadmio y 200 mg/Kg de zinc,
representado estos valores el 43 y 7 por ciento de estos metales en un suelo
agrcola, respectivamente.

b. Biorremediacin animal: existen animales que actan como agentes

descontaminantes, ya que pueden desarrollarse en medios con fuerte
toxicidad y poseen en su interior microorganismos capaces de retener los
metales pesados (Atlas, 1995; en Gibson y Sailer, 1996) tal es caso de la
lombriz de tierra (lumbricus terrestris) la cul absorbe los contaminantes a
travs de los tejidos y los acumula en las vas digestivas

c. Biorremediacin microbiana. Existe la posibilidad del uso de bacterias con la

propiedad de acumular o metabolizar metales pesados. La utilizacin de
microorganismos que transforman diferentes compuestos nocivos en otros
de menor impacto ambiental ha experimentado un gran desarrollo reciente.
Aunque las bacterias son las ms empleadas en el proceso de
biorremediacin, tambin se han empleado otros microorganismos como
hongos, algas, cianobacterias y actinomicetes para la degradacin de
compuestos txicos en el suelo.
VI. BIODEGRADACION DE COMPUESTOS TOXICOS POR
MICROOGANISMOS

Degradacin de plaguicidas

Galli (2002) seala que los compuestos txicos ms usados son los plaguicidas, los
cuales en muchos casos resultan ser muy txicos. Estos compuestos qumicos
constituyen una adecuada fuente de carbono y donadores de electrones para
ciertos microorganismos del suelo. En la literatura existen algunos ejemplos de
degradacin de plaguicidas por microorganismos, entre los cuales se pueden citar
los siguientes.

Segn Golovleva et al. (1990), las Pseudomonas sp. son las bacterias ms
eficientes en la degradacin de compuestos txicos. La capacidad de estas bacterias
para degradar estos compuestos depende del tiempo de contacto con el compuesto,
las condiciones ambientales en las que se desarrollen y su versatilidad fisiolgica.
Vsquez y Reyes (2002) evaluaron tres especies de Pseudomonas sp. para la
biodegradacin del herbicida Aroclor 1242. Los resultados obtenidos demuestran la
gran capacidad de las bacterias para degradarlo, siendo el porcentaje de
degradacin de 99.8%, 89.4% y 98.4% respectivamente.

Ouahiba et al. (2001) aislaron varias especies de hongos en suelos contaminados

con pesticidas de Argelia. Las especies ms frecuentes fueron Aspergillus
fumigatus, A. Nger, A. terreus, Absidia corymberifera y Rhizopus microsporus
varmicrosporis. En este experimento, 53 especies aisladas destacaron por su
habilidad para la degradacin del herbicida metribuzin en medio lquido. Se
demostr a su vez que el herbicida promova el crecimiento de los gneros Absidia
y Fusarium, los cuales lograron eliminar el 50% del compuesto despus de 5 das.
Por otra parte, la especie Botrytis cinerea elimin el herbicida linuron casi
completamente, y 31 especies pudieron eliminar el metroburon, destacando
Botrytis cinerea que lo elimin casi en su totalidad.

Otro experimento mostr la eficiencia de la bacteria Rhodococuss sp. para degradar

las triazinas a nitrato. Fournier et al. (2002) realizaron un ensayo para estudiar las
transformaciones del herbicida atrazina como consecuencia de la descomposicin
microbiana. Este compuesto logr ser transformado en nitrito (30%), xido nitroso
(3,2%), amonio (10%) y formaldehido (27%).

Degradacin de hidrocarburos

Otro grupo de compuestos txicos muy abundante son los hidrocarburos. Halden et
al. (1999) demostraron la eficiencia de bacterias del gnero Pseudomonas sp. en la
degradacin del cido 3-Phenoxybenzoico en suelos. Este experimento sirvi
tambin para evaluar el papel biodegradativo de dos Pseudomonas que haban sido
manipuladas genticamente. Las bacterias resultaron ser efectivas en todos los
casos; sin embargo, las bacterias modificadas genticamente tuvieron una mayor
capacidad para sobrevivir a factores ambientales adversos. Este resultado es
alentador, dado que uno de los factores que muchas veces impide la
biorremediacin de suelos in situ son las condiciones ambientales desfavorables
para el crecimiento bacteriano.

Otra especie de bacteria que ha sido usada para la degradacin de hidrocarburos es

Sphingomonas wittichii RW1, la cual en condiciones anaerbicas es capaz de
 transformar el 2,7 diclorobenzeno, produciendo el metabolito 4 clorocatenol y el
1,2,3,4 tetraclorodibenzeno ( Hong et al. 2002).

Los hongos tambin han sido evaluados para la degradacin de hidrocarburos.

Boldu et al. (2002) estudiaron el papel del hongo Cladophialophora sp. sobre la
degradacin de benceno, tolueno, etilbenzeno y xileno. El hongo no fue capaz de
degradar el benceno, pero degrad los compuestos alcalinizados (tolueno,
etilbenzeno y xileno). El mecanismo de degradacin fue una combinacin de
asimilacin y cometabolismo. El tolueno y el etilbenzeno fueron usados como fuente
de carbono y energa. En el proceso degradativo acta la enzima monooxigenasa la
cual se encarg de la degradacin del tolueno, etilbenzeno y el xileno.

Otros microorganismos, menos estudiados pero que tambin contribuyen a la

degradacin de agentes contaminantes en el suelo, son las cianobacterias. Abed et
al. (2002) estudiaron el papel de las especies Phormidium y Oscillatoria sobre la
degradacin de hidrocarburos. Los resultados sealan que en 7 das se haba
degrado el n-octadecano y el ristano en un 25 y 34%, respectivamente. Estos
valores demuestran el potencial de estas cianobacterias para el desarrollo de
futuras tcnicas de biodegradacin en suelos contaminados con hidrocarburos.

