Informe de Laboratorio.

Fisiología microbiana, Universidad de Antioquia –

Seccional suroeste
Andrés Felipe Villa

Informe de Laboratorio. Fisiología microbiana, Universidad de Antioquia –

Seccional suroeste
Andrés Felipe Villa

FACTORES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO MICROBIANO II

Estado fisiológico y edad del cultivo

Factors that affect microbial growth II. Physiological state and culture age

Andrés Felipe Villa Restrepo1

Juliana Mesa Ospina2, Andrés Felipe Carmona3, Maria Alejandra Zapata4

INTRODUCCIÓN

Todos los microorganismos, igual que todos los seres vivos, necesitan un conjunto
de factores que les permita crecer/vivir en un determinado medio ambiente. Estos
factores son, obviamente, diferentes para cada microorganismo. Así de forma
general, las bacterias requieren ambientes diferentes que las levaduras y éstas
requieren ambientes diferentes que los hongos, etc. (RENAPRA).

La actividad de una enzima describe qué tan rápido ésta cataliza la reacción que
convierte un sustrato en producto. Esta actividad depende en gran medida de las
condiciones de la reacción, que incluyen temperatura, pH, concentración de la
enzima y concentración del sustrato. (Timberlake, 2013)

Uno de estos cambios se ve reflejando en la actividad enzimática de la célula:

puede disminuir la población de la actividad microbiana que puede resultar en un
descenso de la producción de nuevas enzimas y el segundo en la degradación de
las enzimas entonces la edad de un cultivo es una de las variables que pueden
determinar el estado fisiológico de una población bacteriana ya que influye sobre
la actividad bacteriana.

Gracias sus capacidades reproductivas, las bacterias suponen un rango de vida

casi perpetuo, pues conservan su estructura y su actividad enzimática, pero de
1
Docente de Fisiología Microbiana, Universidad de Antioquia, Escuela de Microbiología, Andes - Antioquia
2
Estudiante de Microbiología Industrial y Ambiental, Universidad de Antioquia, Escuela de Microbiología, Andes – Antioquia
3
Estudiante de Microbiología Industrial y Ambiental, Universidad de Antioquia, Escuela de Microbiología, Andes – Antioquia
4
Estudiante de Microbiología Industrial y Ambiental, Universidad de Antioquia, Escuela de Microbiología, Andes – Antioquia
Informe de Laboratorio. Fisiología microbiana, Universidad de Antioquia –
Seccional suroeste
Andrés Felipe Villa

acuerdo con diferentes estudios, se han evidenciado cambios fisiológicos en los

cultivos a medida que aumenta el tiempo, se cree que las siguientes pueden ser
algunas razones en las que también se ve afectada la actividad enzimática: la
disminución de las poblaciones bacterianas que incide directamente en la
reducción en la producción de nuevas enzimas y la degradación de las enzimas
que ya se habían producido. Por consiguiente, es correcto afirmar que la edad de
un cultivo influye en su fisiología y en la producción enzimática. Para llevar el
control de la producción de enzimas se tiene en cuenta la presencia de productos
en función del tiempo y así se puede saber cuál es el estado fisiológico de las
células.

La triptofanasa es una enzima que cataliza la desaminación del triptófano, donde

se remueve el grupo amino y los productos finales son indol, ácido pirúvico y
amoniáco. Esta reacción se da de manera intracelular, en la cual el indol es el
producto de desecho y las otras moléculas son los nutrientes. A través de la
espectrofotometría se puede conocer la cantidad de producto (indol) se produjo en
la catálisis. Cuando el reactivo de Erhlich entra en contacto con el indol, se
produce un color rosado en medio ácido. Este ejercicio es útil para medir la
cantidad de producto resultante de una reacción de catálisis enzimática.

