ESTEQUIOMETRÍA Y CINÉTICA

MICROBIANA

Cinética del crecimiento microbiano y de la

formación de producto

1
 Temario
3.0 Cinética del crecimiento microbiano y de la formación de producto
3.1 Requisitos para el crecimiento microbiano
3.2 Cuantificación del crecimiento
3.3 Parámetros cinéticos
3.3.1 Velocidades volumétricas
3.3.2 Velocidades específicas
3.3.3 Tiempo de duplicación
3.3.4 Grado de duplicación
3.3.5 Productividad volumétrica
3.3.5 Edad del cultivo
3.4 Fases de crecimiento en cultivo por lotes (batch)
3.5 Cinética de la utilización de substrato y de la formación de producto
3.6 Modelos cinéticos
3.6.1 Modelos cinéticos para el crecimiento
3.6.2 Modelos cinéticos para la formación de producto
3.7 Modelado de un cultivo por lotes (batch) simple
3.8 Cinética del decaimiento microbiano
3.9 Relación entre el ambiente y el crecimiento microbiano

2
 3.1 Requisitos para el crecimiento microbiano

Los requisitos para el crecimiento microbiano son:

• Inóculo viable
• Fuente de energía
• Medio de cultivo con los nutrientes necesarios
• Ausencia de inhibidores
• Condiciones ambientales apropiadas.

3
 3.2 Cuantificación del crecimiento
• El estudio cuantitativo de la cinética microbiana requiere
contar con métodos confiables y sencillos para medir el
crecimiento de poblaciones.
• Las medidas más usadas de la cantidad de
microorganismos son el número de células y la masa celular
en base seca (biomasa). Esta última es la más usada desde el
punto de vista “ingenieril”.
• No existe necesariamente una relación proporcional entre la
biomasa y el número de células. Esta relación es más
compleja para los microorganismos que crecen formando
agregados o ramificaciones (cultivos miceliales).
• En el caso de cultivos miceliales (hongos, actinomicetos),
los microorganismos pueden desarrollarse en forma
difusa en toda la masa de líquido o en forma discreta
adoptando la forma esférica (pellets).
4
• La biomasa y el número de células que interesan
determinar son los correspondientes a los microorganismos
activos, aquellos que realmente participan en el
bioproceso.
• No todos los microorganismos vivos o medidos como
viables están realmente activos.
• La actividad microbiana se mide por la velocidad para
realizar la transformación de interés por cantidad de
microorganismos presentes en el sistema considerado
(velocidades específicas).
• La biomasa que debiera usarse en las ecuaciones que
describen y cuantifican procesos microbianos es la “biomasa
activa”. En la práctica, se mide la masa celular total y
paralelamente se hacen de medidas de viabilidad o actividad
celular.
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 Lista parcial métodos para cuantificar el crecimiento de
poblaciones microbianas

• Recuento directo de células en celda

• Recuento de colonias crecidas en placa
• NMP
• Medida de peso seco por gravimetría
• Nefelometría
• Turbidimetría
• Correlación entre microorganismos y el nivel de un componente
celular (nitrógeno, proteína, ADN, ATP, etc.)
• Correlación entre microorganismos y una actividad metabólica
(consumo de substrato, formación de producto, emisión de luz, etc.)
6
 3.3 Parámetros cinéticos
Los parámetros definidos en esta sección se refieren
básicamente a cultivos en medio líquido “homogéneneos”.

3.3.1 Velocidades volumétricas

Se define como el cambio de un componente por unidad de
volumen y de tiempo.