Las algas tambin juegan un papel importante en los procesos de biodegradacin.

Lai et al. (2002) estudiaron el proceso de biotransformacin del esteroide estrgeno
por accin de Chlorella vulgaris. Con luz esta especie metaboliz el 50% del
estradiol, transformndolo a un compuesto desconocido, aunque otros estrgenos
como el estriol hidroxiestrona y el etinil estradiol se mantuvieron estables en el
cultivo del alga.

VII. METODOS BIOLOGICOS DE DEGRADACION IN SITU

La biorremediacin del suelo, puede ser dividida en estrategias in situ y ex situ. Se

llama in situ, cuando se aplica una tcnica, en el lugar donde se encuentra el suelo
contaminado, o ex-situ, cuando el suelo se traslada a una instalacin para su
tratamiento. El tratamiento ex-situ de suelos, sedimentos y otros slidos
contaminados con hidrocarburos se puede realizar en un variado nmero de
procesos en fase slida y en fase lodo. Los procesos en fase slida son aquellos en
donde el suelo se trata con un contenido de agua mnima. En los casos de los
procesos en fase lodo se suspende el suelo en agua (Saracino, 2001). El material a
tratar y se le maneja en un sistema controlado como una celda de landfarming o
algn tipo de biorreactor.

Las tcnicas de biorremediacin in situ presentan una mayor ventaja sobre las ex
situ por el menor costo y la disminucin de la generacin de residuos a eliminar en
la superficie. La biorremediacin in situ es la ms aplicada y utiliza
microorganismos autctonos, estos en el suelo pueden degradar un gran nmero
de constituyentes de lodo pero su eficacia y su poblacin son afectadas cuando
algunos contaminantes txicos estn presentes en altas concentraciones. La
reintroduccin de microorganismos aislados de un sitio contaminado ayuda a
resolver este problema ya que los microorganismos pueden degradar los
constituyentes y tiene una gran tolerancia a la toxicidad.
VII.1. BIOVENTING O INYECCIN DE AIRE

En este caso se realiza una aireacin forzada mediante el enriquecimiento de

nutrientes y la inyeccin de aire en la zona no saturada del suelo o el agua
subterrnea a travs de pozos de inyeccin. La mineralizacin de los HC
(hidrocarburo) depende del enriquecimiento con minerales que estimulan la
actividad oxidativa de la microbiota (microorganismos) nativa de cada sitio,
requiere de un aumento en la disponibilidad de oxigeno, as como la
volatilizacin de los HC. Una alta concentracin de arcilla y la solubilidad de
los HC son factores que limitan su utilizacin, pero no en aguas superficiales ni
subterrneas

Debido a la aireacin del suelo se va a favorecer la degradacin de los

hidrocarburos por dos motivos: por volatilizacin, facilitando la migracin de la
fase voltil de los contaminantes, y por biodegradacin, ya que al incrementar
la oxigenacin del suelo se van a estimular la actividad bacteriana.

Los factores a tener en cuenta en la aplicacin del bioventing o inyeccin de

aire natural son:

Se degradarn ms fcilmente las molculas ms pequeas (hasta C 20),

siendo ms fcilmente biodegradables los compuestos parafinados o de
cadena lineal que los compuestos aromticos. En general, son favorables
los compuestos de alta volatilidad (presin de vapor mayor de 10 mm de
Hg a 20C).
Los suelos deben contener bajos contenidos en arcilla y ser lo ms
homogneamente posible, con un valor de permeabilidad al aire adecuado
(> 10-10 cm2).
El principal problema es la biodisponibilidad de los microorganismos. Cuanto
menor es la solubilidad de los contaminantes menor ser la
biodisponibilidad.
Los aportes de oxgeno deben ser suficientes, as como la existencia de
fuentes de carbono, aceptores de electrones y energa suficientes.
No debe existir de producto libre en flotacin sobre el nivel fretico.
Deben existir unas condiciones ptimas de pH (6 y 8), de humedad (12-30%
en peso), potencial redox mayor de -50 mV, temperatura entre 0 y 40 C
y los nutrientes del suelo en relacin N:P de 10:1.
Necesidad de tiempos de actuacin cortos (meses) y coste medio-alto.

VII.2. BIOSPARGING

El biosparging es definido por Wilson (2000), como un mtodo que combina el

efecto de la ventilacin con la utilizacin de microorganismos autctonos para
degradar compuestos orgnicos absorbidos por el suelo en la zona saturada.
En el biosparging el aire y los nutrientes se inyectan en la zona saturada para
mejorar la actividad de los microorganismos presentes. sta tcnica se utiliza
para la limpieza de los compuestos orgnicos en suelos y agua subterrnea.
Se ha demostrado la eficiencia del biosparging para la degradacin de
herbicidas como la atrazina (Crawford et al. 2000).

Los factores a tener en cuenta en la aplicacin del biosparging son idnticos al

bioventing o inyeccin de aire natural. Debido a que se aplica aire, cargado
con microorganismos, esta caracterstica marca la diferencia.
VII.3. ATENUACION NATURAL

La atenuacin natural, aunque no est considerada como una tcnica de

descontaminacin propiamente dicha, est englobada dentro de las tcnicas
de remediacin in situ de muy bajo coste. Su caracterstica principal es la
utilizacin de los procesos fisico-quimicos de interaccin contaminante-suelo y
los procesos de biodegradacin que tienen lugar de forma natural en el medio.
Estos procesos se conocen como procesos de biotransformacin natural.

