Vacunas, adyuvantes e

inmunoterápicos

Dr. Emilio L. Malchiodi

Profesor Titular de Inmunología, FFyB, UBA
Investigador Principal CONICET
emalchio@ffyb.uba.ar
 Nuevos desarrollos para VACUNAS

ANTIGENOS
VACUNAS DE
SINTETICOS
NUEVOS ADN VECTORES VIVOS
ADYUVANTES
Proteínas o Plásmidos con Virus o bacterias
ODN CpG péptidos ADN
microbianos recombinantes
MALP-2 que codifica un codificando el Ag
sintetizados en Ag
el proteico
laboratorio.
 ADYUVANTES
• Compuestos con capacidad de aumentar y/o modular la inmunogenicidad de un
antígeno.
• Grupo heterogéneo de compuestos.
• Se puede combinar distintos tipos de adyuvantes en una vacuna.

Ventajas

• menor concentración de antígenos vacunales por dosis

• menor número de refuerzos
• mayor porcentaje de seroconversión
• Potencian la eficacia de la vacunación en poblaciones inmunocomprometidas
• Permiten seleccionar sesgo de la Resp. Inmune Adaptativa hacia respuestas del tipo
Th1, Th2, Th17 o T citotóxicos.
ADYUVANTES

Modo de acción:
Carrier /Depósito

Inmunoestimulante

Algunos compuestos pueden poseer mas de una característica.

 La respuesta inmune innata (II) modula la magnitud y la calidad de la
respuesta adaptativa (IA).

Los adyuvantes pueden actuar en alguno de los siguientes pasos:

Adyuvantes A
• Señal O: Activación de APC
Adyuvantes B
• Señal 1: Presentación del Ag a LT
Adyuvantes C
• Señal 2: Coestimulación
 ADYUVANTES: FORMULACIONES
SALES DE ALUMINIO: (hidróxidos y fosfatos)

 Son los más usados en vacunas humanas; únicos aprobados en USA

 Inducen respuesta humoral (Th2)

 Mecanismo de acción poco conocido

(Adsorción del Ag transformándolo en un Ag particulado, favoreciendo su captación
por APC. Pero se observó que el Ag se desune rápidamente de la sal al ser
inoculado)

 Acción de depósito, estimulación de macrófagos y activación de LB

 Genera granuloma en el sitio de inoculación

 Puede ocasionar alergia por producción de IgE.

EMULSIONES:

• Generan un depósito y mayor producción de anticuerpos.

• Luego de las sales de aluminio, son las más usadas.
• w/o: Agua en aceite (manteca)
• Adyuvante incompleto de Freund: Solución emulsificada en aceite mineral con
surfactante monooleato.
• Adyuvante completo de Freund: Contiene lisado de Micobacteruim tuberculosis.

• o/w : Aceite en agua (leche y crema)

• MF59: Aceite de escualeno, Tween 80 y Span 85 como surfactante. Es componente
de la vacuna de influenza en Europa.
SAPONINAS

 Son derivados de la corteza de un árbol (Quillaja saponaria).

 Son glucósidos de esteroides o triterpenoides que presentan características
similares al jabón.
 Son muy tóxicas para el uso en humanos (generan granulomas y algunos
efectos sistémicos como hemólisis).
 Ej: QS-21 activa respuesta Th1 y Th2.

ISCOM

 Son partículas formadas por fosfolípidos, colesterol y saponinas (expontaneas

de 40 nm al mezclarlas en una determinada proporcion), al cual se une el Ag
por mezcla luego. La saponinas pierden su actividad hemolítica.
 Generan respuesta humoral y celular mixta (Th1 y Th2).
LIPOSOMAS Y MICROPARTICULAS

• Liposomas son esferas sintéticas compuestas por una bicapa lipídica que
pueden encapsular Ags o pueden llevarlo unido a su superficie, por adsorción o
por unión covalente.
• Actúan como carrier de Ag y al transformarlos en particulados pueden facilitar
su captación por las APC.
• Pueden incorporar otras moléculas: inmunoestimulantes.
• NANO-BEADS: son partículas con tamaño definido (40 nm).
• Son eficientes sistemas de delivery de Ag a las APC, generando una potente
respuesta celular y humoral.
 Oligodeoxinucleótidos CpG (ODN-CpG)
1984 y 1991 NK y LB son activados por DNA bacteriano pero no de vertebrados

Bacterias
1 CpG cada 16 (frecuencia esperada)
Generalmente no metilados
Flanqueados por secuencias
inmunoestimulatorias
Vertebrados
1 CpG cada 64 dinucleótidos
Generalmente metilados
Flanqueados por secuencias
inmunoneutralizantes

Ratón Humano

GACGTT GTCGTT
Avances en el desarrollo de vacunas contra
la enfermedad de Chagas
Los tripanosomas son protozoarios, flagelados en
algún estadio de su ciclo biológico, que son
transmitidos al hombre por artrópodos
 Transmisión vectorial de Trypanosoma cruzi

Que condición debe reunir un insecto para transmitir la enfermedad al hombre?

