Revista CENIC.

Ciencias Químicas
ISSN: 1015-8553
juan.araujo@cnic.edu.cu
Centro Nacional de Investigaciones Científicas
Cuba

Ondarse Álvarez, Dianelys; Leyva Montaña, Rene; Samora Barrabí, Minely; Hernández, Ignacio;
Alonso, Luis Michel
Modificación del hR3 con DOTA-NHS. Marcaje con 90Y y biodistribución
Revista CENIC. Ciencias Químicas, vol. 41, 2010, pp. 1-12
Centro Nacional de Investigaciones Científicas
La Habana, Cuba

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 Modificación del hR3 con DOTA-NHS. Marcaje con 90Y y biodistribución.

Modification of hR3 with DOTA-NHS. Labeling with 90Y and biodistribution.

Dianelys Ondarse Álvarez1, Rene Leyva Montaña2, Minely Samora Barrabí3, Ignacio
Hernández4 y Luis Michel Alonso5
1
dianelys.ondarse@umcc.cu
Universidad de Matanzas, Autopista a Varadero, km 3½, Matanzas 44740 (Cuba)
2
rene@centis.edu.cu
Centro Nacional de Isótopos, AP 3415 San José de las Lajas (Cuba)
3
minely@centis.edu.cu
Centro Nacional de Isótopos, AP 3415 San José de las Lajas (Cuba)
4
ignacio@centis.edu.cu
Centro Nacional de Isótopos, AP 3415 San José de las Lajas (Cuba)
5
lmichel@centis.edu.cu
Centro Nacional de Isótopos, AP 3415 San José de las Lajas (Cuba)

-1-
 Modificación del hR3 con DOTA-NHS. Marcaje con 90Y y biodistribución.

ABSTRACT

In this work the conjugation, characterization and biodistribution of

90
radioimmunoconjugate Y-DOTA-hR3 is reported. Acid 1, 4, 7, 10
tetraazacyclicdodecane N, N’, N’’, N’’’ tetraacetic ligand (DOTA-NHS) was used as
bifunctional chelating agent. Molar ratios 320:1, 160:1 and 88:1 DOTA-NHS/monoclonal
antibody (hR3) was studied for evaluating their influence on the integrity of conjugate
and labeling efficiency. The characterization of conjugates formed was performed using
HPLC and SDS-PAGE electrophoresis and isoelectric focusing. Determining the number
of DOTA-NHS groups bound to a monoclonal antibody molecule was performed using
the radioactive indicators method. In vivo stability of 90Y-DOTA-hR3
radioimmuneconjugates was determined in healthy Wistar rats at 4, 24 and 48 hours.
Characterization for HPLC and electrophoresis showed that purity, identity and integrity
of biomolecule, after the conjugation process was kept, and the molar ratio have an
influence not only on the conjugation process but also on the labeling efficiency. It was
more than 90% for molar ratios of 320:1 and 160:1. The specific activity of 90Y-DOTA-
hR3 was between 2 and 13 mCi / mg. Stability studies performed by DTPA versus
challenge showed that the compound is stable in a wide range of time (up to 216h). In
vivo stability studies, based on the uptake in bone (taken into account the affinity of the
3+ metals for phosphates groups) showed that the lost of radiometal in the
radioimmuneconjugate is not appreciable up to 48 hours. This study suggests that 90Y-
DOTA-hR3 could be a potential candidate for use in radioimmunetherapeutic
procedures.

Keywords: Labeling with 90Y; DOTA-NHS conjugation; Monoclonal antibody hR3; 90

Y-
DOTA-NHS-hR3 radioinmunoconjugate.

RESUMEN

En el presente trabajo se reporta la conjugación, caracterización y biodistribución del

radioinmunoconjugado 90Y-DOTA-hR3. Se empleó el ligando DOTA-NHS como agente
quelatante bifuncional y se estudiaron las relaciones molares 320:1, 160:1 y 88:1 DOTA-
NHS/anticuerpo monoclonal hR3, evaluándose su influencia en la integridad del
conjugado y la eficiencia de marcaje. La caracterización de los conjugados formados se
realizó empleando HPLC y electroforesis SDS-PAGE e isoelectroenfoque. La
determinación del número de grupos DOTA-NHS enlazados a una molécula de
anticuerpo monoclonal se realizó empleando el método de los indicadores radiactivos.
La estabilidad in vivo de los radioinmunoconjugados 90Y-DOTA-hR3 se determinó en
ratas Wistar sanas a las 4, 24 y 48 horas. La caracterización por HPLC y electroforesis
demostró que se preserva la pureza, la identidad y la integridad de la biomolécula
después del proceso de conjugación y que la relación molar ligando/anticuerpo influye
en la conjugación y la eficiencia de marcaje, la cual fue superior al 90% para las
relaciones molares 320:1 y 160:1. La actividad específica del 90Y-DOTA-hR3 fue entre 2
y 13 mCi/mg. Los estudios de estabilidad realizados mediante reto versus DTPA