Los procesos de biotransformacin natural son aquellos que van a reducir la

concentracin de los contaminantes y entre los que se encuentran la dilucin,
dispersin, volatilizacin, adsorcin, biodegradacin y aquellas reacciones
qumicas que se producen en el suelo o en el agua y que contribuyen de
alguna forma a la disminucin de la contaminacin.

Esta tcnica se aplica en aquellos casos en los que exista contaminacin tanto
en suelos como aguas subterrneas producida por hidrocarburos de tipo
halogenado o no halogenado.

Entre los factores que influyen en la eficacia y viabilidad de la atenuacin

natural destacan:

La exigencia de proteccin y el riesgo de los potenciales receptores durante

el tiempo que dura la atenuacin.
La existencia de unas condiciones geolgicas y geoqumicas favorables.
 Las necesidades de reduccin de la masa contaminante en un intervalo
razonable de tiempo (meses a aos), tanto en la superficie del suelo como
en la zona ms subsuperficial del mismo, as como de la calidad de las
aguas subterrneas.
Confirmacin de la existencia de los tipos y nmero de poblaciones de
microorganismos que puedan biodegradar los contaminantes.
Produccin y conservacin en el medio de subproductos de caracteres
persistentes o ms txicos que los iniciales, durante y despus de la
atenuacin natural.
No existencia de producto libre en flotacin sobre el nivel fretico
Para condiciones aerobias la condicin ambiental ptima de concentracin de
oxgeno disuelto en el agua debe ser superior a 0,5 mg/l.
La concentracin de los compuestos utilizados como aceptores de electrones
en condiciones anaerobias debe ser superior a 0,21 mg/l para nitratos, la
de Fe3+ para que pueda ser reducido a Fe2+ debe ser superior a 21,8
mg/l y la de sulfatos mayor de 0,21 mg/l.
El potencial redox debe estar situado entre un rango de -400 y 800 mV.
Existencia de un coeficiente de retardo favorable para que se produzcan los
fenmenos de sorcin con suficiente eficacia.
Que se produzca una dilucin suficiente para que la concentracin se vea
disminuida aguas abajo del foco contaminante.
La dispersin de los contaminantes aguas abajo del foco y en la direccin de
flujo debe ser adecuada para que exista una mayor disponibilidad
proporcin entre los contaminantes y los aceptores de electrones.

VIII. MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE PETROLEO

En Long Beach (California), aplicaron la biorremediacin in situ en suelos

contaminado con aceite diesel mediante el uso de microorganismos autctonos
complementada con la adicin de nutrientes y oxigeno en el suelo bioestimulacin
Cunningham et al 2000, e inoculacin de una mezcla enriquecida de consorcios
bacterianos previamente extrada del mismo suelo bioaumentacin. Esto permiti
encontrar consorcios bacterianos degradadores de hidrocarburos identificados por
secuenciacin de genes 16S-RNA, demostrando la presencia de Bacillus cereus,
Bacillus sphaericus, Bacillus fusiformis, Bacillus pumilis, Acinetobacter junii, y
Pseudomonas sp (Tllez et al., 2000). El estudio hecho sobre la adaptacin y
seleccin de microorganismos autctonos en medios de cultivo enriquecidos con
petrleo crudo realizado por Maria del Carmen Rivera-Cruz 2002 indic que los
microorganismos con crecimiento abundante aislados de suelos receptores de
derrames recientes y crnicos de petrleo crudo y otros no contaminados, son
considerados degradadores de petrleo (Rivera et al., 2000).

Los microorganismos aislados en suelos poseen actividades de peroxidasas y

oxigenasas, que permiten la oxidacin de algunas fracciones del petrleo (Heichen
et al., 2000). Esta oxidacin cambia las propiedades de los compuestos hacindolos
susceptibles a ataques secundarios y facilitando su conversin a bioxido de carbono
y agua (Hamme et al., 2000).

Uno de los gneros bacterianos ms explotados en bioprocesos no convencionales

es Rhodococcus sp., un grupo nico consistente en microorganismos que presentan
una gran diversidad metablica, capaz de transformar, biodegradar y utilizar como
nica fuente de carbono compuestos hidrfobos (Flavio et al., 1999).

Los Rhodococcus sp. son aerbicos, Gram. positivos, inmviles, Nocardiformes,

Actinomicetos, que en algunas ocasiones presentan pequeas proyecciones
filamentosas. Las caractersticas bioqumicas encontradas en algunas cepas son la
produccin de poli-3-hidroxialcanoatos, acumulacin de metales pesados y enzimas
tiles como la fenilalanina, deshidrogenasa y endoglucosidasas.

El Rhodococcus sp. poseen una gran variedad de vas metablicas para la

degradacin y modificacin de compuestos aromticos, incluyendo las actividades
de di-oxigenasa y mono-oxigenasa sobre anillos, as como la actividad de ruptura
de catecol. Algunas cepas presentan tambin la va del 3-oxoadipato. Lo anterior
sumado a su capacidad de crecimiento en medios conescasos nutrientes, la
carencia de un sistema de represin catablica y su persistencia ambiental las
hacen excelentes candidatas para los tratamientos de biorremediacin (Flavio et al.,
1999).

El Rhodococcus sp. utiliza el dibenzotiofeno (DBT) como nica fuente de azufre, el

DBT y sus derivados son los rganoazufrados ms abundantes en el diesel primario.

