1.

OBJETIVO

Establecer las pautas para la reconstitución, propagación, almacenamiento y estandarización de los

microorganismosATCC.

2. ALCANCE

A todos los microorganismos ATCC que se utilizan en el laboratorio.

3. REFERENCIA

Manual de Buenas Prácticas de Manufactura de Productos Farmacéuticos. Ministerio de Salud -

DIGEMID. Lima Perú, vigente. -

Instrucciones para uso EZ-CFU -

Microbiologics
THE UNITED STATES
PHARMACOPEIA -THE NATIONAL FORMULARY
USP Vigente
Manual Microbiologics 39° Edición.

4. INFORMACIÓN BÁSICA

a) ATCC: American Type Culture Collection.

b) Verificar el N° de pasaje en el que se encuentra el microorganismo.

c) Verificar las condiciones de almacenamiento.

d) Los microorganismos se solicitan cuando requiera para algun ensayo especifico

se
y deben
ingresar con su certificado de análisis respectivo y con su hoja de seguridad.
e) Nivel de Seguridad 1 (riesgo individual y poblacional escaso o nulo).- Microorganismos que
tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en el ser humano o los animales.
Nivel de Seguridad 2 (riesgo individual moderado,
riesgo poblacional bajo).- Agentes patógenos
que pueden provocar enfermedades humanas o
animales pero que tienen
de entrañar un riesgo pocas probabilidades
grave para el personal de laboratorio, la
población o el medio ambiente. La
exposición
en el laboratorio puede provocar una infección grave, pero existen
preventivas y terapéuticas eficaces y el riesgo de medidas
propagación limitado.
es

g) Seguridad biológica o bioseguridad el término utilizado

es
para referirse a los principios, técnicas
y prácticas aplicadas con el fin de evitar la
liberación accidental
exposición no intencional a patógenos y toxinas, o su

4.1. Medidas de
Seguridad para el manejo de los
microorganismos
a) Manipular los
microorganismos con mucha precaución tomando en consideración los
implementos de protección para cada caso según hoja de seguridad del microorganismo.
la
 clasificados como nivel de seguridad 1 y 2, en la Cabina de
b) Trabajar los microorganismos
Sala de Análisis N°2, usando un mandil o mandilón adicional sobre el
Seguridad Biológica de la
lentes de seguridad. Ver Cartilla C-CC-032 "Niveles de
uniforme, mascarilla, guantes,
bioseguridad de microorganismos".

clasificados como Nivel de seguridad 2, en la Cabina de Seguridad

c) Trabajar los microorganismos
de guantes, mascarilla y colocarse un mandilón
Biológica de la Sala de Análisis N°2, protegido
sobre el uniforme. Ver Cartilla C-cc-032.
d)Siaccidentalmente se produce un derrame del microorganismo, inmediatamente colocaralgodón
embebido en alcohol al 70 %, sobre la superficie contaminada, dejar en reposo minimo 5
minutos y luego colocar el algodón en una bolsa para su posterior descontaminación en la
autoclave a 121 °C por 60 minutos, limpiar nuevamente con algodón y alcohol al 70 % según
rotación desinfectante C-LO-011, la superficie de trabajo.

e) Si accidentalmente se contamina el uniforme, rociar el desinfectante alcohol al 70 %, sobre el

uniforme, cambiarse el uniforme, esterilizar en la autoclave a 121°C por 60 minutos el uniforme
contaminado antes de entregar a mantenimiento
) Todo material reutilizable, por ejemplo, frasco, tubo de ensayo, cilindro de acero inoxidable, que
entre en contacto con microorganismos de ser descontaminado en la autoclave a 121 °C por 60
minutos antes de lavarlos.

9) Usar asa de kolle (asa bacteriológica) descartables para realizar los pasajes.

h) Todo material descartable que entre en contacto con microorganismos, medio inoculado con
microorganismos o microorganismo expirado debe ser descontaminado en la autoclave a 121°C
por 60 minutos antes de su eliminación.