RESULTADOS

RESULTADOS CRUDOS

Temperatura: 35°C
Tiempo: 1, 3, 5, 7, 24 horas
Medición de actividad enzimática triptofanasa: ensayo de producción de Indol

Tabla 1.
Volumen (mL) Componente Tubo #1 (Blanco) Tubos #
Informe de Laboratorio. Fisiología microbiana, Universidad de Antioquia –
Seccional suroeste
Andrés Felipe Villa

2,3,4,5,6,7
Buffer pH 7,8 0,2 0,2
Suspensión
0,1 0,1
bacteriana
Agua 1,7 1,6
0,1
L-triptófano 0,05M --

Tabla 2. Tabla de Resultados

Densid
ad Cuantificación de Indol (absorbancia a 540 nm)
Celular
Tiemp Absorb
Cultivo
o (min) ancia Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 Tubo 7
600 10 min 10 min 25 min 25 min 35 min 35 min
nm
E1 60 0,180 0,185 0,175 0,240 0,134 0,239 0,238
E2 120 0,410 0,370 0,345 0,396 0,393 0,431 0,450
E3 300 0,419 0,364 0,404 0,354 0,406 0,413 0,364
E4 360 0,499 0,487 0,546 0,519 0,524 0,462 0,495
E5 1380 0,591 0,977 0,977 0,723 0,607 0,897 0,897

Muestra que da positivo, se

cuantificó el Indol con el reactivo
de Erhlich y se le agregó tolueno
para romper las células y liberar el
Indol.

RESULTADOS PROCESADOS

Concentraciones de Indol mg/L

E1
x= 0,185+0,002 = 124,67
0,0015
10 min
x= 0,175+0,002 = 118
0,0015
Promedio: 121,34
Informe de Laboratorio. Fisiología microbiana, Universidad de Antioquia –
Seccional suroeste
Andrés Felipe Villa

x= 0,240+0,002 = 161,33
0,0015
25 min
x= 0,134+0,002 = 90,67
0,0015
Promedio: 126
x= 0,239+0,002 = 160,67
0,0015
35 min
x= 0,238+0,002 = 160
0,0015
Promedio: 160,34

E2
x= 0,370+0,002 = 248
0,0015
10 min
x= 0,345+0,002 = 231,33
0,0015
Promedio: 239,67
x= 0,396+0,002 = 265,33
0,0015
25 min
x= 0,393+0,002 = 263,33
0,0015
Promedio: 264,33
x= 0,431+0,002 = 288,67
0,0015
35 min
x= 0,450+0,002 = 301,33
0,0015
Promedio: 295

E3
x= 0,364+0,002 = 244
0,0015
10 min
x= 0,404+0,002 = 270,67
0,0015
Promedio: 257,34
25 min x= 0,354+0,002 = 237,33
0,0015

x= 0,406+0,002 = 272
0,0015
Informe de Laboratorio. Fisiología microbiana, Universidad de Antioquia –
Seccional suroeste
Andrés Felipe Villa

Promedio: 254,67
x= 0,413+0,002 = 276,67
0,0015
35 min
x= 0,364+0,002 = 244
0,0015
Promedio: 260,34

E4
x= 0,487+0,002 = 326
0,0015
10 min
x= 0,546+0,002 = 365,33
0,0015
Promedio: 345,67
x= 0,519+0,002 = 347,33
0,0015
25 min
x= 0,524+0,002 = 350,67
0,0015
Promedio: 349
x= 0,462+0,002 = 309,33
0,0015
35 min
x= 0,495+0,002 = 331,33
0,0015
Promedio: 320,33

E5
x= 0,977+0,002 = 666
0,0015
10 min
x= 0,977+0,002 = 666
0,0015
Promedio: 666
x= 0,723+0,002 = 483,33
0,0015
25 min
x= 0,607+0,002 = 406
0,0015
Promedio: 444,67
35 min x= 0,897+0,002 = 599,33
0,0015

x= 0,897+0,002 = 599,33
Informe de Laboratorio. Fisiología microbiana, Universidad de Antioquia –
Seccional suroeste
Andrés Felipe Villa

0,0015
Promedio: 599,33

Concentraciones de Indol mg/L

Cultivo Tiempo (min)
10 min 25 min 35 min
E1 60 121,34 126 160,34
E2 120 239,67 264,33 295
E3 300 257,34 254,67 260,34
E4 360 345,67 349 320,33
E5 1380 666 444,67 599,33