En Mxico, investigadores del Instituto Mexicano del Petrleo han aislado cepas de
Rhodococcus sp. En sitios contaminados con petrleo capaces de desulfurar
muestras de diesel. Otros microorganismos reportados como capaces de utilizar el
DBT como fuente de azufre son las cepas de Gordona y Nocardia sp. Dentro de las
aplicaciones industriales y ambientales, se incluye la produccin de cido acrlico y
acrilamida, conversin de esteroides, biorremediacin de hidrocarburos clorados y
fenoles, a lo que se aade su gran capacidad de degradar hidrocarburos alifticos
halogenados y numerosos compuestos aromticos, como los PHAs (hidrocarburos
policiclicos aromticos) (Microbiol, 2003), evidencindose que tanto R. rhodochorus
como R. erythropolis demostraron ser una excepcin, pues la degradacin de
naftaleno por parte de estos no es significativa, debido a que la actividad
degradadora de PAHs por parte de estos microorganismos, se ve regulada por las
proteobacterias del medio afectado (Nicholson et al., 2004).

Nuevas especies de Rhodococcus sp. que presentan una nueva mutacin tienen la
capacidad de degradar compuestos alifticos con enlaces dobles principalmente en
el noveno carbono del grupo metilo Terminal (alquenos). Las bacterias del gnero
Pseudomonas sp. poseen la habilidad para utilizar diversos substratos, incluyendo
aquellos creados por el petrleo. Las Pseudomonas sp. son bacterias Gram
negativas, obicuas, que pertenecen a la subclase gamma de las Proteobacterias.

Las Pseudomonas sp. son bacterias productoras de biosurfactantes como los

ramnolipidos involucrados en procesos de remocin de aceites y productos
relacionados, Bushnell y Hass fueron de los primeros en describir bacterias
productoras de biosurfactantes, como el Corynebacterium simplex y cepas de
Pseudomonas sp. (Nelson et al., 2002).

Algunos microorganismos productores de biosurfactantes extracelulares que

solubilizan y facilitan la penetracin de los hidrocarburos a travs de la pared
celular hidroflica; contienen adems enzimas degradadoras de hidrocarburos en la
membrana citoplasmtica. La Pseudomonas aeruginosa, es otro de los
microorganismos ms usado y estudiado en biorremediacin y presenta una serie
de actividades naturales sobre xenobiticos. Lamentablemente, tambin es
conocida por ser un patgeno oportunista en humanos y causante de
complicaciones graves en personas inmunosuprimidas, con quemaduras severas o
con fibrosis qustica. Por estas razones existe mucho inters en el estudio de las
relaciones filogenticas entre serotipos clnicos y ambientales (Rockne et al., 2000).

Estudios con relacin al desempeo metablico de la Pseudomonas aeruginosa ha

permitido identificarla como degradadota de gran cantidad de sustratos como el n-
hexadecano, mineralizacin de compuestos alifticos en condiciones anaerobias, y
degradadora de hidrocarburos aromticos y poli aromticos, as como del pireno en
estudios in vitro (Gesche et al., 1998).

La P. aeruginosa tiene la capacidad de sintetizar ramnolipidos cuando se encuentra

en la fase estacionaria de su crecimiento, por tal razn esto slo se puede realizar
en la primera fase del proceso de biorremediacin y contribuyendo as con la
movilizacin y solubilizacin de los contaminantes durante la fase siguiente de
mineralizacin. Al mismo tiempo que pueden transformarse bajo microcosmos en el
suelo con un tratamiento fsico o qumico especifico, caracterstica que comparte
con el Agrobacterium tumefasciens.

La Pseudomona putida es un saprofito del suelo, oportunista, cosmopolita,

metablicamente verstil, por poseer una dioxigenasa inicial, una tolueno
dioxigenasa, aunque no presenta la dioxigenasa especfica para los PAHs por lo cul
es una buena candidata para las aplicaciones biotecnolgicas, tales como
agricultura, biocatlisis, biorremediacin, biocontrol en proteccin de las plantas y
produccin de bioplsticos (Daane et al., 2001).

La P. putida posee la capacidad de colonizar larizosfera de plantas de cosecha y una

gran capacidad metablica que facilita el desarrollo de biopesticidas y promotores
de crecimiento de la planta. La degradacin de los alcanos por Pseudomona putida
se ha estudiado por secuenciacin en el plasmido OCT que codifica una enzima
dioxigenasa que convierte alcanosa aldehdos a travs del hidroperoxidasa del n-
alkyl sin un intermediario del alcohol, conocido como la va de Finnerty; un proceso
similar lo presentan los gneros Acinetobacter sp y Nocardiodes sp. aunque ellos no
poseen este plasmido.

La Pseudomonas fluorescens es degradadora de naftaleno y fenantreno, ventaja

que tiene frente a las otras Pseudomonas, que solo metabolizan naftaleno y
asfaltenos (36).

Estudios realizados demuestran que Flavobacterium sp. y Pseudomonas sp. son los
microorganismos ms aislados en la fase de degradacin de los TPH (Hidrocarburos
Totales). La Pseudomonas stutzeri es una degradadota de PHA.s (Kstner et al.,
1998).

Burkholderia sp. es otro gnero bacteriano utilizado para biorremediacin de

herbicidas y pesticidas recalcitrantes y tambin es usado para proteger cultivos
contra hongos. Debido a su genoma extremadamente flexible, Burkholderia
cepacia, bacilo Gram negativo no fermentador, productora de pigmento amarillo
tiene una gran capacidad mutagenica y adaptativa, ha sido recuperada a partir de
agua y superficies hmedas, es resistente a mltiples antibiticos y sta capacidad
es altamente transmisible entre especies. Por todas estas razones, la seleccin de
cepas .seguras. para su uso ambiental no es posible por el momento y su uso en la
agricultura tambin debe ser cauteloso. Aunque es una excelente degradadora de
los hidrocarburos aromticos (34,40) El Acinetobacter sp es un bacilo Gram
negativo, es productor de cido a partir de la glucosa, se desarrolla a 41 y 44C,
produce a-xilosa y utiliza el malato. Dentro de las especies de importancia
ambiental se destacan, A. baumanii, Acinetobacter calcoaceticus carente de cido
metlico. Las cepas de Acinetobacter baumanii son eficientes en la degradacin de
fracciones de alcanos (Svenja et al., 1999).