4.2. Materiales:

a) Tubos de ensayo estériles.

b) Placas Petri estériles

c) Pipetas estériles

d) Micropipetas y Tips
e) Asa de Kolle (asa bacteriológica) descartable

4.3. Medios de Cultivo y Reactivos:

a) Agar Sabouraud dextrosa 4% (AS)

b) Aga Digerido de Caseina y Soja (TSA)

c) Cloruro de Sodio 0,9%

d) Solución Amortiguadora de Fosfato pH 7,2 (Diluyente)

 e) Polisorbato 80

5. DESPLIEGUE

Descripción Responsable Registro

5.1. Reconstitucióón y propagación de los
microorganismos ATCC tipo KWIK-STIK de

Microbiologics.

5.1.1. Verificar el nivel de bioseguridad de los

microorganismos para tomar las medidas de
seguridad a seguir. Ver Cartila C-CC-032.

5.1.2. Abrir el sobre y retirar el envase.

5.1.3. Presionar justo debajo del menisco del fluido

contenido en la ampolla que se encuentra en la
tapa para liberar el fluido hidratante.

5.1.4. Colocar verticalmente para facilitar el

flujo del
fluido a través de las paredes hasta
llegar al
contenido del pellet.

5.1.5. Romper el pellet y mezclar con el fluido por

presión.

5.1.6. Inmediatamente saturar el hisopo con a

suspensión.
Analistas/Técnicos
5.1.7. Rotular minimo 5 placas con el nombre del R-CC-136
de Microbiologia
microorganismo, ATCC, lote, fecha de
reconstitución y fecha de expira de la
reconstitución.

5.1.8. Inocular por rodamiento del hisopo sobre la

superficie del agar digerido de Caseina y soja para
las bacterias y sobre agar Sabouraud para
hongos
y levaduras u otros medios según literatura del

microorganismo.
5.1.9. Incubar en el caso de las bacterias de 30°C -

35
C por 24 horas, para las levaduras de 20°C -25 °C
de 2 a 3 días y para los
hongos de 20 °C-25 °C
de 5 a 7 días u otras condiciones
indicación según
del microorganismo.

5.1.10. Para el
Usar
microorganismo realizar a
transferencia (máximo hasta el 5to pasaje) al
 Descripción Responsable RegistroO
medio de cultivo según corresponda al análisis.

5.1.11. Registrar el uso de las cepas ATCC en el

formato Reconstitución y Estandarización de
Microorganismos ATCc (R-CC-136) para cada
microorganismo.

5.2. Reconstitución de
Microorganismos EZ-CFU
5.2.1. El vial con el fluido hidratante y el vial con los
pellets dejarlos temperar de 15°C a 25°C.
5.2.2. Preincubar el fluido hidratante y el buffer fosfato
pH 7,2 de 34°C 38°C
a
aproximadamente 30
minutos.
Analistas/Técnicos
5.2.3. Con de Microbiologia R-CC-342
una pinza estéril, tomar 2 pellets colocarlos
y
en los 2 mL del fiuido de
hidratación.
5.2.4. Inmediatamente
tapar el vial que contiene el resto
de los pellets y guardarlos de 2°C -

8°C
5.2.5. Incubar el material hidratado a 34°C a 38°C por 30
minutos
5.2.6. Después del periodo de incubación agita
Vigorosamente en vortex el material hidratado
hasta Observar una suspensión
homogénea.
5.2.7. Con una pipeta estéril o
micropipeta retirar 1ml de
a
suspensión homogénea y transferir a un
tubo que contiene 9mL de buffer fosfato pH
7,2.
Analistas/Técnicos
5.2.8. Agitar vigorosamente la de Microbiologla R-CC-342
suspensión de trabajo.
5.2.9. 0,1 mL de esta
suspensión contiene menos de 100
ufc
5.2.10. Uilizar la
suspensión de trabajo por un periodo
no mayor de 30 minutos después de la
incubación.
5.2.11. Registrar en el formato Control de
Microorganismos EZ-CFU (R-CC-342).
5.3. Almacenamiento
 Descripción Responsable Registro
SUK en uso guardar
5.3.1. Los microorganismos
KWIK
a una temperatura
de 2°C -

8°C.
en refrigeración
por un mes.