-2-
demostraron que el compuesto es estable en un amplio rango de tiempo (hasta 216h).
Los estudios de estabilidad in vivo basados en la captación en hueso (dada la afinidad
de los metales 3+ por los grupos fosfatos) demostraron que no es apreciable la pérdida
del radiometal en el radioinmunoconjugado hasta las 48 horas. Este estudio sugiere que
el 90Y-DOTA-hR3 pudiera ser un candidato potencial para su empleo en procedimientos
radioinmunoterapéuticos.

Palabras Claves: Marcaje con 90Y; Conjugación con DOTA-NHS; Anticuerpo

monoclonal hR3; Radioinmunoconjugado 90Y-DOTA-NHS-hR3.

1 INTRODUCCIÓN

En la actualidad el empleo de anticuerpos monoclonales continúa ganando popularidad

como plataforma para la radioinmunoterapia (RIT) de cáncer. Los radiofármacos para
terapia involucran moléculas con afinidad por blancos específicos como son los
anticuerpos, a las que se une un radionucleido con propiedades físico-nucleares (T1/2,
Eβ-) adecuadas que permitan su localización en el tumor en una concentración suficiente
para que deposite en las células tumorales la dosis de radiación necesaria para la
destrucción del tejido diana y luego rápidamente se aclare de la sangre y los otros
órganos normales con el objetivo de minimizar los daños colaterales en el tejido
sano [1-6].
Los ligandos aminocarboxilatos como el ácido N, N, N´-dietilentriamino N´´, N´´-
pentaácetico (DTPA), el ácido 1, 4, 7, 10-tetraazaciclododecano-N, N´, N´´, N´´´-
tetraacético (DOTA) y sus análogos son los agentes quelatantes más empleados para
acomplejar radiometales con número de oxidación 3+ como el 90Y [7-10].
En el Centro de Isótopos (CENTIS), principal productor y suministrador de
radiofármacos en el país, y en estrecha colaboración con el Centro de Inmunología
Molecular (CIM) se han ejecutado diferentes estudios para la aplicación de
radiofármacos basados en anticuerpos monoclonales cubanos en la Medicina Nuclear,
en ese marco se ejecutó un ensayo clínico multicentro fase I de radioinmunoterapia en
pacientes con tumores cerebrales de origen epitelial, utilizando el
radioinmunoconjugado 188Re-Nimotuzumab. Sin embargo, en los últimos años, el alto
precio y la baja disponibilidad de los generadores 188W/188Re en el mercado
internacional ha inclinado las investigaciones a la utilización de radioinmunoconjugados
con 90Y.
En el presente trabajo se reporta la preparación y caracterización del
radioinmunoconjugado 90Y-DOTA-hR3 así como su estudio de estabilidad in vitro y
biodistribución en ratas Wistar sanas.

2 MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 Reactivos y equipos

El anticuerpo monoclonal anti-EGF humanizado hR3 (5 mg/mL), fue suministrado por el
Centro de Inmunología Molecular (CIM, Cuba). El 90Y se obtuvo en forma de 90YCl3 a
partir de un generador de 90Sr/90Y fabricado en el Centro de Isótopos (CENTIS). El
ligando DOTA-NHS se adquirió de Macrocyclics Dallas TX. El Duodecilsulfato de sodio
(SDS), la acrilamida y bisacrilamida, provinieron de la firma AnalaR. El Tris-HCl y la
glicina se adquirieron de la firma Merck. El patrón de punto isoeléctrico y el de peso
molecular fueron suminstrados por Bio-Rad. Se utilizó un HPLC equipado con bombas
LC-10, detector espectrofotométrico modelo SPD-6AV, integrador CROMATOPAC C-