Gráfica de Producción de Indol

Producción de Indol en el Tiempo para

cada Edad de Cultivo
700
600
500
Indol (mg/l)

400
300
200
100
0
5 10 15 20 25 30 35 40
Tiempo (min)

E1 Linear (E1) E2
Linear (E2) E3 Linear (E3)
E4 Linear (E4) E5
Linear (E5)

Tasa de Producción de Indol (VIndol) mg Indol/h

Ecuación Resultado
E1 y =1,4619x+101,79 y=1,4619(0,180)+101,79=102,044
E2 y =1,4619x+215,74 y=1,4619(0,410)+215,74=307,484
E3 y =0,0965x+255,2 y=0,0965(0,419)+255,2=255,240
E4 y =0,9161x+359,71 y=0,9161(0,499)+359,71=360,167
La gráfica desciende por lo tanto la producción de indol es
E5
nula.

Gráfica de Tasa de Producción de Indol en Función del Tiempo

Informe de Laboratorio. Fisiología microbiana, Universidad de Antioquia –
Seccional suroeste
Andrés Felipe Villa

700

600
Tasa de Producción (Vindol)

500

400

300

200

100

0
60 120 300 360 1380
Tiempo (min)

Densidad Bacteriana (D) UFC/mL

Ecuación obtenida en la gráfica de la práctica Nº3: y= 0,0803x – 1,1633

R2 = 0,6643

x= 0,180+0,1633 = 3,978
E1 0,0863

x= 0,410+0,1633 = 6,643
E2
0,0863
x= 0,419+0,1633 = 6,647
E3
0,0863
x= 0,499+0,1633 = 7,674
E4
0,0863
x= 0,591+0,1633 = 8,740
E5
0,0863

Tasa Específica de Producción de Indol

QIndol= VIndol
D

QIndol= 102,044 = 25,652

E1 3,978

QIndol= 307,484 = 46,286

E2
6,643
Informe de Laboratorio. Fisiología microbiana, Universidad de Antioquia –
Seccional suroeste
Andrés Felipe Villa

QIndol= 255,240 = 37,830

E3
6,747
QIndol= 360,167 = 46,933
E4
7,674
E5 N.A

Gráfica de Tasa Específica de Producción de Indol en Función del Tiempo

80
Tasa Específica de Producción de Indol

70
60
50
(Qindol)

40
30
20
10
0
60 120 300 360 1380
Tiempo (min)

ANÁLISIS DE RESULTADOS

La tasa de producción de Indol (V Indol) se hace mediante un cálculo sobre la

absorbancia medida en 600 nm y a través de la línea de regresión que nos arroja
cada edad de cultivo en cambio por su parte la tasa específica de producción
(QIndol) es el resultado de haber sacado la tasa de producción vs la densidad
bacteriana de cada edad de cultivo que esta última se sacó de la ecuación de la
práctica Nº3.

Tasa de Producción de Indol en Función del Tiempo

Se observa que la producción de Indol empezó a aumentar desde el minuto 60

hasta el minuto 120, a partir de ese tiempo la producción de Indol empieza a
disminuir hasta el minuto 300, después de esto hay un leve aumento de la
producción hasta el minuto 360 y empieza a mantenerse un poco estable hasta
que empieza nuevamente a disminuir, esto puede suceder porque probablemente
a través de que va transcurriendo el tiempo el microorganismo va perdiendo su
actividad enzimática.
Informe de Laboratorio. Fisiología microbiana, Universidad de Antioquia –
Seccional suroeste
Andrés Felipe Villa

Comparación de la Tasa Específica de Producción de Indol en Función del

Tiempo con la gráfica del numeral 2.