- Hematófagos
- Receptivos a la infección x T. cruzi
- Defecan durante alimentación
- Hábitos domiciliarios o peridomiciarios
- Antropófilos
- Alto nivel poblacional

Hábitats domiciliarios de reduvideos

Triatoma infestans Rhodnius prolixus

Panstrongylus megistus
Cruzipain: 467 residues

Signal peptide Prodomain Amino Terminal domain Carboxi Terminal domain

NH2
COOH

18 104 105 130 aa

Procruzipain
449 residuos

Mature Cruzipain
345 residues
Cz exhibits a number of attractive properties as a candidate antigen for vaccine

development:

i- it is highly immunogenic in natural infection;

ii- it is present in the three main developmental stages of the parasite in all

tested strains;

iii- it is a secreted antigen and its ability to cleave immunoglobulins has been

proposed as an immunoescape mechanism;

iv- it plays an important role in the process of parasite internalization within

mammalian cells.

However, all our attempts to confer protection against a lethal infection were
desapointing since Cz immunized mice, adjuvantized with complete Freund
adjuvant,have more parasitemia and died first than control group.
 CpG-ODN ROI
NFκB activation
MAPK induction
NO induction

DC
NK
MØ Innate immune
IFN-γ response
IFN-α/β
TNF-α
Litic activity LB IL-6
ADCC
LT IL-12
Th1 response
IL-18
Specific Ac
Citotoxic T-cells
ODN-CpG 1826 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3'
ODN-non CpG 1745 5'-TCCATGAGCTTCCTGAGCCT-3'
 “Use of a purified Trypanosoma cruzi antigen and CpG oligodeoxynucleotides for
immunoprotection against a lethal challenge with trypomastigotes”.
✓PBS
Frank FM, Petray PB, Cazorla SI, Munoz MC, Corral RS, Malchiodi EL.
✓Cz + Alumn Vaccine 22(1):77-86, 2003.
✓Cz + CpG-ODN
✓Cz + non CpG-ODN
Humoral and cellular immune
✓CpG-ODN response after immunization
before challenge

intramuscle
2 Dosis

Challenge with RA strain

Trypomastigotes
2 months old C3H
✓ Parasitemia
✓Immune response after
challenge
✓ muscle damage
 40
PBS
Parasites/ml blood (x10 )
6

Al(OH)3+Ag163B6
30
1826+Ag163B6
1745+Ag163B6
20

10

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Days post-infection
This figure is representative of 2 independent experiments.
 100

80
Survival (%)

PBS
60 Al(OH)3+Ag163B6
1826+Ag163B6
40
1745+Ag163B6
20

0
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Days post infection

This figure is representative of 2 independent experiments

Conclusions

✓Antibody response is mainly IgG2a when Cz is administered with CpG-ODN, and IgG1 with
Al(OH)3, suggesting a bias towards Th1 and Th2, respectively.

✓CpG-ODN as adjuvant triggers:

• a Th1-dominated response to the Cz, with high levels of IFN-γ.

• a strong cellular proliferation, with high levels of IL 2, when stimulated with Ag.

✓Administration of Cz with ODN-CpG as adjuvant, gives protection to T. cruzi infection in

this model, as seen by higher survival rates and lower parasitemia comparing with
control groups: immunized with Ag+Al(OH)3, Ag+ODN no CpG, ODN-CpG without Ag, or
PBS.
 Purified natural Ags are usually expensive and hard to obtain

Cruzipain: 467 residues

Signal peptide Prodomain Amino Terminal domain Carboxi Terminal domain

NH2
COOH

18 104 105 130 aa

Procruzipain
449 residuos

Mature Cruzipain
345 residues

DNA coding for mature cruzipain was cloned in a plasmid for bacterial expression
macrophage-activating lipopeptide
from Mycoplasma fermentans (MALP-2)
Conclusions
• Vaccination triggered strong systemic and mucosal antibody responses, and a
vigorous cell-mediated immunity characterized by lymphoproliferation, DTH
reactivity and IFN- production.