StTik en stock guardar

Analistas/Técnico
Kwik -

5.3.2. Los microorganismos

de Microbiologia
a una temperatura de 2°C 8°C. -

en refrigeración

microorganismos EZ-UFC en stock guardar en

5.3.3. Los
refrigeración a una temperatura de 2°C- 8°C

5.4. Preparación del Microorganismo para la

Estandarización

5.4.1. Rotular las

placas con el nombre del
microorganismo, N° de ATCC, lote y fecha.

5.4.2. Estriar las bacterias sobre la

superficie de 1 placa
del medio TSA y las levaduras sobre la
superficie
de 1 placa del medio AS contenido en
placas Petri.

5.4.3. Llevar las placas que contienen a las bacterias a

incubar por 24 horas 30°C
35°C, y las que
a

contienen a los hongos y levaduras a 20°C 25°C

de 48 horas a 7 dias.

5.4.4. Para obtener esporas de Bacillus subtilis, estriar el

microorganismo sobre la superficie de 6 placas de
agar TSA e incubar por 7 dias a 30°C 35°C. Analistas/Técnicos
de Microbiologia
5.4.5. Para Aspergillus brasiliensis, estriar el
microorganismo sobre la superficie de 6 placas de
agar Sabouraud e incubar por 5 a 7 dias a 20°rc
25°C.

5.4.6. Transcurrido el tiempo de incubación retirar las

placas de la incubadora.

5.4.7. Recolectar el crecimiento de la

superficie del agar
agregando aproximadamente 3 mL de cloruro de
sodio al 0,9% o Solución
amortiguadora fosfato pH
7.2 a cada placa, girar suavemente para que el
crecimiento del microorganismo se suspenda.
|5.4.8. Verter cuidadosamente en frascos rotulados con
el nombre del microorganismo, ATCC, lote y fecha Analistas/Técnicos
de la recolección, 50 mL
que contengan de de Microbiologia
 Descripción Responsable Registro
solución estéril de cloruro de sodio al 0,9% o
solución amortiguadora fosfato pH 7,2.

5.4.9. Para Aspergilus brasiliensis usar solución de

cloruro de sodio estéril al 0,99 % o Solución
amortiguadora fosfato pH 7.2 conteniendo 0,05 %
de Polisorbato.

5.4.10. Para Bacillus subtilis usar cloruro de sodio al

0,9% esteril, luego la suspensión de esporas
calentar a 70 °C por 30 minutos.

5.4.11. La suspensión de la cepa obtenida constituye la

solución stock del microorganismo.

5.5. Estandarización de Suspensióón de

Microorganismos
5.5.1. Generar el código correspondiente para cada
microorganismo considerando sus iniciales (ver
anexo 1), seguido del mes y dia de la
estandarización.

|5.5.2. Tomar 1 mL de la solución stock transferira un

tubo de ensayo que contiene 9 mL de cloruro de
sodio 0,99% o Solución amortiguadora fosfato
pH 7.2 (dilución 1 ó 10-1). También se puede diluir
tomando otros volúmenes, pero mantener la
relación 1:10.

5.5.3. Tomar 0,1 mL de la dilución 1y añador a un tubo

Analistas/Técnicos R-CC-136
de ensayo que contiene 9.9 mL de cloruro de
de Microbiologia
sodio 0,9% o Solución amortiguadora fosfato pH
7.2 (dilución 26 103)
5.5.4. Realizar el mismo procedimiento dos veces más
para obtener una dilución 4 (10-7)

5.5.5. Realizar el mismo procedimiento tantas veces

sean necesarias, de tal manera que se pueda
realizar el conteo de las UFC por placa.
5.5.6. Realizar este procedimiento con cada cepa
teniendo cuidado de rotular los tubos a utlizar, con
el código del microorganismo y la dilución.
 Descripción Responsable Registro
5.7. Tomar 1mL de la dilución 4 u otra dilucióón y

colocarla en dos placas petri rotulado con el

nombre del microorganismo, dilución y fecha,

efectuar el mismo procedimiento para cada cepa.