De acuerdo a las pendientes

encontradas en las gráficas, se
observan 2 pendientes
negativas inicialmente,
correspondientes a las gráficas
del cultivo E1 y E4, esto indica
que
la producción de indol
disminuye al pasar el tiempo.
En las gráficas
correspondientes a
E2, E3 y E5, se observó
pendiente positiva, de lo cual
muestra que la producción de
indol
Informe de Laboratorio. Fisiología microbiana, Universidad de Antioquia –
Seccional suroeste
Andrés Felipe Villa

aumenta en el tiempo.
La menor producción de Indol se
observó en la edad de cultivo 1,
debido a que el número
de enzimas que interactúan con
el sustrato es menor, por ello se
produce menos cantidad
de indol, lo cual está relacionado
con la cantidad de células
viables. En esta grafica hay
un error aleatorio asociado con la
producción de Indol debido a
que se observa aumento
en la producción de indol hasta
los 25 minutos y a partir de este
tiempo hasta 35 minutos,
Informe de Laboratorio. Fisiología microbiana, Universidad de Antioquia –
Seccional suroeste
Andrés Felipe Villa

la producción de indol disminuye

De acuerdo a las pendientes encontradas en la gráfica, se observa 1 pendiente
negativa, correspondiente a la gráfica del cultivo E5, esto indica que la producción
de indol disminuye al pasar el tiempo. En las gráficas correspondientes a E1, E2,
E3 y E4, se observó pendientes positivas, de lo cual muestra que la producción de
indol aumenta en el tiempo. La menor producción de Indol se observó en la edad
de los cultivos E3 y E4, debido a que el número de enzimas que interactúan con el
sustrato es menor o en su efecto se puede encontrar en la fase estacionaria en la
cual no varía el número de microorganismos, por ello se produce menos cantidad
de indol, lo cual está relacionado con la cantidad de células viables. En esta
grafica hay un error aleatorio asociado con la producción de Indol en el cultivo E5
debido a que se observa una disminución en la producción de indol desde el
minuto 10 hasta los 25 minutos y a partir de este tiempo hasta 35 minutos, la
producción de indol aumenta.

En la tasa específica de producción de Indol desde el minuto 60 hasta el minuto

120 hay una leve producción de Indol, a partir de ahí hay una leve disminución de
Indol hasta el minuto 300 en donde podemos ver que hay un aumento alto de la
producción de Indol hasta el minuto 360 luego de esto entra en una fase de
muerte en donde el microorganismo empieza a disminuir porque deja de
metabolizar entonces deja de producir el Indol.

Implicaciones Fisiológicas de los Cambios en la Actividad Enzimática con

Respecto a la Edad del Cultivo

La actividad enzimática se ve afectada a diferentes factores tales como:

temperatura, pH y concentración, las enzimas tienen un mejor funcionamiento en
temperatura y pH óptimos en los microorganismos si estas no son así puede
perder la capacidad de unirse a un sustrato; las implicaciones que puede tener con
respecto a la fisiología en estos cambios puede ser que el microorganismo no esté
en las condiciones adecuadas para su crecimiento, debe de tener al menos un
alimento con buenos nutrientes para su proliferación, entre más joven sea el
cultivo más células va a replicar y la actividad enzimática va a actuar dependiendo
del medio en el que esté, a medida que va habiendo muerte celular va
disminuyendo la actividad enzimática pero los organismos que quedan vivos van a
seguir produciendo hasta que llega su muerte; el indol se encuentra en las células
del microorganismo que tenga triptófano y es capaz de degradar los aminoácidos
de triptófano a través de la enzima triptofanasa ya que cataliza la desaminación
del triptófano y esto sucedió por la aplicación del Tolueno para romper las células
y así poder liberar el indol.

BIBLIOGRAFÍA
Informe de Laboratorio. Fisiología microbiana, Universidad de Antioquia –
Seccional suroeste
Andrés Felipe Villa

1. Red Nacional de Protección de Alimentos (RENAPRA).

https://mascapacitacioncrudosymarinados.wordpress.com/factores-que-
influyen-en-la-supervivencia-y-crecimiento-de-microorganismos-en-los-
alimentos/

2. Timberlake, K. (2013). Química general, orgánica y biológica: estructuras de

la vida. México: Pearson Educación
https://uruguayeduca.anep.edu.uy/sites/default/files/inline-files/Factores
%20que%20afectan%20la%20actividad%20enzim%C3%A1tica.pdf

3. http://coli.usal.es/web/demos/demo_alteracion/FactoresCrecimiento/
FactoresCrecimiento.html