• The immune responses protected against a lethal trypomastigote challenge and,

upon sub-lethal infection, immunized mice showed reduction of tissue damage
and normal enzymatic markers of muscle injury.

• This prime-boost regimen appears promising for further development, since

warranted survival, provided efficient control of parasite load and restricted
inflammatory myopathy.

“Prime-boost immunization with cruzipain co-administered with MALP-2 triggers a

protective immune response able to decrease parasite burden and tissue injury in an
experimental T. cruzi infection model”. Cazorla SI, Frank FM, Becker PD, Corral RS, Guzmán CA,
Malchiodi EL. Vaccine 26:1999-2009, 2008.
“Oral vaccination with Salmonella as cruzipain-DNA delivery system confers

protective immunity against Trypanosoma cruzi”.

Cazorla SI, Becker P, Frank FM, Ebensen T, Sartori M, Corral R, Malchiodi EL,

Guzman CA.

Infection and Immunity 76(1):324-33, 2008.

Several vaccination studies have been conducted; however, all vaccination

regimens tested so far conferred at best partial protective immunity.

Despite the strong immune response elicited by vaccination, the parasite

survival suggests that, similarly to what happens in natural infection, the

immune response is either insufficient or inherently inadequate.

Consequently, a better understanding of the parasite escape mechanisms and

of the immune reaction is needed to design more efficient vaccines.

Cruzipain: 467 residues
Signal peptide Prodomain Amino Terminal domain Carboxi Terminal domain

NH2
COOH
18 104 105 130 aa

Procruzipain
449 residuos

Mature Cruzipain
345 residues

Figure 1. Full-length rCz and its domains

FIGURE 9. Parasitemia during T. cruzi infection of immunized mice. Animals were
challenged 15 days after the last immunization with 50 trypomastigotes RA strain by
intraperitoneal route. Parasitemia was determined by counting in a Neubauer chamber the
number of trypomastigotes in 5 μl of fresh blood collected from the tail vein every 2-3 days.
(A) Parasitemia during the acute phase of the infection (B) Number of parasites at the peak of
parasitemia (10 dpi).
 Conclusion
➢ We demonstrated that the presence of the C-terminal domain allows Cz to
circumvent the immune response to the catalytic N-terminal domain.

➢ This phenomenon is not a property of the parasite but of the molecule itself, since
inoculation of the full-length rCz is able to produce a similar effect to the specific
response against native Cz in natural or experimental infection.

➢ Once the C-terminal domain is not present, the immune system is able to mount a
stronger and more efficient response that confers improved protection by greatly
reducing the parasite load after challenge and diminishing tissue damage.

Cruzipain, the major cystein protease of Trypanosoma cruzi, drives the host immune response against the non-catalytic
domain, thereby preserving the enzymatic domain
Cazorla SI, Frank FM, Becker PD, Arnaiz M, Mirkin GA, Corral RS, Guzmán CA, Malchiodi EL. J Infect Dis 2010.
.
 Engineered trivalent immunogen adjuvanted with a
STING agonist confers protection against
Trypanosoma cruzi infection

Andrés Sanchez Alberti, Augusto E. Bivona, Natacha Cerny, Kai Schulze, Sebastian Weißmann, Thomas Ebensen, Celina Morales, Angel
M. Padilla, Silvia I. Cazorla, Rick L. Tarleton, Carlos A. Guzmán, Emilio L. Malchiodi
NaturePJ-Vaccines, doi: 10.1038/s41541-017-0010-z, 2017.
 Footpad challenge of the indicated groups with
trypomastigotes of the CL-tdTomato strain.
Mean fluorescence intensity of feet determined
by in-vivo imaging, between 1 and 10 dpi (d).
Representative images from 4 and 9 dpi
showing the control of parasite replication at
the site of infection in vaccinated animals (e).
Area under the curve of fluorescence per site
of infection (n=12) (f). Footpad swelling at 6 dpi
(g). Footpad diameter was measured using a
caliper. Data shows the mean difference
between day 0 and 6 per mouse. **P<0.01,
***p<0.001, Mann-Whitney test.

We engineered Traspain, a chimeric antigen tailored to present a multivalent display of domains from key parasitic
molecules, combined with stimulation of the STING pathway by c-di-AMP as a novel prophylactic strategy.

This formulation proved to be effective for the priming of functional humoral responses and pathogen-specific CD8+ and
CD4+ T cells, compatible with a Th1/Th17 bias.

