Nivel Superior

Tecnicatura Superior en Laboratorios Químicos y Biológicos

CÁTEDRA DE BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR

APUNTE Nº

2 METODOS Y TECNICAS DE ESTUDIO DE LA BIOLOGÍA

CELULAR Y MOLECULAR.

TEMATICAS A TRATAR:

1.1. Métodos de estudio de la biología celular y molecular

1.2. Unidades de longitud
1.3. Instrumentos Ópticos
a) Microscopio estereoscópico o lupa
b) Microscopio
2. Aspectos generales del microscopio compuesto
3. Microscopios ópticos especiales
4. Técnicas

1.1. METODOS DE ESTUDIO DE LA BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

Los conocimientos son importantes, pues permiten realizar diversas

actividades. Se les clasifica de varias maneras.

a) Conocimiento subjetivo y objetivo

b) Conocimiento empírico

c) Método científico

La biología utiliza como método de estudio el método científico.

Para conocer causas y efectos de fenómenos naturales y alcanzar un

conocimiento que pueda ser considerado como parte de una ciencia, es
necesario aplicar un método.

Los métodos de trabajo propios de la biología son, en general, los mismos que
se utilizan en cualquier otra disciplina científica. Uno de los pasos que ocupa un
lugar preponderante en la investigación es la experimentación.

Los pasos que se siguen en una investigación científica se conocen en

conjunto como método científico y son:

Observación. Consiste en fijar la atención en un objeto o fenómeno, usando

todos los sentidos o aparatos para observar mejor.
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La meta del científico es investigar la realidad, encontrar qué

sucede en la naturaleza y por qué sucede; para ello reúne datos
constantemente en los cuales basa sus reflexiones y suposiciones hacia la
búsqueda de las causas de un problema específico.

Para que una observación sea válida, debe ser completa, es decir, se deben
tomar en cuenta todas las variables que puedan influir en la resolución del
problema. También la observación debe ser exacta (medirse) y metódica
(seguir un orden).

Planteamiento del problema. Se hacen uno o varios cuestionamientos

referentes al hecho observado.

Hipótesis. Se da una posible explicación al problema que se pretende resolver.

Para plantear una hipótesis, el investigador necesita consultar la bibliografía
existente, es decir, acumular datos sobre el asunto mediante información previa
sobre el tema.

La hipótesis es una solución tentativa al problema que puede constar de una o

varias suposiciones y, aunque sea aceptada, puede estar sujeta a
modificaciones.

Una hipótesis debe cumplir ciertas características, como dar una explicación a
todos los hechos conocidos y servir para la predicción de acontecimientos que
hayan sucedido o deberían suceder.

Experimentación. Se repite el hecho observado con variables controladas, a fin

de probar la hipótesis. Esta experimentación consiste en nuevas observaciones
del fenómeno reproducido, generalmente en un laboratorio bajo condiciones
especiales.

Si la hipótesis no puede comprobarse por medio de la experimentación,

entonces deberá cambiarse y formularse una nueva explicación de hechos;
esto es, se elaborará una nueva hipótesis que se someterá a experimentación.

Se pueden formular muchas hipótesis hasta encontrar alguna que sea

comprobada por experimentación para, posteriormente, formular una teoría.

La experimentación debe estar cuidadosamente planeada, para evitar una

práctica de ensayo y error; por ejemplo: los antiguos alquimistas fueron
experimentadores cuyos trabajos no seguían ningún método, ellos trataban de
encontrar la fórmula para producir oro a partir de materiales comunes. Sus
experimentos consistían en hacer combinaciones de sustancias al azar. Si no
obtenían el resultado deseado probaban otra mezcla y así sucesivamente. A
este procedimiento se le conoce con el nombre de ensayo y error, en él no hay
hipótesis formal.

Teoría. Cuando una hipótesis es confirmada como resultado de la investigación

experimental, se formula una teoría.
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Ley científica. Una teoría adquiere jerarquía de ley cuando se confirma cada
vez que otros científicos investigan sobre el tema.