(17)

En términos de concentraciones, se pueden expresar:

(18) (19) (20)

rS: velocidad volumétrica de consumo de substrato

rX: velocidad volumétrica de crecimiento microbiano
rP: velocidad volumétrica de formación de producto
7
 3.3.2 Velocidades específicas

Se denominan también actividades o cocientes metabólicos

En términos de concentraciones:

Velocidad específica de consumo de substrato: (21)

Velocidad específica de formación de producto: (22)

Velocidad específica de crecimiento: (23)

A partir de la ecuación 23, μ se puede expresar también como:

(24)
8
• La pendiente de la curva ln X vs t es μ.
• Para cultivos microbianos sin limitaciones en la
disponibilidad de substrato, μ es generalmente constante y
corresponde al valor máximo (μm) para las condiciones
existentes.
• El cultivo bajo dichas condiciones sigue una cinética de
primer orden. Sigue el comportamiento cinético de una
reacción autocatalítica.
• El período durante en el cual el crecimiento tiene lugar con
μ constante se denomina fase exponencial o logarítmica,
según se describa el crecimiento en base a X o al ln X. Si μ
es constante, a partir de la ecuación 23 se tiene:

(25) (26)
9
10
 3.3.3 Tiempo de duplicación
Se denomina tiempo de duplicación (td ) el intervalo de tiempo
que insume duplicar la biomasa. A partir de la ecuación 25 o 26
con X = 2X0 y t = td, se tiene:

(27)

3.3.4 Grado de duplicación

Es el número de veces n que se duplica una población
microbiana en un tiempo dado. Se denomina también número
de generaciones.

(28)

11
Tabla 4. Valores típicos de tiempo de duplicación (td)

Tipo de organismo td (h)

Bacterias 0,3 – 2,0

Levaduras 1,0 – 4,0

Hongos filamentosos 2,0 – 4,0

Microalgas 18 – 35

Células animales (in vitro) 20 - 40

12
 3.3.5 Productividad volumétrica
Es un parámetro cinético que se utiliza para evaluar un
proceso desde el punto de vista industrial.

(29)

QX: productividad volumétrica de biomasa

QP: productividad volumétrica de producto

(30) (31)

3.3.6 Edad del cultivo

Intervalo de tiempo que transcurre entre la inoculación y un

tiempo dado, generalmente cuando el cultivo se interrumpe
para usarlo como inóculo u otra aplicación.
13
3.4 Fases de crecimiento en cultivo por lotes (batch)

Fase
I Lag o de retardo
II Aceleración
Exponencial
III (logarítmica), de
producción
IV Desaceleración
V Estacionaria
VI Decaimiento o muerte

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 ln X

Variaciones de X, ln X,
μ y rX con el tiempo X

rX

15
Crecimiento por lotes (batch) usando dos substratos
como fuente de carbono (crecimiento diaúxico)

16
 3.5 Cinética de la utilización de substrato y de la
formación de producto
• La formación de producto y el crecimiento están
relacionados con la utilización (consumo) de nutrientes. En
esta sección se establecerán las relaciones entre ellos,
mediante ecuaciones de balance de materiales.
• En base a la ecuación 4, se tiene:

(32)

Se define velocidad específica de consumo de substrato

para mantenimiento celular “m” como:
(33)

En términos de concentraciones se expresa: (34)

17
 Tabla 5. Valores típicos de velocidad específica de
consumo de substrato para mantenimiento (m)

Organismo m (g/gh)
Lactobacillus casei 0,135
Aerobacter cloacae 0,094
Saccharomyces cerevisiae 0,036
Penicillium chrysogenum 0,022
Candida utilis 0,170
Azobacter vinelandii 0,15
Klebsiella aerogenes 0,04

18
 Introduciendo los parámetros cinéticos y los coeficientes
de rendimiento en la ecuación 32, se tiene:

(35)

(36)

(38)

(37)

(39)
Definiendo YP/X como el coeficiente de rendimiento de
producto por cantidad de biomasa producida, se tiene:

(40) (41)
19
 Para la formación de producto:
(42)

(43)
(44)
Cuando no hay formación de producto, qp = 0 y las ecuaciones
36, 38 y 39 se pueden expresar:

(45)
(46)

(47)

Si los consumos de substrato para mantenimiento celular y

formación de producto son despreciables, m → 0, qP → 0,
entonces YX/S → YG .
20
La relación cinética entre crecimiento y formación de producto
depende del papel del producto en el metabolismo microbiano.
Según lo expresado en el numeral 2.5 se tiene:
a) Formación de producto asociada al crecimiento (clase 1)
b) Formación de producto parcialmente asociada al
crecimiento, cinética mixta (clase 2, situación intermedia entre 1
y 3)
c) Formación de producto no asociada al crecimiento (clase 3).