Interestingly, vaccine effectiveness assessed across the course of infection, showed a reduction in parasite load and
chronic inflammation in different proof of concept assays.
C D
 Isotypes and specificity of the antibodies generated after challenge.
Cz 70-100dpi Freund Cz 70-100 dpi

The production of specific IgG2a antibodies against other antigens than Cruzipain, confirms
that the induced Th1 bias of the immune response remains after infection.

This open an important question: whether a strong bias (Th1 or Th2) in vaccination could
induce a non-wanted immune response for another infection.
Frente a las enfermedades que genera la miseria, frente a la tristeza,
la angustia y el infortunio social de los pueblos, los microbios como
causa de las enfermedades, son unas pobres causas.
Dr. Ramón Carrillo
 Usos potenciales de CpG- ODN

Actividad Inmunoterapia
Inmunoprotectora de cáncer

Tratamiento Adyuvantes
de alergias en vacunas
Actividad inmunoprotectora
La respuesta innata inducida por CpG mejora la resistencia del
individuo a la infección por varios microorganismos patogénicos.

• CpG DNA induce las células dendríticas a secretar IFNs.

• Las células B son estimuladas a secretar Ig polireactivas.

• Los macrófagos y células NK son indirectamente activados por

IFNs.

Prevención y tratamiento de alergias

• CpG DNA estimula la producción de citoquinas tipo Th1 que
inducen el cambio de isotipo hacia IgG2a en vez de IgE e IgG1.

• CpG DNA directamente acoplado al alergeno produce una

respuesta dominante Th1 que reduce la producción de citoquinas
tipo Th2 e IgE.
 Adyuvantes de vacunas

CpG DNA induce:

• la producción de citoquinas de
tipo Th1 y pro inflamatorias.
• la maduración/activación de APC
profesionales.

Efectos adyuvantes:
• Aumento de las funciones de APCs.
• Inducción de un microambiente de
citoquinas/quemoquinas adecuado para
la inmunidad antígeno específica.
• Mejoramiento en la absorción de
antígeno mediada por receptores de
unión a DNA en las APC.
 Potenciales riesgos del uso de oligonucleótidos CpG

Autoinmunidad sistémica
• Activación policlonal de células B.
• Producción aumentada de auto-Acs.
• Reducción en la muerte apoptótica de
linfocitos estimulados.
• Producción de citoquinas pro-inflam.

Autoinmunidad órgano específica

• Superproducción de citoquinas tipo Th1.
• Disponibilidad de autoantígenos

Shock Tóxico
• Producción de TNF
• Producción de IFN-
 ADYUVANTES EN VACUNAS LICENCIADAS:

• Muy limitado, en USA

solamente se encuentran
aprobadas las sales de
aluminio.

• En Europa además se
utiliza:
MPL: (agonista TLR4)
en vacunas contra hepatitis
B (Fendrix), HPV (Cervavix),
herpes genital y malaria.

MF59 :(emulsión o/w)

en vacuna anti influenza
(Fluad).
 VACUNAS COMBINADAS
• Objetivo:
Reducir el número de intervenciones en niños menores de 5 años que actualmente reciben un
promedio de 20 inyecciones para completar el calendario de vacunación.

¿Qué es una VACUNA COMBINADA?

• Preparaciones de vacunas independientes que son combinadas durante la
inmunización.

• Vacunas conjugadas contra diferentes patógenos: construcciones multiantígeno

desarrolladas usando un carrier común.

Estrategias tradicionales para la producción de VACUNAS COMBINADAS

• Atenuación de agentes infecciosos

• Inactivación química o física de virus, bacterias y toxinas bacterianas

• Síntesis y purificación de antígenos

Potenciales enfoques para la producción de vacunas combinadas
Sistemas bacterianos

• Bacterias atenuadas que expresan genes de múltiples proteínas para

distintas enfermedades (Salmonella, Mycobacterium bovis).
• Fantasmas bacterianos recombinantes: Pueden expresarse múltiples genes
de manera controlada.

Vectores virales y DNA

• DNA desnudo: Los genes se expresan en costrucciones policistrónicas;

unidos a ligandos de APC; o fusionados a genes de citoquinas específicas.
• Vectores virales (Vaccinia, Adenovirus)

Vacunas celulares

• Ex vivo antigen pulsed dendritic cells

• Células dendriticas modificadas para presentar antígenos in vivo

Antígenos fusionados a receptor Fc