Los productos de petrleo ampliamente usados como gasolina, keroseno y Diesel

son contaminantes comunes del ambiente, se ha observado que la biodegradacin
de gasolina por microflora de suelo y agua de sitios contaminados es eficiente;
compuestos como el benceno, tolueno, etilbenceno, y n-alcanos son realmente
biodegradables. Se aisl una cepa con una alta capacidad de degradar dichos
compuestos identificada como Mycobacterium austroafricanum (Floriane et al.,
1999).

Se selecciono una cepa en un acufero contaminado con gasolina, la cul tiene la

capacidad de utilizar el isoctano (2,2,4-trimetilpentano) como nica fuente de
carbono y energa. El microorganismo aislado fue identificado por medio de la
secuenciacin del 16S ribosomal. Se identific una cepa perteneciente a
Mycobacterium austroafricanum; y otra cepa como Mycobacterium sp. Esta de
manera inusual utilizo como fuente de carbono y sustrato de crecimiento n-alcanos
y multimetil, donde degrado el metil t-butil eter, y grupos 3-metil, posiblemente
por mecanismos de carboxilacin y deacetilacin; logrando finalmente la
degradacin del 86% de los sustratos contenidos en este sitio contaminado con
gasolina (www.bioprest.net.).

La degradacin de gasolina por microflora de suelo y agua en sitios contaminados,

es realmente eficiente, se puede alcanzar un nivel de biodegradacin hasta del
90%. La limitacin de esta microflora aparentemente se presenta a nivel de la
degradacin de compuestos como el ciclohexano y trimetilpentano, los cuales se
presentan como compuestos recalcitrantes (Margarida et al., 2003). La microflora
degradadora de ciclohexano e isoctano es seleccionada directamente de las
muestras tomadas del ambiente. La cepa que utiliza el ciclohexano como nica
fuente de carbono no se ha logrado aislar pura, debido a los fenmenos de
metabolismo y cometabolismo involucrados en la degradacin de este compuesto.

En cuanto a la capacidad de degradacin del isoctano, resulta ser complicada en las

muestras naturales, solo se ha aislado el Mycobacterium austroafricanum con esta
capacidad, as como tambin se ha encontrado que esta cepa se caracteriza por el
uso de ciclohexano como un cosustrato, pues su habilidad radica en el uso de
isoctano como nica fuente de carbono.

Otro gnero estudiado dentro de las tcnicas de biorremediacion es Sphingomonas

sp., bacilos no fermentadores y dentro de estos la Sphingomona wittichi es un
microorganismo capaz de degradar en condiciones anaerobias el 2.7diclorobenceno,
produciendo el metabolito 4 clorocatenol y el 1,2,3,4 tetraclorodibenceno, y cepas
como Sphingomonas yanoikuyae, y Sphingomonas paucimobilis como degradadoras
de PAH.s utilizandolos como nica fuente de energa, tienen actividad Catecol 2,3-
dioxigenasa, fenantreno y antraceno.

Se han aislado cepas capaces de metabolizar naftaleno y fenatreno como nica

fuente de carbono, estas fueron taxonmicamente implicadas en diferentes
subclases de las Proteobacterias (Sphingomonas sp, Acidovorax sp, Comamonas
sp, y Pseudomonas sp), y a bacterias Gram positivas con bajo y alto contenido de
DNA G+C (Paenibacillus sp y Rhodococcus sp, respectivamente) (Christopher et al.,
2004).

Alcalgenes sp., Micobacterium sp. y Bacteroides sp. han sido reportados como
degradadores de hidrocarburos de petrleo, y estos filotipos son candidatos para el
tratamiento de terrenos contaminados con TPH. Sin embargo su poca abundancia
se convierte en unadesventaja para su aplicacin (Nannipieri et al., 2001).

La degradacin del bifenil policlorinato PCBs y otros hidrocarburos por

microorganismos como Comamonas acidovorans, Acinetobacter calcoaceticus,
Achromobacter sp. Pseudomonas sp. Flavobacterium devorans, Bacillus lentus,
Bacillus mascerans y Bacillus thuringensis ha sido aplicada con buenos resultados
para el tratamiento de los mismos (Jizhong et al., 2001). Se ha referenciado que
las Comamonas sp. son degradadoras de fenaltreno, Gordona sp. degrada el
Pireno, de 5 a 35 das luego de ser inoculada.
 Azoarcus spp. puede degradar benceno, tolueno, etilbenzeno y xileno (31,32). En
el estudio hecho por Christopher W. Kaplan y Christopher L. Kitts en cuanto al
dinamismo de las comunidades bacterianas en relacin con la concentracin de
petrleo en el suelo, la importancia de las comunidades microbianas radica en su
maquinaria celular como responsable de la bioconversin de estos contaminantes.

Los microorganismos que conforman el consorcio microbiano extremo haltolerante

para la biodegradacin de crudos son altamente empleados en medios con gran
cantidad de salinidad y contaminados con benceno.

Las poblaciones microbianas usadas para degradar hidrocarburos recalcitrantes

(aromticos), son menos eficientes, debido a que producen sustancias txicas que
pueden inhibir los microorganismos degradadores de aceite diesel.