21
 Velocidades específicas

qP
qS

22
Wang et al. p. 79

23
Bailey & Ollis, 2nd. Ed. pp. 422 – 423.
24
25
 3.6 Modelos cinéticos
• Permiten predecir comportamientos y simular el efecto de
variar las condiciones de operación dentro de su rango de
validez.
• La formulación de un modelo puede ser experimental, teórica
o mixta.
• Modelos más simples idealizan a la población celular como:
• No estructurada
• No segregada
• Estado de crecimiento balanceado: la composición
celular media no se afecta por la proliferación
• Representan comportamiento promedio de las
poblaciones de células a través de la cuantificación de
propiedades del cultivo (tales como X, S, P, μ, qS, qP).

26
 3.6.1 Modelos cinéticos para el crecimiento
• El modelo cinético más difundido es el propuesto por
Monod (1942).
• Establece una relación funcional entre μ y la
concentración de un único nutriente esencial “limitante”.
• Es un modelo sencillo de dos parámetros.
• Se aplica básicamente para el cultivo de un
microorganismo que crece formando células aisladas
(separadas) sobre un substrato simple y cuando no hay
inhibidores del crecimiento.
• Modelo flexible, ha mostrado predecir adecuadamente
el crecimiento de cultivos que no cumplen totalmente los
requisitos anteriores.
• Si bien se basa en la forma de las isotermas de adsorción
de Langmuir y en la cinética enzimática de Michaelis &
Menten, es un modelo de base esencialmente empírica.
27
• Existen modificaciones del modelo de Monod para extender
su aplicación a otros casos: inhibición, crecimiento
diáuxico (varios substratos), substrato complejos no
definidos, cultivos mixtos, etc.

(48)

μm:es la velocidad específica de crecimiento máxima.

KS: constante de saturación, también llamada constante del
modelo de Monod.
μ = μm/2 para S = KS
Generalmente S >> KS y μ ≈ μm, (μ es constante).
El modelo de Monod se aplica básicamente para la fase de
crecimiento exponencial.
28
29
30
 Tabla 5. Valores típicos de la constante de
saturación (KS) del modelo cinético de Monod
Substrato Organismo (género) KS (mg/L)
Glucosa Escherichia 0,07 – 2,0
Glucosa Aspergillus 5,0
Glucosa Saccharomyces 25
Lactosa Escherichia 20
Glicerol Candida 4,5
Oxígeno Candida 0,04 – 0,5
Metanol Pseudomonas 0.7
Fosfato Escherichia 1,6
Mg2+ Klebsiella 0,6
Triptofano Escherichia 0,0005 – 0,001
Arginina Aspergillus 0,5
31
 Modelos cinéticos para inhibición por substrato o producto
• Modelo para inhibición del crecimiento por alta
concentración de substrato (Modelo de Andrews o Haldane).

(49)

• Modelo para inhibición del crecimiento por alta

concentración de producto.

(50)

fP puede tener diferentes expresiones y puede usarse también

para corregir la ecuación 49 cuando existen ambos tipos de
inhibiciones.

(51) (52) (53)

32
33
 3.6.2 Modelos cinéticos para la formación de producto
• Formación de producto asociado al crecimiento
(fermentaciones de clase 1, metabolitos primarios).
(54)
α es un coeficiente cinético y en particular se demuestra que
α = YP/X (ver ecuaciones 40 y 44).