-3-
R4AX, colector de fracciones BROMMA 2112 REDIRAC, radiométrico Berthold
(Alemania) y columna Protein Pack SW300 Waters (7,5 X 300 mm, 10 µm, Waters). La
concentración del anticuerpo se determinó en un espectrofotómetro UV-visible
(Spectronic Genesys 5 (USA)). La electroforesis SDS-PAGE se realizó en un equipo
con fuente de alto voltaje (Mini-PROTEAN® 3 Cell) y la determinación del punto
isoeléctrico se desarrolló en un equipo para electroforesis por isoelectroenfoque
(PhastSystem). La medición de la actividad se realizó en un contador de centelleo
líquido LKB-WALLAC-RacBeta 1209, Finlandia) y en un calibrador de dosis CMR 35C
(Capintec, EEUU). El procesamiento estadístico se realizó utilizando los paquetes
estadísticos de MS Excel. Se aplicaron métodos no paramétricos; se utilizó el test de
Kolmogorov-Smirnov con un nivel de significación α = 0.05.

2.2 Conjugación del hR3 con DOTA-NHS

Se trabajó con las relaciones molares (88:1,160:1 y 320:1) DOTA-NHS/hR3, donde
para 10mg de hR3 en solución se pesaron 5.6 mg, 8.1mg y 20mg de DOTA-NHS. Al
DOTA-NHS sólido se le añadieron 400μL de buffer fosfato 0,1M pH-8.5 y
posteriormente se le añadió el hR3. Luego se añadió NaOH 2M para ajustar el pH hasta
8,5. La mezcla reaccionante se incubó a 16ºC durante toda la noche con agitación en un
Vortex. Los inmunoconjugados se purificaron en columna PD-10 calibrada con
aproximadamente 20mL de buffer acetato de amonio 0,1M (1,0 % HSA) pH-7,0
purificado. La elusión se llevó a cabo igualmente con buffer acetato de amonio 0,1M pH-
7,0 y se colectaron 12 fracciones de 0,5mL. Las mismas se midieron a 280 nm en un
espectrofotómetro UV y en HPLC.
Para determinar la concentración de los inmunoconjugados se utilizó el método de
Bradford[11]. Paralelamente se midió el inmunoconjugado obtenido a 280nm empleando
el coeficiente de extinción molar del hR3 (1,4), usando PBS (0,01M) como blanco.
Para determinar los agregados de alto peso molecular que se pudieran formar en el
proceso de conjugación, la pureza y la integridad de los conjugados se utilizó HPLC de
exclusión molecular (HPLC-EM). Se inyectaron 20 µL de la muestra, como fase móvil se
utilizó NaCl 0,9 % con un flujo de 1mL/min y se colectaron fracciones de 0,5 o 1,0 mL.
Para realizar la electroforesis SDS-PAGE se prepararon los geles de poliacrilamida al
12.5 % (p/v) según el procedimiento descrito por Laemmli (1970). Fueron aplicados
aproximadamente 4 μL de las muestras. La corrida electroforética se realizó en una
cámara BioRad (BioRad Cat. 1610318, Suecia). La visualización de las bandas se logró
mediante la incubación del gel en una solución de azul de Coomassie R-250 al 0.05%
durante 10 minutos. Posteriormente, se hicieron lavados sucesivos con solución de
destinción (metanol al 10%, ácido acético al 10%, en agua destilada) hasta observar las
bandas de proteínas.
En la caracterización de los inmunoconjugados por isoelectroenfoque se realizó la
preparación de los geles embebiendo un Phastgel DYR en una solución de 7,5%
Pharmalyte 8-10,5 y 10% glicerol durante 30 min. con agitación. Se empleó el patrón de
punto isoeléctrico(Bio-Rad ) y citocromo C patrón. Se ajustaron como condiciones
finales de la corrida para el PhastGel IEF (8-10,5) con 410 Vh. Además se utilizó el
Servicio online del Instituto Europeo de Bioinformática (EMBL WWW Gateway to
Isoelectric Point Service), para la estimación teórica de los puntos isoeléctricos.
Para determinar el número promedio de moléculas de DOTA enlazados a una molécula
de hR3 se mezclaron 50 µL de una solución estandarizada de Y(III) (1,4 x 10-4 µM, 7
nmol) que contenía ~5,5 x 107 cpm/µL de 90YCl3; 50 µl de buffer acetato de amonio 0.5M
pH-7,0 y 50 µL del conjugado DOTA-hR3 con relación molar DOTA-NHS/hR3 160:1. La
mezcla se hizo reaccionar por 3 horas a 42 oC y posteriormente se le añadió 16 µL de
DTPA 10mM pH-6 y se incubó 15 min a temperatura ambiente. Posteriormente se