La persistencia de los PAHs en el ambiente se deben a factores como los nutrientes,

la viabilidad, la temperatura, el oxigeno y la presencia de microorganismo
degradadores y el mayor problema para la degradacin de esto es la baja
solubilidad en agua para poder implementar un sistema aerbico, por esto la
degradacin anaerbica a bajas temperaturas ha sido estudiada como posible causa
de una baja degradacin donde encontraron que las bajas temperaturas no afectan
la poblacin microbiana sino que la disponibilidad de oxigeno, siendo este el agente
ms limitante y que conduca a formacin metabolitos txicos que inhiban el
crecimiento bacteriano (Sanjeet et al., 2001).

IX. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA BIODEGRADACION

IX.1. CONCENTRACION DE LOS HIDROCARBUROS

Un factor fundamental limitante es la concentracin de los productos

contaminantes de los HC en aguas y suelos. Su elevada concentracin
impide la actividad de la microbiota nativa (Admn. et al., 2001), y es
por tanto necesario una remocin mecnica, sin la cual no es posible
realizar ninguna operacin por va biolgica.

Cuando no se realiza la remocin mecnica no se logra resultados

positivos como los que reportaron Seklemova et al., (2001) al estudiar el
efecto del enriquecimiento con nutrientes minerales sobre la actividad
mineralizadora de la microbiota nativa, en un suelo forestal contaminado
con diesel a concentracin de: 6000 mg/kg -1 , 4000 mg/kg-1 y 2000
mg/kg-1. La falta de resultados indica que la solucin mineral no fue
suficiente para estimular la mineralizacin de los HC por la alta
concentracin de los productos de los HC que inhibi la actividad
metablica.

Ijah y Antai evaluaron el efecto de diferentes concentraciones: 10, 20,

30, 40% v/w de petrleo crudo ligero nigeriano (PCLN) derramado en un
suelo agrcola. La poblacin bacteriana disminuy con el aumento en la
concentracin del petrleo. La degradacin de los productos de los HC
fue de 26.7-13.3% despus de 16 das. En el suelo contaminado con
PCLN a concentracin de 10% y 20% los productos de los HC se
mineralizaron rpidamente, al 30% ligeramente. Mientras que a
concentracin del 40% fue mnima su mineralizacin en 12 meses.
IX.2. SOLUBILIDAD DE LOS HIDROCARBUROS

Otro factor que limita la mineralizacin de los productos los HC es la

solubilidad de sus componentes. Por ello se recomienda detergentes
qumicos y biolgicos que al reducir la tensin superficial, aumentan la
solubilidad de los productos txicos de los HC y su disposicin para su
mineralizacin por la microbiota nativa. Un ejemplo es el reportado por
Moran et al., (2000), donde evaluaron el efecto de minerales esenciales
y un detergente en la degradacin de HC por la biota nativa de un suelo
agrcola a nivel matraz y reportan que los minerales y el detergente
estimularon la mineralizacin natural de los productos de los HC de tipo
alifcticos en un 35.5% y en el caso de los aromticos en un 41%. El
detergente facilito la degradacin de alcanos de cadena larga.

IX.3. CONCENTRACIN DE NUTRIENTES EN LA ESTIMULACIN DE LA

ACTIVIDAD BIOLGICA NATURAL.

Los HC son una fuente importante de carbono y energa para la

microbiota nativa, sin embargo la concentracin de otros nutrientes
(nitrgeno y fsforo) para estimular el crecimiento microbiano es mnima
(Prince et al., 2002). La alta concentracin de carbono en suelos y aguas
contaminados por HC disminuyen la disponibilidad de nutrientes
inorgnicos rpidamente (Margesin et al., 1999), y en consecuencia la
actividad mineralizadora del consorcio microbiano. Una estrategia para
equilibrar la concentracin de nutrientes y estimular la mineralizacin de
los HC por la biota nativa es la bioestimulacin (Trinidade et al., 1990).
X. DISEO Y APLICACIN DE LOS SISTEMAS DE BIOTRATAMIENTO

El diseo de estos sistemas de tratamiento se llevar a cabo estableciendo varias

etapas de trabajo:

Esquema de diseo y aplicacin de los sistemas de biotratamiento

IV.2. Anlisis y eleccin de las medidas biocorrectivas

X.1. Fase de investigacin y caracterizacin de la contaminacin y del

emplazamiento

El primer paso para preparar el diseo de biotratamiento en el suelo es la

realizacin de una completa investigacin del medio, que incluye principalmente
el estudio exhaustivo de la caracterizacin del emplazamiento y del tipo y
concentracin de la contaminacin existente.

La caracterizacin del emplazamiento se llevar a cabo mediante el estudio del

mismo detallando la volumetra del suelo a tratar, las condiciones geolgicas e
hidrogeolgicas, analizando las caractersticas del suelo y sus propiedades (pH,
granulometra, humedad, porosidad, etc).
La caracterizacin del contamnante se centrar en la investigacin del tipo y
concentracin del mismo, as como la biodisponibilidad de los compuestos en el
suelo (aceptores de electrones, metales pesados, nutrientes, etc).

X.2. Anlisis y eleccin de las medidas biocorrectivas

De la fase de investigacin inicial, una vez identificadas las caractersticas del

emplazamiento, del suelo y del contaminante, se podr pasar al anlisis y
eleccin de las medidas biocorrectivas ms adecuadas. Para ello ser necesario:
 1. Identificar y cuantificar los contaminantes. Definiendo sus
propiedades fsico-qumicas ms importantes.
Identificacin y clasificacin de compuestos.
Concentracin en suelos y aguas subterrneas.
Caracterizacin de la presin de vapor, constante de Henry,
densidad y grado de solubilidad.

2. Conocer los factores que influyen en la transformacin biolgica de

los contaminantes.
Factores ambientales: tales como humedad, oxgeno
disuelto, temperatura, pH, disponibilidad de nutrientes.
Factores microbiolgicos: presencia de microorganismos y
aclimatacin de las poblaciones microbianas.