Las leyes son sometidas a comprobación una y otra vez en diferentes

condiciones hasta que los científicos aceptan que son ciertas y se convierten
leyes en universales; es decir, válidas en todo el mundo. Por ejemplo, la ley de
la gravedad.

Por tanto, el método científico consiste en observar hechos significativos,

sentar hipótesis que expliquen satisfactoriamente los mismos y deducir de las
hipótesis las consecuencias que puedan ser probadas por observación y
experimentación.

El objetivo que persigue una ciencia a través del método científico es

establecer una serie de proposiciones verdaderas, ordenadas de tal modo que
unas sirvan de fundamento a otras ciencias o a otros estudios.

El biólogo prefiere hacer sus observaciones y experimentos en la naturaleza,

pero como esto no siempre es posible, tiene que hacerlo en su laboratorio, un
lugar adecuado con elementos y materiales especiales.

INSTRUMENTOS

El biólogo se ayuda de instrumentos ópticos de precisión para la observación

de estructuras y detalles del material biológico que no pueden ser percibidos a
simple vista.
Estos instrumentos se conocen con el nombre genérico de microscopios y se
distinguen: el microscopio estereoscópico, corrientemente conocido como lupa,
de poco aumento, y el microscopio compuesto, de mayor aumento que la lupa.
Tanto la lupa como el microscopio constituyen instrumentos fundamentales
para el reconocimiento de material biológico, por esta razón se hace necesario
que aprendamos a manejar con cuidado estos instrumentos de incalculable
valor, ya que nos permitirán descubrir el mundo fabuloso del cual formamos
parte.

1.2. UNIDADES DE LONGITUD

Utilizadas para la medición de estructuras celulares (mm; m ;A°; pcm)

(milímetro, micra, milimicra, ángstrom, picómetro).
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INSTRUMENTOS ÓPTICOS

A .►MICROSCOPIO ESTEREOSCÓPICO O LUPA

El microscopio estereoscópico está

diseñado para producir una imagen
tridimensional (estereoscópica). En realidad
son dos lupas, colocadas una al lado de la
otra y con cierta oblicuidad entre sí (15
grados), que da a la imagen el efecto de
profundidad. La lupa posee una capacidad
de aumento limitada, que oscila entre 1,5x
a 50x, y forma una imagen aumentada y
derecha.
Nos permite observar cuerpos grandes
(insectos, rocas, etc)

Microscopio Estereoscópico o Lupa

Partes de la lupa:

1.-Oculares.
2.-Anillo para ajustar la visión personal.
3.-Tubo binocular
4.-Dispositivo para ajustar la distancia interpupilar del observador, a veces esto
se logra moviendo los oculares.
5.-Tambor para cambio de aumento.
6.-Ajuste de enfoque.
7.-Pilar ajustable.
8.-Luz.
9.-Platina con espejo debajo, para la colocación del material.

Cómo enfocar una lupa:

1.-Seleccione la luz incidente, ajuste el control de la luz para proporcionar una

iluminación uniforme sobre la placa.
2.-Ajuste los oculares a la separación entre los ojos.
3.-Coloque el ejemplar a observar sobre la placa.
4.-Enfoque mediante el control de enfoque, usando sólo el ojo izquierdo.
5.-Usando el ojo derecho enfoque moviendo el anillo de ajuste de visión
personal. Después observe con los dos ojos.
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6.-El aumento se varía, cuando es necesario, mediante el cambio

de oculares y/o el tambor de cambio de aumento. El aumento de la lupa se
calcula multiplicando el aumento del ocular por el aumento que indica el
tambor de cambio.

b. ►MICROSCOPIO

El Microscopio (término procedente del griego "mikro: pequeño y skop: visión)

El microscopio compuesto es un instrumento óptico que tiene un doble
aumento. El primer aumento lo realiza el objetivo, el cual produce una imagen
real y define la resolución del sistema. El segundo aumento lo efectúa el ocular,
que produce una imagen virtual aumentada de la imagen real formada por el
objetivo. La imagen observada es aumentada e invertida. El microscopio
compuesto está constituido por un sistema mecánico que sostiene un sistema
óptico formado de diferentes lentes.