-4-
aplicaron 1,5 µL de la mezcla de reacción sobre una tira de ITLC-SG (1 X 10 cm) y se
desarrolló en NH4OAc (10 % m/v): Metanol (1:1). La tira se cortó 1 centímetro por
encima del punto de aplicación y ambas fracciones se midieron en un contador de
centelleo líquido (LKB-WALLAC-RacBeta 1209, Finlandia). La relación (L/P) se
determinó utilizando la siguiente expresión:

2.3 Marcaje de los inmunoconjugados DOTA-hR3 con 90Y

En tubos Eppendorf se mezclaron alícuotas de 90YCl3 (2-8 mCi, 2,5-5 µL) en una
solución de HCl 0,05 N, 100 µL de buffer acetato de amonio 0,5M pH-7,0 y 100 µL del
conjugado DOTA-hR3 según el caso. La mezcla de reacción se incubó a 42°C por 1 h,
transcurrido este tiempo se le adicionó 1/9 del volumen de reacción de una solución de
DTPA 10mM pH-6,0 para acomplejar el 90Y que no reaccionó y se incubó por 15 min. a
temperatura ambiente. La eficiencia de marcaje se determinó mediante cromatografía
ITLC-SG empleando tiras con dimensiones (1 X 10cm). Como fase móvil se usó una
mezcla de acetato de amonio (10 % m/v) y metanol (1:1). Las tiras se cortaron 1cm
después del punto de aplicación y se midieron ambas fracciones en un contador de
centelleo líquido. La medición del 90Y se basó en el efecto Cherenkov.
La purificación de los radioinmunoconjugados se realizó de forma similar a la
purificación de los inmunoconjugados, pero la columna de purificación y el resto de las
operaciones se realizaron dentro de una cabina de plexiglass con blindaje interno como
protección contra las radiaciones del 90Y.

2.4 Estudio de estabilidad del 90Y-DOTA-hR3 en exceso de DTPA

La estabilidad del radioinmunoconjugado 90Y-DOTA-hR3 se evaluó en presencia de
exceso de DTPA. Una alícuota del conjugado radiomarcado (25-90µL) con
aproximadamente 2x107 cpm de 90Y se adiciona a 1mL de DTPA 1 mM en solución
salina que contiene 1% HSA, pH 6.0, en estas condiciones la relación molar DTPA/ 90Y-
DOTA-hR3 fue 20800:1. Está solución se incubó a 37ºC durante el tiempo de estudio,
tomándose 20 µL de la mezcla para cada punto, que se analizó por HPLC de exclusión
molecular utilizando como fase móvil 0.01 M NaH2PO4, 0.05% NaN3, pH 7.0 en régimen
isocrático. Las muestras se analizaron en un rango de intervalos de 0 a 216 h para
determinar la estabilidad del radioinmunoconjugado.

2.5 Estudio de biodistribución del 90Y-DOTA-hR3

El producto del marcaje del anticuerpo con 90Y purificado se adicionó a una solución del
anticuerpo sin marcar hasta obtener una disolución de 533 µg/mL de anticuerpo y una
concentración radiactiva de 66.7 MBq/mL.
Se utilizaron ratas Wistar machos suministradas por el Centro Nacional para la
Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB) en un rango de masa corporal de
241.3 a 318g. Se formaron tres grupos experimentales de tres ratas cada uno para ser
sacrificados a tres tiempos diferentes después de la administración, 4, 24 y 48 horas. Se
administraron en la vena marginal de la cola 0,3mL (20 MBq) de la disolución preparada
para una dosis de 160 µg de anticuerpo por animal. Los animales se colocaron en jaulas
metabólicas (Techniplast, Italia) durante el tiempo que duraron los estudios.

3 RESULTADOS

3.1 Conjugación del anticuerpo monoclonal (hR3) con el AQBF (DOTA-NHS)

-5-
La concentración de los conjugados fue 2,0 mg/mL (1,36 ± 0,01) x 10-5 M y 2,1 mg/mL
(1,48 ± 0,04) x 10-5 M determinada por el método directo y de Bradford respectivamente.
En la Fig.1 se muestra el perfil cromatográfico del inmunocojugado con relación molar
160:1 antes y después de la purificación. Las relaciones molares 320:1 y 88:1 se
comportan de manera similar, por lo que para estas relaciones molares solo mostramos
los cromatogramas de los inmunoconjugados después de ser purificados. El pico (1)
corresponde al inmunoconjugado, el pico (2) al agente quelatante libre y (3) a la
formación de agregados moleculares.