• Formación de producto parcialmente asociada al

crecimiento (fermentaciones de clase 2, cinética mixta).
Modelo de Leudeking & Piret (1959) de dos parámetros, α y β.

(55)
• Formación de producto no asociada al crecimiento
(fermentaciones de clase 3, metabolitos secundarios)
(56)
34
 3.7 Modelado de un cultivo por lotes (batch) simple
Suponemos el cultivo por lotes simple limitado solamente por
un substrato y que sigue el modelo cinético de Monod.

(57)

De la ecuación 3 se tiene: (58)

Introduciendo en la ecuación 57, las ecuaciones 48 y 58:

(59)

(60)

35
 (61)

• La ecuación 61 da una curva X vs t tipo s para el cultivo

microbiano por lotes donde para t → ∞, X → YX/S S0 + X0 .
• Para condiciones en las que KS << S, la ecuación 61 se
puede simplificar y aproximar por la ecuación 25,
ln(X/X0) = μ t, donde μ = μm.
• Las ecuaciones 25 y 61 permiten estimar el tiempo de
fermentación.

36
 3.8 Cinética del decaimiento microbiano
• El decaimiento microbiano generalmente es significativo al
fin de la fase exponencial, cuando existe agotamiento de
nutrientes.
• Sin embargo puede darse también cuando existen
condiciones adversas (cambios en las condiciones
operativas, acumulación de sustancias inhibidoras, etc.)
• El decaimiento microbiano expresado en términos de
biomasa puede presentar dos aspectos:
• Muerte y lisis celular
• Las células consumen su propio material celular de
reserva (autoconsumo) y se denomina metabolismo
endógeno.
• Ambos se describen usualmente como ecuaciones
cinéticas de primer orden.
37
 (62)

• kd se denomina velocidad específica de decaimiento

microbiano.
• Si el proceso es la muerte celular, kd se denomina
velocidad específica de muerte.
• Si el proceso es el consumo endógeno de biomasa kd se
denomina coeficiente endógeno y se denota usualmente
ke .
• Generalmente, bajo condiciones activas de crecimiento
celular, kd es despreciable, kd << μ .

38
 3.8 Relación entre el ambiente y el crecimiento
microbiano
• El resultado exitoso de un bioproceso implica optimizar el “binomio”
microorganismo - ambiente.
• Los factores ambientales inciden en la cinética y por lo tanto en los
parámetros cinéticos.
• Los principales factores ambientales son:
• Formulación del medio de cultivo
• Tipo de nutrientes (simples, complejos, naturaleza química)
• Solubilidad de los nutrientes,
• Concentración de nutrientes y otros componentes
• Tipo de medio (complejo, definido, mínimo)
• pH
• Temperatura
• Concentración de oxígeno disuelto
• Actividad de agua

39
Velocidad específica de crecimiento de Escherichia coli
sobre diferentes tipos de medios de cultivo

Medio de cultivo μ (h-1)

Glucosa y caldo nutriente 1,2

Glucosa y sales minerales 0,82

Acetato y sales minerales 0,52

Succinato y sales minerales 0,14

Wang et al. p. 85.

40
 Para pensar y hacer cuentas

• Si en lugar de construir la curva X vs t para un cultivo por

lotes se mide concentración celular vs tiempo, ¿qué forma
tendría?
• ¿Cuál es el significado físico de Pm en la ecuación 51?
• ¿Cuáles son los valores típicos de μ para diferentes
microorganismos: bacterias, hongos, levaduras,
microalgas?
• Grafica X vs t para el cultivo por lotes de una bacteria en
condiciones ideales. Grafica luego para las siguientes
situaciones: a) hay inhibición por alta concentración de
substrato, b) hay inhibición por alta concentración de
producto, c) existe en el medio de cultivo un inhibidor
químico. Idem para P vs t, suponiendo que la formación de
producto está asociada al crecimiento.
41