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Los linfocitos
Técnicas de separación de los linfocitos

Los linfocitos son las células responsables de la inmunidad específica,

por eso es importante su estudio para la valoración de la respuesta
inmune.
Para poder estudiarlos es necesario separarlos de los demás
componentes de la sangre.
También pueden separarse los diferentes tipos de linfocitos.
La técnica más utilizada es la separación por centrifugación en
gradiente de Ficoll.

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Los linfocitos
Técnicas de separación de los linfocitos
Separación de linfocitos por centrifugación en gradiente de Ficoll

Medio de separación:
Está formado por dos compuestos:
Ficoll 400: polímero sintético.
Diatrizoato de sodio.
Se prepara siguiendo estos pasos:
Preparar solución al 14 % de Ficoll 400.
Mezclar la solución con diatrizoato en la proporción adecuada.
Ajustar la densidad y la osmolaridad.
Esterilizar por filtración.
Conservar a 4 °C en oscuridad.

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Los linfocitos
Técnicas de separación de los linfocitos
Separación de linfocitos por centrifugación en gradiente de Ficoll

Fundamento: separación de las células según

su densidad, formando tres fases:
Banda superior:
Corresponde al plasma.
Banda intermedia (blanca):
Contiene las células mononucleares
(linfocitos).
Banda inferior (rojiza):
Sedimento de eritrocitos y granulocitos.

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Los linfocitos
Técnicas de separación de los linfocitos
Separación de linfocitos por centrifugación en gradiente de Ficoll

Procedimiento de separación:
Preparar el medio de separación Ficoll-diatrizoato.
Preparar la sangre.
Añadir con cuidado la sangre sobre el medio de separación.
Centrifugar.
Eliminar la fase superior con una pipeta pasteur. Depositar la segunda en
un tubo limpio.
Resuspender en el tubo limpio con más medio.
Lavar mediante centrifugación.
Añadir el medio de conservación.
Cuantificar la viabilidad de las células y efectuar el recuento.
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Los linfocitos
Técnicas de separación de los linfocitos
Separación de poblaciones

Existen técnicas para separar las diferentes poblaciones de linfocitos:

Separación celular inmunomagnética: partículas magnéticas
recubiertas con anticuerpos dirigidos a la célula deseada.
Técnicas de inmunotoxicidad: se separan las células deseadas
lisando el resto de células.
Panning para linfocitos: utiliza unas placas que se unen a la
población deseada.
Citometría de flujo: permite caracterizar y separar linfocitos.
Filtración con columnas de lana de nailon: se basa en la no
afinidad de los linfocitos T a esta lana, permitiendo su purificación.

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Los linfocitos
Estudio de la funcionalidad de los linfocitos B

Se induce a los linfocitos a dividirse in vitro. Esta capacidad se utiliza

para evaluar su funcionalidad.
Dicha funcionalidad refleja los mecanismos de activación celular y
proliferación que se producen in vivo.
Determinación de la producción de anticuerpos:
Cuantificación de IgG, IgM e IgA.
Medición de subclases de inmunoglobulinas.

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Los linfocitos
Estudio de la funcionalidad de los linfocitos T
Estudios de proliferación en respuesta a mitógenos

Fundamento:
Los linfocitos T sensibilizados frente a un antígeno se transforman en
linfoblastos si se cultivan en presencia del antígeno o de un agente
mitógeno.
La proliferación de linfoblastos
implica síntesis de ADN, la cual
puede medirse con la tasa de
incorporación de timidina tritiada.
Esta tasa de incorporación se utiliza
para estudiar la funcionalidad de los
linfocitos T.

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Los linfocitos
Estudio de la funcionalidad de los linfocitos T
Estudios de proliferación en respuesta a mitógenos

Procedimiento:
Separar los linfocitos por centrifugación con medio Ficoll-diatrizoato.
Lavar varias veces con medio de cultivo celular.
Ajustar a una concentración del orden de 5 · 106 células/ml.
Dispersar en placas de microtitulación de 96 pocillos.
Incorporar la solución de antígeno problema (excepto a los controles).
Incubar durante 72 h a 37 °C.
Añadir timidina tritiada e incubar durante al menos 16 h.
Poner las células en contacto con un líquido de centelleo.
Establecer la tasa de proliferación comparando la radioactividad de las
células estimuladas y la de las células control.
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Los linfocitos
Estudio de la funcionalidad de los linfocitos T
Valoración de citoquinas

Se estudian los sobrenadantes de cultivos estimulados con antígenos

o mitógenos.
Tapizar las placas con un anticuerpo monoclonal frente a la
citoquina que se va a determinar.
Añadir la muestra problema.
Añadir otro anticuerpo anti-citoquina, marcado con biotina.
Añadir el conjugado.
Añadir el sustrato.
Cuantificar el color en un lector de placas de ELISA.
Se consideran positivos los valores que superan en
tres desviaciones la media de los controles negativos.
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Los linfocitos
Estudio de la funcionalidad de los linfocitos T
Prueba de la hipersensibilidad cutánea retardada

Consiste en la inoculación de una

cantidad conocida de antígeno PPD
(derivado proteico purificado).
Tras 48-72 h se observa el sitio de
inyección.
La prueba se considera positiva si
aparece una pápula de diámetro
superior a 2 mm.
Un resultado negativo puede hacer
sospechar de algún tipo de
inmunodeficiencia.