Fig.1 Cromatograma HPLC del inmunoconjugado 1(88:1) después de purificar; 2(160:1)

A: hR3 sin conjugar B: Inmunoconjugado antes de purificar C: Inmunoconjugado
después de purificar; 3(320:1) después de purificar.

En la Fig.2 se muestra la placa electroforética SDS-PAGE en condiciones no reductoras

(A) y en condiciones reductoras (B).

Fig.2 Electroforesis SDS-PAGE. 1(control), 2(320:1), 3(160:1), 4(88:1).A: No reducido.

B: Reducido.

El perfil electroforético de punto isoeléctrico (pI) (fig.3A) mostró valores para el hR3
nativo, dentro del rango de valores reportados en sus especificaciones de calidad;
valores de pI entre 8,1-8,7; resultados que fueron comprobados mediante la estimación

-6-
teórica de los pI a partir de su secuencia primaria por el servicio online del Instituto
Europeo de Bioinformática (EMBL WWW Gateway to Isoelectric Point Service)(Fig.3B).

Fig.3 A: Isoelectroenfoque. 1(control), 2(320:1), 3(160:1), 4(88:1).B: Determinación de pI

teórico por EMBL. (eje x: pH, eje y: # de moléculas DOTA por molécula hR3).

3.2 Marcaje del conjugado DOTA-hR3 con 90Y

Los resultados presentados en la tabla1 no mostraron diferencias significativas (α=0.05)
entre las formulaciones 320:1 y 160:1, sin embargo las diferencias si fueron
significativas cuando se compararon estas con la formulación de 88:1 que mostró
eficiencias de marcaje inferiores al 90%.

Tabla 1: Resultados del radiomarcaje de los inmunoconjugados DOTA-hR3

(para n=5, n-número de experimentos).
Relación Molar
Rend. de Pureza. Rad Act Específica
DOTA-
Marcaje (%) (%) (mCi/mg)
90 NHS/hR3
Y-DOTA-hR3
320:1 96.86 ± 0.88 >97 1,4 – 9,9
160:1 95.84 ± 2.54 >97 2,9 – 13,0
88:1 83.68 ± 2.55 >97 1,6 – 7,2

En la Fig.4 se muestran los cromatrogramas obtenidos por HPLC del

radioinmunoconjugado con relación molar 160:1 antes y después de purificar, los
tiempos de retención fueron 7-7,6 y 11-12min. Los resultados de la pureza radioquímica
> 97 % se corresponden con otros estudios reportados[12], en los cuales se han
alcanzado resultados superiores al 99 %.

-7-
Fig.4 Cromatograma HPLC del radioinmunoconjugado A: Radioinmunoconjugado antes
de purificar, (1)Radioinmunoconjugado(2)Impurezas B: Radioinmunoconjugado después
de purificar.

3.3 Determinación de la cantidad de grupos DOTA enlazados a una molécula de

hR3
Los resultados de la determinación de grupos DOTA-NHS según método descrito en
(2.2) enlazados a una molécula de hR3 arrojaron un valor de 14,1±0.9 moléculas de
DOTA-NHS por cada molécula de anticuerpo monoclonal.

3.4 Estudio de estabilidad in vitro

Los resultados del estudio de estabilidad del radioinmunoconjugado en relación molar
DTPA/90Y-DOTA-hR3 (20800:1) se muestran en la Fig.5.

Fig.5: Estabilidad de los radioinmunoconjugados en exceso de DTPA.

3.5 Estudio de biodistribución

En la tabla 2 se muestran los resultados de la biodistribución. El objetivo fundamental de
este estudio de biodistribución fue determinar preliminarmente la estabilidad in vivo del
radioinmunoconjugado. Los posibles sitios de acumulación del radiometal son el tejido
óseo y el tejido hematopoyético como por ejemplo el bazo.

Tabla 2. Biodistribución del 90Y-DOTA-hR3 en ratas Wistar sanas.