Partes del microscopio

Tiene dos partes: una óptica, para observar, y otra mecánica, que sostiene a la
primera.

La parte óptica consta de:

• Ocular, lente situada cerca del ojo del observador.

• Objetivo, lente situada cerca del objeto que se quiere observar.

• Diafragma, dispositivo para graduar la entrada de luz.

• Condensador, dispositivo para concentrar la luz sobre el objeto.

• Foco de luz o espejo, para iluminar el objeto.

La parte mecánica del microscopio consta de:

• Columna, parte que sostiene el tubo óptico.

• Tubo óptico, donde se encuentra ubicado el ocular.

• Revólver, parte móvil que sostiene los objetivos.

• Platina, que soporta el portaobjetos.

• Pié, sostiene todo el microscopio.

• Tornillo macrométrico, que permite desplazamientos rápidos de las lentes.

• Tornillo micrométrico, que permite desplazamientos suaves de las lentes.

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¿Cómo se utiliza el microscopio?

El objeto que queremos observar se coloca en un vidrio transparente que

llamamos portaobjetos, y lo cubrimos con otro vidrio más fino que llamamos
cubreobjetos.

Una vez conocido el funcionamiento de las partes del microscopio debes saber
que el aumento que nos ofrece se obtiene con la combinación del objetivo y del
ocular.

Por ejemplo, si tenemos un ocular de 15x y un objetivo de 40, el aumento

obtenido es de:

40 x 15 = 600 aumentos.

El enfoque del objeto se realiza con el tornillo macrométrico, y después se afina

con el tornillo micrométrico, hasta conseguir una visión perfecta. Una vez
enfocado el objeto, se pasa al objetivo inmediatamente superior, hasta obtener
el aumento deseado.

La luminosidad para observar la muestra la puedes regular moviendo el

diafragma hasta conseguir la más adecuada para cada caso.
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Como unidad de medida, en

microscopia se utiliza la
micra (µ). Su equivalencia es:
1µ = 1/1000 mm; por tanto, 1 mm =
1000 µ
Todos los instrumentos de
observación presentan un
determinado poder de resolución
que es la capacidad del
instrumento de separar dos puntos
cercanos.
El microscopio óptico permite
observar células y pequeñas
estructuras con un tamaño no
menor de 0.1 µm o micra. La
resolución del ojo humano es de
100 µm (0,1 mm) por lo tanto el
microscopio óptico aumenta unas
500 ves más que el ojo humano,
permitiéndonos que veamos
células por ejemplo.

2. ASPECTOS GENERALES DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

Poder de resolución:
Resolución, o poder de resolución, se define como la capacidad límite para
diferenciar elementos próximos de un conjunto. Se le denomina también poder
separador.
Por ejemplo, el poder separador normal del ojo humano es de 0.25 mm a una
distancia de 25 cm. Es decir, que si dos objetos de 0.12 mm están juntos a 25
cm, el ojo humano no es capaz de diferenciarlos y los percibe como un solo
objeto. Con el microscopio se aumenta esta posibilidad más de 1000 veces, ya
que tiene un poder de resolución de aproximadamente 0.25 micras.

Profundidad de campo:
Es el intervalo sobre el cual puede modificarse la distancia de trabajo del
objetivo sin que se pierda la nitidez del contorno de la muestra que se observa.
Es inversamente proporcional a la apertura numérica y al aumento. Por lo
tanto, cuanto mayor la apertura del objetivo menor la profundidad de campo, e
igualmente, cuanto mayor el aumento menor la profundidad de campo.
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Aumento del microscopio:

Como regla general se debe trabajar con el menor aumento que permita
visualizar los detalles que se desean observar en la muestra. Con esto se logra
una mejor definición y mayor profundidad de campo.
El procedimiento lógico es comenzar con lentes, objetivos y oculares, de poco
aumento y progresivamente usar objetivos de mayor aumento hasta reconocer
los detalles que no interesan. Reconocidos los detalles se juega con el ocular
para obtener la mejor definición.
De no lograrse la observación que interesa hay que tener en cuenta que
pueden estar fueras de las posibilidades del equipo o inclusive que no sea
posible su observación con luz normal. Calculando el poder de separación, y si
se conocen las dimensiones de los detalles a observar, es posible determinar si
están dentro de la capacidad del instrumento.
Para calcular el aumento, a condición de que la longitud del tubo sea la
correcta, se multiplica el aumento del objetivo por el aumento del ocultar. Por
ejemplo, si el objetivo es 100x, y el ocular 10x, el conjunto proporcionará un
aumento de 10 por 100=1000.

O sea, que el aumento será 1000x

Medición con el microscopio:

Para medir objetos con el microscopio se requiere que este tenga como
accesorios:
un micrómetro de platina, que es un porta objetos que tiene una escala
dividida en centésimas de milímetros, y un micrómetro ocular, que es una placa
circular con una escala graduada que va inserto en el ocular. Para realizar la
medición se procede de la siguiente manera:

1.- Se coloca el micrómetro ocular y se enfoca de manera que se observe con

la máxima nitidez la escala.
2.-Se coloca el micrómetro de platina y se superponen las escalas. Como
conocemos las dimensiones de la escala del micrómetro de platina, podemos
calcular el valor de cada división de la escala del ocular.

Una división del ocular es igual: al número de divisiones del micrómetro de

platina x 0.01 mm entre el número de divisiones del ocular que se superponen.

no. div. del micrómetro de platina x 0.01 mm

1 div. ocular =
no. div. del micrómetro ocular

Se requiere un cálculo por separado para cada objetivo porque el aumento es

diferente.
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3. Microscopios ópticos especiales

Entre estos microscopios encontramos a los:de contraste de fase, de fondo

oscuro, de fluorescencia y confocal, microscopía electrónica.

• Microscopios electrónicos

Utilizan haces de electrones que chocan contra el objeto que se desea

observar. Posteriormente, los electrones impactan contra una película de
fotografía que queda impresionada. Lo que se observa al microscopio
electrónico no es una muestra, sino una fotografía que se saca de esa
muestra. Se consiguen 500.000 aumentos, por lo que se utilizan para observar
estructuras del interior celular.

Los microscopios electrónicos pueden ser:

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4.  TÉCNICAS

Entre las más comunes podemos nombrar:

√ El cultivo celular es el proceso mediante el que células, ya sean células

procariotas o eucariotas, pueden cultivarse en condiciones controladas. En la
práctica el término "cultivo celular" se usa normalmente en referencia al cultivo
de células aisladas de eucariotas pluricelulares, especialmente células
animales. El desarrollo histórico y metodológico del cultivo celular está
íntimamente ligado a los peptidos cultivares del cultivo de tejidos y el cultivo de
órganos.

√ Fraccionamiento Celular: El fraccionamiento celular o fraccionamiento

subcelular es una técnica de laboratorio, tras la disgregación, en la que se
intenta reagrupar las partículas, generalmente células u orgánulos celulares, en
función de sus propiedades biofísicas.

Mediante el fraccionamiento celular se consigue separar conjuntos

homogéneos, por lo general de orgánulos, a partir de una población
heterogénea de células.

√ La citoquímica es una rama de la biología celular enfocada en el estudio de

la composición química de las células y sus procesos biológicos moleculares
mediante análisis químicos y quimicofísicos que permitan su observación. Se
considera como un nexo de unión entre la morfología y la bioquímica.

La citoquímica se dedica a la identificación y localización de los compuestos

químicos y macromoleculas dentro de las células, basándose en métodos de
reacciones colorimétricas, como la Reacción de Feulgen, verde janus B, rojo
oleoso, Sudán rojo, Técnica de Schiff, entre otros. Sirve para el estudio de las
células.