3. Designar las medidas biocorrectivas. En funcin de los factores

anteriormente expuestos, se elegira el sistema de biotratamiento
ms adecuado.

X.3. Diseo y evaluacin del sistema

Para el diseo de un sistema de biorrecuperacin es necesario establecer unas

etapas de trabajo, en las cuales se determinan y evalan los parmetros
fundamentales necesarios para su eficacia.
Las etapas a seguir en el diseo de un sistema de biotratamiento son:
1. Evaluacin de la viabilidad de la tcnica. Se estudiarn los parmetros de
evaluacin que definen el sistema elegido, as como se evaluar las
condiciones de biotratabilidad, los objetivos de limpieza exigidos y los
costes de tratamiento necesarios.
2. Evaluacin del diseo. Se estudiarn los factores que afectan la eficacia
de la tcnica y las posibles mejores o acondicionamientos a aplicar.
3. Evaluacin del control y seguimiento

X.4. Control y seguimiento

Para asegurar la correcta ejecucin y un progreso adecuado del tratamiento se

debe llevar a cabo un plan de control y seguimiento del sistema.
Para una correcta optimizacin se debern controlar los siguientes puntos:
1. Control de las condiciones de degradacin y biodegradacin. Se
registrar la variacin de concentracin de TPH, BTEX, COVs, CO2
desprendido y Oxigeno disuelto, variacin de nutrientes (N, P, etc.)
2. Control de los parmetros que afectan directamente en el
funcionamiento del sistema

X.5. Anlisis e interpretacin de resultados

En esta ltima etapa se analizan los resultados obtenidos, haciendo un balance

de los objetivos alcanzados y los marcados inicialmente. En este punto, si fuese
necesario, se debern proponer y estudiar aquellas mejoras o modificaciones
necesarias para la optimizacin del sistema.
XI. CONCLUSION

Las medidas biocorrectivas o los sistemas de biorremediacin son tcnicas de

descontaminacin suficientemente estudiadas y evaluadas, basados en los procesos
de biodegradacin y fcilmente aplicables.

Es necesaria una investigacin y caracterizacin de la contaminacin y del

emplazamiento de forma rigurosa para evaluar y elegir la medida biocorrectiva ms
adecuada y disear el sistema de manera ptima, as como es necesario llevar a
cabo un control y seguimiento del mismo.

XII. BIBLIOGRAFIA

Poidexter, L. y Miller,P .1994. In: Gibson and Sayler. 1996. Predicatability of

biorremedation perfomance cannon be made with a High level of confidence.
American Academic of Microbiology, Washington DC, USA.

Marivela, C., Guerrero, C., Lpez, L., Snchez, V. y Toledo, A.2002. Metales
pesados y medio ambiente. Grupo de seminario 1-26, Barcelona, Espaa.

Galli, C. 2002. Degradacin por medios bacterianos de compuestos qumicos

txicos. Comisin Tcnica Asesora en: Ambiente y desarrollo sostenible,
Buenos Aires, Argentina.

Golovleva, L., Aharonson, R., Greenhalg, N., Sethunathan, N. y Vonk, W.

1990. The rol and limitations of microorganism in the conversin of
xenobiotics. Puer and apl. Chem 62: 351-364.

Vasquez, M. y Reyez, W.2002. Degradacin de Aroclor 1242 por Pseudomas

sp. Biblioteca Nacional del Per, Per.

Fournier, D., Halasz, A., Spain, J., Fiurasek, P. y Hawari. J. 2002.

Determination of key metabolites during biodegradation of hexahidro 1,3,5
Trinitro 1,3,5 Triazine with Rhodococcus sp Strain DN 22. Applied and
Enviromental Microbiology 68: 166-172.

Halden, R., Tepp, S., Halden, B. y Dwryer, D. 1999. Degradation of 3

phenoxybenzoic acid in soil by Pesudomonas pesudoalcaligenes POB310
(pPOB) and two Modified Pseudomonas Strains. Applied and enviromental
microbiology 65: 3354-3359.

Boldu, F., Vervoort, J., Grontehuis, J. y Van Groenestijn, J. 2002. Sunstrate

interactions during the biodegradation of Benzene, Toluene Ethylbenzene
and Xylne (BTEX) Hidrocarbons by the funfus Cladophialophora sp strains
T1. Applied and Enviromental Microbiology 68: 2660-2665.

Abed, R., Safi, N., Kster, J., Beer, D., El Nahhal, Y., Rullktter, J. y Garca,
F. 2002. Microbial diversity of a heavily polluted microbial mat and its
community changes folloging degradation of petroleum compunds. Applied
and enviromental microbiology 68: 1674-1683.

Lai, K., Scrimhaw, M. y Lester, J. 2002. Biotransformation and

bioconcentration of steroid estrogens by Chlorella vulgaris. Applied and
enviromental Microbiology 68: 859-864.
 Saracino, C.; Ercoli, E.;Glvez, J.; Videla, O..Evaluacin de dos aos de
experiencias de campo en Biorremediacin de suelos. Universidad de Cuyo,
Argentina, 2001

Crawford, J., Traina, S. y Touvinen, O. 2000. Bacterial degradation of

atrazine in redox potential gradients in fixed-film sand columns. Slil Science
Society of America Journal 64: 624-634.

Wilson, D. y Oma, H. 2000. Technical bulletin of sparging y biosparging,

Washington DC, USA.

Cunningham C, Philp J. Comparison of Bioaugmentation and Bioestimulation

in ex situ treatment of Diesel Contaminated Soil. Land Contamination and
Reclamation. 2000; 8 (4): 261-269.