% DI/g
TEJIDO
4h 24h 48h
Hígado 0,09 ± 0,02 0,11 ± 0,04 0,12 ± 0,05
Bazo 0,35 ± 0,06 0,58 ± 0,02 0,78 ± 0,13
Riñón 0,22 ± 0,02 0,30 ± 0,02 0,32 ± 0,04
Pulmón 0,13 ± 0,02 0,10 ± 0,01 0,09 ± 0,03
Corazón 0,15 ± 0,02 0,10 ± 0,01 0,07 ± 0,01
Músculo 0,02 ± 0,00 0,02 ± 0,00 0,03 ± 0,01
Fémur 0,13 ± 0,02 0,15 ± 0,02 0,13 ± 0,00

-8-
4 DISCUSIÓN

Se conjugó el DOTA-NHS con el hR3 aprovechando la relativa facilidad que tiene el

DOTA de reaccionar con los grupos amino de los residuos de lisina de las cadenas
laterales del anticuerpo en medio acuoso suavemente básico (pH 8-9). Anteriormente
nuestro grupo de trabajo había estudiado las relaciones molares DOTA-NHS/hR3 en el
rango 200:1 a 600:1 obteniendo buenos resultados [13]. Tratando de disminuir las
mismas, en este trabajo se compararon 3 proporciones diferentes, una dentro del rango
ya estudiado y otras dos por debajo de éste. Un aspecto adicional de interés en el
trabajo consistió en la posibilidad de abaratar la obtención del inmunoconjugado
mediante el ahorro de DOTA, uno de los reactivos más caros y de difícil adquisición en
el mercado (172.00 USD/100 mg).
La purificación de los inmunoconjugados permite separar adecuadamente las especies
de alto peso molecular de los contaminantes más ligeros (DOTA en exceso y posibles
fragmentos del anticuerpo), evitando los prolongados tiempos de purificación por
diálisis empleados por Lewis y cols [10]. En nuestro trabajo solo necesitamos 15 min.
para completar este proceso. La muestra purificada se caracterizó por HPLC. En el
espectro no se observa la presencia del AQBF libre ni de agregados moleculares, lo
cual es una medida de la alta pureza del inmunoconjugado y de que conserva la
integridad del anticuerpo después del proceso de conjugación.
A pesar de la pequeña masa molecular del DOTA comparada con el anticuerpo
monoclonal, el coeficiente de extinción molar de la proteína debería cambiar cuando
varios grupos de DOTA son enlazados a ésta. En este trabajo empleamos el método de
Bradford para determinar la concentración del conjugado por interpolación en curva de
calibración. Este método se basa en la determinación de las concentraciones de
Arginina por métodos espectrofotométricos, ya que el reactivo de Bradford se acopla
con alta afinidad a este aminoácido. De esta manera obtenemos la concentración de la
proteína sin necesidad de utilizar el coeficiente de extinción molar. Por otra parte
realizamos la determinación de su concentración por el método espectrofotométrico
utilizando el coeficiente de extinción molar del hR3 y no se encontraron diferencias
significativas entre los dos métodos.
En la caracterización por electroforesis SDS-PAGE, se pudo observar como mediante el
tratamiento de la muestra con 2 – mercaptoetanol fue posible detectar la presencia de
grupos DOTA-NHS acoplados al anticuerpo monoclonal. Esto es debido a que los
puentes disulfuro intra e intercatenario de las cadenas pesadas tipo gamma y liviana
tipo kappa y lambda son disociados por la acción de este agente reductor, permitiendo
que se pierda la estructura cuaternaria con mayor facilidad y se favorezca la interacción
del anticuerpo monoclonal distendido en cadena peptídicas individuales con el SDS.
En la caracterización por isoelectroenfoque se puede apreciar como a medida que
aumenta la relación molar DOTA-NHS/hR3 el punto isoeléctrico se hace menor en
magnitud. Esto muestra una posible relación entre el número de grupos DOTA-NHS y la
cantidad de residuos lisina ocupados por este ligando que no aportan carga a la
determinación de pI. Estos resultados fueron comprobados mediante la estimación
teórica de los pI a partir de su secuencia primaria por el servicio online del Instituto
Europeo de Bioinformática (EMBL WWW Gateway to Isoelectric Point Service). La fig.
3B nos muestra un comportamiento similar al obtenido en la determinación
experimental. A pesar de que estos resultados no son aún definitorios, se puede
concluir que existe cierta relación entre el número de grupos DOTA-NHS enlazados a
los residuos lisina del hR3 y el valor del pI, el cual disminuye sin afectar la identidad del
anticuerpo monoclonal.

