GRUPO: 2FB3A EVALUACIÓN: 1 CURSO: 2022-2023

RETO 4 MÓDULOS: KTB/KRC/KCC FECHA: 05/12/2022

NOMBRE Y APELLIDOS: Nathaly Oporta M

CULTIVO MICROBIOLÓGICO
Respuestas y cuestionario

Tiempo Densidad Celulas x Peso seco (mg/mL)

Muestra (min) Óptica (DO) mililitro
Epp. vacio Epp. lleno Epp. lleno
(cel/mL)
(humedo) (seco)

1 0 1,471 2,21E+07 0,994 0,996 0,994

2 30 0,287 4,31E+06 0,992 1,005 0,9931

3 60 0,817 1,22E+07 1,043 1,072 1,0444

4 90 0,367 5,51E+06 0,994 1,009 0,9962

5 120 0,373 5,60E+06 1,027 1,034 1,0294

R/ El registro de los datos para la curva de crecimiento se han introducido en la siguiente hoja de
cálculo.
 Una vez realizado el registro de resultados y con la ayuda del protocolo de la curva de crecimiento de
levaduras que se adjunta en Classroom, contestar las siguientes preguntas:

1. Analiza la siguiente figura y explica qué vemos, los nombres de cada fase y qué pasa en cada
una de ellas. (KTB)

R/ La figura corresponde a una gráfica de curva de crecimiento de células utilizando los valores
medidos de densidad óptica en función del tiempo. Se distinguen tres diferentes fases:

● Fase de adaptación: las células, sin dividirse, se habitúan a las condiciones del medio.
● Fase de crecimiento exponencial: las células se duplican exponencialmente.
● Fase estacionaria: estancamiento del crecimiento de las bacterias debido a un agotamiento
de los nutrientes del medio o la acumulación de desechos.

2. ¿En qué fase tomarías la muestra para preparar el tren de inoculación? Razona la respuesta.
(KTB)

R/ Para preparar el tren de inoculación tomaría el inóculo de la fase de crecimiento exponencial

porque la velocidad de duplicación de las células es el máximo, lo que disminuye el tiempo de
adaptación al nuevo medio y el inóculo está exento de desechos producidos por los microorganismos
como sucede en la fase estacionaria.
3. ¿En qué fase obtendrías metabolitos secundarios (que pueden causar problemas en el
crecimiento)? Razona la respuesta. (KTB)

R/ Los metabolitos secundarios se obtienen en la fase estacionaria debido al desarrollo de un

metabolismo diferente de las células a comparación del de la fase exponencial por la ausencia de
nutrientes del medio, lo cual ralentiza el crecimiento celular.

4. Representa gráficamente (KRC):

1) Absorbancia VS tiempo.
2) Biomasa húmeda y seca VS tiempo.

R/ Las gráficas se han elaborado en esta hoja de cálculo.

3) ¿Hay algún tipo de relación entre los dos gráficos?

R/ La medición de la absorbancia y la determinación de peso húmedo/seco de la biomasa

son métodos utilizados para medir la masa celular y aumentan en función del tiempo.

5. Calcular en la fase logarítmica de nuestro cultivo los siguientes parámetros (KCC):

a. Población final de células de nuestro cultivo (N).

b. Tasa de crecimiento de la levadura (μ).
c. El nacimiento de la levadura o el tiempo de doblaje(g).

R/ Los cálculos de los parámetros se han elaborado en esta hoja de cálculo.

6. Comparar los gráficos obtenidos por tu grupo con los obtenidos por el resto de grupos
(KRC/KCC).

a) ¿Cómo influye la temperatura en el crecimiento de la levadura?

 R/ Influye adversamente en la morfología general de la célula dependiendo de la temperatura
a la que es expuesta y, por tanto, en el crecimiento celular.
La levadura utilizada, Saccharomyce, crece de forma óptima en temperaturas de 22ºC y 37ºC
y su crecimiento se detiene a 41ºC. En caso de que la temperatura sea inferior a 22ºC, esto
provocaría un crecimiento celular más lento.

b) ¿Qué valor le asignarías para el control óptimo de los procesos?

R/ Temperatura ambiente (22ºC aprox.)

NOTA: Los gráficos obtenidos tanto de mi equipo como los de otros grupos no son adecuadas para
un análisis comparativo, ya que el tiempo y temperatura (durante la incubación y toma de muestras
para la medición de la densidad óptica) no fueron debidamente controlados; los gráficos no presentan
un crecimiento lineal ni exponencial, únicamente puntos dispersos. Por tanto, las respuestas a la
pregunta 6 se han contestado buscando información por internet respecto al tipo de levadura que
hemos inoculado y su comportamiento a diferentes temperaturas.

7. Teniendo en cuenta la cantidad de levadura añadida en el inóculo y la biomasa final (levadura

húmeda), calcular el rendimiento del proceso. (KCC)

R/ A pesar de que el pre inóculo fue preparado con 5 g de levadura húmeda, el profesorado añadió
unos gramos adicionales al día siguiente y se desconoce la cantidad exacta. Además, se ha pesado
la biomasa de las muestras tomadas cada media hora durante dos horas, no la biomasa final
obtenida.