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Los linfocitos
Cuantificación de los linfocitos

Debido a que son morfológicamente iguales, es necesaria la

utilización de técnicas de identificación de proteínas para diferenciar
los linfocitos B y T.
Tradicionalmente, se han utilizado métodos de inmunofluorescencia
para cuantificar las diferentes poblaciones.
Cuantificación de linfocitos B:
La técnica más utilizada es la citometría de flujo.
Cuantificación de linfocitos B:
Citometría de flujo.
Técnica de formación de rosetas-E.
Prueba de citotoxicidad por liberación de cromo.

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Los linfocitos
Cuantificación de los linfocitos

Técnica de formación de rosetas-E:

La molécula CD2 de la superficie de los linfocitos T viables se une a
los eritrocitos de carnero formando agrupaciones llamadas rosetas.
Una tinción permite observar las rosetas y contar los linfocitos
viables.
Prueba de citotoxicidad por liberación de cromo:
Permite la determinación de linfocitos T CD8+ específicos de
antígeno.
Las células diana se marcan con cromo radioactivo.
Los T CD8+ lisan la célula diana y liberan el cromo al medio.

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Los linfocitos
Cuantificación de los linfocitos

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Estudio de las células fagocíticas
Evaluación de la capacidad fagocítica

Se incuba una porción de leucocitos de sangre periférica con una

suspensión de partículas inertes o microorganismos para permitir la
fagocitosis.
La fagocitosis se cuantifica mediante la observación de las células teñidas.
Inconveniente: no permite distinguir entre fagocitosis y moléculas
adheridas a la superficie.
También se puede evaluar mediante citometría de flujo marcando la
bacteria con un colorante fluorescente.

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Estudio de las células fagocíticas
Evaluación de la activación de los fagocitos

En la activación de los fagocitos se produce un «estallido respiratorio»:

Inducido por proteínas de membrana y citoplasmáticas.
Se genera anión superóxido que se transforma en peróxido de
hidrógeno.
Se evalúa mediante la prueba de reducción del NBT (azul de tetrazolio
nitrado).

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Estudio de las células fagocíticas
Evaluación de la actividad microbicida

Los fagocitos se incuban con una cantidad conocida de microorganismos.

Después de una incubación, se realiza un recuento de viables.
La disminución de unidades formadoras de colonia indica la acción de los
fagocitos.
Evalúa la capacidad de «ingestión» y de eliminación de microorganismos.

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Estudio de las células fagocíticas
Estudios de quimiotaxis

Evalúan la capacidad de locomoción de los

fagocitos atraídos por un estímulo.
Se utilizan dos cámaras aisladas separadas por
un filtro (cámara de Boyden): en la cámara
interior se colocan las células fagocíticas y en la
exterior, un agente quimiotáctico.
Los fagocitos intentan desplazarse hasta el
agente quimiotáctico y se quedan enganchados
en la membrana.
Posteriormente, esta se tiñe y se observa al
microscopio.

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Estudio del complemento

Está formado por proteínas plasmáticas que se activan en cascadas en

respuesta a determinados estímulos.
Vías de activación:
Vía clásica: iniciada por anticuerpos (IgM e IgG).
Vía alternativa: iniciada por moléculas presentes en la superficie de los
patógenos.
Vía de las lectinas: iniciada por residuos de manosa de las superficies
bacterianas.
Los defectos en el sistema del complemento producen patologías
(inmunodeficiencias o enfermedades autoinmunes).

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Estudio del complemento
Cuantificación de las fracciones C3 y C4

Se realiza fácilmente mediante:

Técnicas de inmunodifusión radial.
Técnicas de inmunonefelometría.
Inconveniente: detectan componentes funcionales, inactivados o
fragmentos.

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Estudio del complemento
Análisis de la vía clásica

Técnica CH50:
Al mezclar suero con eritrocitos sensibilizados con anticuerpos, el
complemento se activa lisando los eritrocitos.
Se realiza una curva patrón con cantidades crecientes de suero
problema (cantidades crecientes de complemento).
Se calcula el volumen de suero para lisar el 50 % de los eritrocitos.
Técnica de hemólisis en gel de agarosa:
Variación de la técnica CH50 donde los eritrocitos se encuentran en un
gel de agarosa.
Se prepara el gel con los eritrocitos sensibilizados.
El suero se coloca en pocillos practicados en el gel.
Se observa la hemolisis de eritrocitos y se mide el halo generado.
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