5.5.8. Agregar a cada placa aproximadamente 15 mlL de

agar TSA licuado y mantenido aproximadamente a
45 °C para el caso de bacterias, homogenizar con
movimientos rotatoriose incubarlas placas por 72
horas a 30°C - 35°C.

5.5.9. Para las placas que contienen hongos y levaduras

añadir aproximadamente 15 mL agar Sabouraude
incubar por 5 a7 dias a 20 °C 25 °C.

5.5.10. Cumplido el tiempo de incubación realizar la

lectura de la placa y anotar el resultado en el
formato Estandarización de Suspensión de
Analistas/Técnicos R-CC-136
Microorganismos
de Microbiologia
5.5.11. Hallar el número de UFC en la solución stock
multiplicando el numero encontrado por la
inversa de la dilución.

5.5.12. Registrar en el formato Reconstitución y

Estandarización de Microorganismos ATCC (R-
CC-136)
5.6. Los inóculos o suspensión stock de cada
microorganismo se pueden guardar en refrigeración
de 2 °C a 8 °C por un periodo determinado
dependiendo del tipo de análisis en el cual serán
empleados. Analistas/Técnicos
de Microbiologia
5.7. Las suspensiones estables de esporas de
Aspergillus brasiliensis Bacillus subtilis se pueden
guardar por un periodo máximo de 6 meses de 2 °C
a 8 °C y serán estandarizados mensualmente.

6. REGISTROS

Codigo Nombre Responsable del Control

R-CC-136 Reconstitución y Estandarización de Microorganismos Supervisor de

 ATCC
Control de Microorganismos EZ-CFU
Microbiología
R-CC-342
Supervisor de
Microbiologia
7. ANEXo

Anexo 1: Lista de
Microorganismos y sus abreviaturas.
8. HISTORIAL DEL DOCUMENTO

Se incluye en el punto 3. Referencia lInstrucciones

para uso EZ-CFU
Se elimina el
en
punto 4.1 la frase cerca al mechero y el párrafo antes de salir y posterior
Descontaminación, se incluye alcohol al 70% según rotación
Eliminación en el punto 4.3 del ítem agua.
S e modifica en el
punto 5.1.11 el nombre y código del formato para la Reconstitución y
Estandarización de microorganismos.
Se incluyen los
en
puntos 5.2.11 y 5.5.12 los formatos Control
de
Control de Cepas ATCC
Microorganismos EZ-CFU y

Se incluyen en los puntos 5.4.4y 5.4.5, la cantidad de placas a estriar por cada Microorganismo
S e modifica en el punto 5.4.11 y 5.5.2 la palabra inóculo por solución stock del
microorganismo.
Se modifica en el punto 5.5 Estandarización del inóculo por Estandarización de
Suspensión de
Microorganismos.
Se modifica en el punto 5.5.1, la manera de generar el codigo para cada microorganismo y se

incluye anexo

En el Item 6. Registros, se elimina el formato R-CC-157 Control de Cepas ATCC y se modifica el

nombre del formato R-CC-136

Anexo 1: Lista de Microorganismos y sus abreviaturas

MICROORGANISMO ABREVIATURA
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Ps

Staphylococcus aureus ATCC 6538 St

Escherichia coli ATCC 8739 Ec
Salmonella entérica ATCC 14028 Salm

Bacillus spiz/zenii ATCC 6633 Bac

 MICROORGANISMO ABREVIATURA
Candida albicas ATCC 10231 Cand

Aspergillus brasiliensis ATCC Ab