Tllez J, Valderrama B. Microbiologa del petrleo y sus derivados. Instituto

de Biotecnologa, Universidad Nacional Autnoma de Mxico. 2000.

Rivera M, Ferrera R, Volke V, Rodrguez R, Linares L. Adaptacin y Seleccin

de Microorganismos Autctonos en Medios de Cultivos Enriquecidos con
Petrleo Crudo. Terra. 2000; 20: 423-434.

Rich J, Heichen R, Bottomley P, Cromack J, Myrold D. Community

composition and functioning od denitrifying bacteria from adjacent meadow
and forest soil. Applied and Environmental Microbiology. 2000; 69(10):
5974. 5982.

Van Hamme J, Ajay S, et al. Recent advances in petroleum Microbiology.

Microbiol Mol Biol Rev. 2000; 67(4): 503.549.

Flavio B, Leonardo F, Zachia M. Production of biosurfactant by hydrocarbon

degrading Rhodococcus ruber and Rhodococcus erythropolis. Revista de
Microbiologa. 1999; 30 (3).

W. Degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons at low temperature

under aerobic and nitrate-reducing. Appl Environ Microbiol. 2003; 69(1):
275.284.

Carla A, Nicholson M, Fathepure B. Biodegradation of benzene by halophilic

and halotolerant bacteria under aerobic conditions. Applied and
Environmental Microbiology. 2004; 70(2): 1222-1225.

Nelson K, Weinel C, Paulsen I, Dodson R, Hilbert H, Martins dos Santos V,

Fouts D, Gill S, Pop M, Holmes M, et al. Complete genome sequence and
comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida
KT2440. Environmental Microbiology. 2002; 4: 799-813.

Rockne K, Chee-Sanford J, Sanford R, Brian P, James T, Staleyand S.

Anaerobic naphthalene degradation by microbial pure cultures under nitrate-
reducing conditions. Applied and Environmental Microbiology . 2000; 66:
(4)1595-1601.

Gesche B, Andreas F, Witzel K. Development of PCR primer system

amplification of nitrite reductase genes (NirK an nirS) to detect denitrifying
bacteria in environmental samples. 1998.
 Daane L, Harjono I, Zylstra G, Hggblom M. Isolation and characterization of
polycyclic Aromatic hydrocarbondegrading bacteria associated with the
Rhizosphere of salt Marsh plants. Applied and Environmental
Microbiology.2001; 67(6):2683-2691.

Kstner M, Breuer M, Mahro B. Impact of inoculation protocols, salinity, and

pH on the degradation of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs) and
survival of PAHdegrading Bacteria introduced into soil. Applied and
Environmental Microbiology. 1998; 64(1): 359-362.

Svenja R, Alexander N, Ulf S, Peter K. Differential detection of key enzymes

of polyaromatic-hydrocarbon-degrading bacteria using PCR and gene probes.
Microbiology. 1999; 145: 1731-1741.

Floriane S, Marchal R, Serge C, Christelle V, Lebeault J, Vandecasteele J. A

Mycobacterium strain with extended capacities for degradation of gasoline
hydrocarbons. Microbiology. 2000; 66( 6): 2392-2399.

De Lorenzo V. Biorremediacin: De la placa de petri al medio ambiente.

Centro Nacional de Biotecnologa.2002. En: www.bioprest.net.

Margarida M, Pozzi E, Campos J, Cleto R, Mattos E. Estimate of denitrifying

microbiota in tertiary sewage treatment and kinetics of the denitrification
process using different sources of carbon. Brazilian journal of Microbiology.
2003; 34: (2).

Christopher W. Kaplan R, Christopher L. Bacterial succession in a petroleum

land treatment unit. Appl Environ Microbiol. 2004; 70(3): 1777.1786.

Nannipieri P, Ascher J, Ceccherini M, Landi L, Pietramellara M, Renella G.

Microbial diversity and soil functions. 2001. European Journal Soil Science.
2001; 54(4): 655-670.

Jizhong Z, Beicheng X, David T, Wu L, Terry M, Robert Neill, Anthony P, and

James M. Spatial and resource Factors Influencing High Microbial Diversity in
soil. Environmental Sciences Division. Center for Microbial Ecology, Michigan
State University, Michigan. 2001.

Sanjeet M, Jeevan J, Ramesh C, Banwarj L. Evaluation of Inoculum Addition

To Stimulate in situ Bioremediation of Oily-Sludge- Contaminated Soil.
Applied And Enviromental Microbiology. 2001; 67(4):1675-1681.

Admn, S., M. Green, and Y. Avnimelech. 2001. Biodegradation Kinetics of

hydrocarbon in soil dring land treatment of oily sludge. Bioremediation
Journal 5:193-209.

Seklemova, E., Pavlova, A. and Kovacheva, K. 2001. Biostimulation-based

bioremediation of diesel fuel: field demonstration Biodegradation 12:311-6.

Prince, R. C., J. R. Clark, and K. Lee. 2002. Bioremediation effectiveness:

Removing hydrocarbons while minimizing environmetal impact. 9th
International Petroleum Environmental Conference, IPEC (integrated
Petroleum Enviromental Consortium), Albuquerque, Nuevo Mxico.USA.

Margesin, A., A. Zimmerbauer, and F. Schinner. 1999. Monitoring of

bioremediation by soil biological activities. . Chemonsphere 40:339-346
 Trinidade, P., L. G. Sobral, A. C. Rizzo, S. G. F. Leite. J. L. S. Lemons, V. S.
Milloili, and A.U. Soriano. 2002. Evaluation of petroleum hydrocarbon
contaminated soils. 9th International Petroleum Environmental Conference,
IPEC (Integrated Petroleum Environmental Consortium), Albuqerque, Nuevo
Mxico. USA.