8. Teniendo en cuenta los resultados, ¿qué harías para mejorar el experimento de la curva? ¿y el
beneficio? (KRC)

R/ 1. Mejoras en el experimento:
● Preparación del preinóculo en días previos para un crecimiento celular apropiado.
● Diseño, configuración y montaje de un arduino para la monitorización del pH y de la
temperatura. Incluso, diseñar un sistema de lazo cerrado para controlar ambos parámetros.
● Incremento de tiempo de seguimiento y toma de muestras.

2. Mejoras para obtener mayor beneficio:

● Obtención de levadura seca sin aditivos para preparación del preinóculo.
 ● Diseño de un tren de inoculación.

9. ¿Para qué se realiza la investigación de la fase de crecimiento? ¿Qué datos se quieren

obtener? ¿Para qué se trabaja en la fase de investigación? ¿Qué datos se quieren obtener?
(KTB/KRC)

R/ 1. La investigación de la fase de crecimiento tiene diferentes propósitos:

1. Obtener una curva de crecimiento, la cual permite realizar un seguimiento de sus cuatro
fases.
2. Controlar la producción de metabolitos primarios y secundarios.
1. Determinar el tiempo idóneo para toma de inóculos permitiendo continuar con el tren de
inoculación.
2. Conocer el rendimiento de la biomasa previo a un escalado del proceso.

2. El trabajo en la fase de investigación se lleva a cabo para:

1. Conocer las variables a controlar (pH, tipo de agitación…) y su influencia en el crecimiento
celular.
1. Determinar los puntos de consigna óptimos para cada parámetro y los componentes
necesarios para diseñar un sistema de control del proceso.

10. Estudiando el crecimiento, en fase estacionaria, ¿qué parámetros de interés podemos

determinar? (KRC)

R/ Durante la fase estacionaria, hay un cambio en el metabolismo de las levaduras, lo que conlleva a
la fermentación. Algunos parámetros de interés a determinar son: concentración de sustrato y etanol,
oxígeno, pH, temperatura y espuma.

11. ¿Qué parámetros físicos -químicos deben tenerse en cuenta para garantizar un buen
crecimiento? ¿y cuáles son los puntos de consigna de estos parámetros a la vista de los
resultados que habéis obtenido en vuestra práctica? (KRC)

R/ Parámetros y puntos de consigna:

● pH: 7
● Temperatura de incubación: 22°C (aunque mi grupo ha realizado la práctica a una
temperatura de 30°C).

12. Si tuvieras un reactor, ¿qué controles pondrías? Indicar parámetros, tipo de control, tipo de
bucle y sensores. (KRC)

Parámetro Tipo de control Tipo de lazo Ejemplo de sensores

Temperatura Control básico Lazo cerrado Termopares y termómetros

Agitación NA Lazo abierto Tacómetro

CO2 Control en paralelo Lazo cerrado Electrodo

pH Control básico Lazo cerrado Electrodo de referencia de vidrio

 combinado

Espuma Control básico Lazo cerrado Sondas metálicas

Volumen NA Lazo abierto Sensor de nivel

Presión Control en paralelo Lazo cerrado Manómetros

DO2 Control en paralelo Lazo abierto Electrodo polarográfico

*NA: No Aplica

13. Actualmente, el crecimiento de la levadura en los biorreactores se realiza mediante tres

métodos diferentes. En el artículo que se adjunta en el siguiente enlace, buscar las respuestas
a las siguientes preguntas (KRC/KCC):

a. ¿Qué tres métodos de crecimiento se utilizan actualmente?

R/ Método continuo (de perfusión), semicontinuo (fed-batch) y discontinuo.

b. ¿Cuál de estos métodos de crecimiento ha dado los mejores resultados? Describir

brevemente los fundamentos de este método.

R/ El método que ha dado mejores resultados es el continuo donde las células se

mantienen dentro del biorreactor quimiostato y se descarga el medio gastado con
biomasa, introduciendo una cantidad medio de cultivo fresco equivalente.

c. Describir uno de los controles de calidad mencionados en el artículo.

R/ Determinación de viabilidad de células mediante azul de tripano: el colorante tiñe

las células no viables (células muertas) de color azul, permitiendo su diferenciación a
comparación con las células vivas que aparecen sin teñir o con un halo azul.

14. Los parámetros, temperatura y tipo de agitación que hemos tenido en cuenta en el
procedimiento de crecimiento de la levadura. Aprovechando el conocimiento adquirido en
Tinkercad en el reto anterior: (KRC)

a. Diseña el montaje que utilizarías para medir la temperatura, la agitación (utilizar un

motor) y la concentración de CO2.

R/ El montaje del arduino se ha elaborado en el siguiente enlace.

Búsqueda de información:
https://www.pall.com/ar/es/biotech/blog/bioreactor-process-parameters.html