-9-
Los inmunoconjugados fueron marcados con 90Y como fue descrito en (2.3). Estudios
anteriores del conjugado DOTA-hR3 mostraron que con relaciones molares DOTA-
NHS/hR3 en el rango de 600:1 - 200:1 se obtienen eficiencias de marcaje superiores al
90 %[13]. En nuestro trabajo decidimos estudiar las relaciones molares 320:1, 160:1 y
88:1. Los resultados presentados en la tabla 1 no mostraron diferencias significativas
(α=0.05) entre las formulaciones 320:1 y 160:1, sin embargo las diferencias si fueron
significativas cuando se compararon estas con la formulación de 88:1 que mostró
eficiencias de marcaje inferiores al 90%. Teniendo en cuenta este resultado decidimos
continuar los estudios con la formulación de 160:1, debido a que es necesario emplear
menor cantidad de DOTA que en las otras formulaciones que mostraron resultados
satisfactorios. En la purificación de los radioinmunoconjugados se eliminan las
impurezas como el 90Y-DTPA, coloides marcados y 90Y-Acetato, y esto se corrobora
mediante la obtención del cromatograma de HPLC de la mezcla (Fig.4).
El número de ligados por molécula de anticuerpo está en correspondencia con los
obtenidos en la determinación teórica del punto isoeléctrico (fig.3B), sin embargo,
algunas publicaciones señalan que un elevado número de agentes quelatantes unidos al
anticuerpo pueden afectar su inmunoreactividad, por lo que la evaluación de la misma
es prácticamente inevitable para caracterizar correctamente al radioinmunoconjugado.
Los resultados obtenidos en la incubación del radioinmunoconjugado en exceso de
DTPA evidencian su estabilidad, corroborando los resultados reportados por otros
autores [14,15] para radioinmunoconjugados de este tipo. El 90Y que se encuentra libre
puede ser consecuencia de que parte del 90Y no se haya enlazado al DOTA y se haya
acoplado a otros sitios en el anticuerpo, en este caso el radioisótopo pudiera
desacoplarse de estos sitios cuyos enlaces son más débiles que los enlaces con DOTA
y transquelar al DTPA que es un AQBF que tiene la capacidad de acomplejar
rápidamente al radiometal.
En los estudios de biodistribución se puede apreciar (tabla2), como no existe una
acumulación significativa de radiactividad en ninguno de los órganos o tejidos
muestreados. Se discute acerca de la acumulación del 90Y en tejido óseo cuando se
presenta como impureza o cuando se libera del radioinmunoconjugado por inestabilidad
del mismo [16,17]. Solamente podemos apreciar un ligero aumento de la captación
esplénica que no supera el 1% de la dosis por gramo de tejido, siendo el tejido donde,
además, se encuentra la mayor acumulación. Esto pudiera explicarse por la similitud
entre el itrio y el hierro, es conocida la participación del bazo como tejido
hematopoyético y su papel en el recambio del Fe en la sangre, de aquí que resulte
probable la incorporación del itrio en este mecanismo. Sin embargo no se encuentra
captación en tejido óseo como suele suceder de acuerdo a otros autores[18]. De estos
resultados podemos aseverar que no existe una pérdida del radionucleido que implique
una captación indeseada en tejido no blanco.

CONCLUSIONES

Se obtuvieron conjugados DOTA-hR3 en las relaciones molares 88:1, 160:1 y 320:1, a

los cuales se le realizaron estudios de HPLC, electroforesis SDS e isoelectroenfoque,
demostrándose que se preserva la integridad y pureza del inmunoconjugado. Se realizó
el marcaje de los inmunoconjugados utilizando 90Y. Los rendimientos de marcaje fueron
superiores a 95 % para la relación molar 160:1 y 320:1 (AQBF:BM), la primera de estas
fue seleccionada como resultado de la aplicación del test Kolmogorov-Smirnov para
continuar los estudios, debido a que emplea la menor cantidad de DOTA. Los estudios
de estabilidad realizados a la formulación seleccionada (160:1) hasta 216 h se basaron
en estudios de reto contra DTPA, siendo la pureza radioquímica superior al 97 %, y

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estudios de biodistribución en ratas sanas, los que evidenciaron que el
radioinmunoconjugado no presenta especial afinidad por ningún órgano sano, siendo
los riñones, el bazo y el hígado los órganos donde se acumula el mayor porcentaje de
actividad excretada.

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