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epigenética

ISSN: 1559-2294 (Impreso) 1559-2308 (En línea) Página principal de la revista: http://www.tandfonline.com/loi/kepi20

El ácido araquidónico y oleico ejercen efectos distintos sobre

el metiloma del ADN
Guillermo A. Silva-Martínez, Dalia Rodríguez-Ríos, Yolanda Alvarado Caudillo,
Alejandro Vaquero, Manuel Esteller, F. Javier Carmona, Sebastian
Moran, Finn C. Nielsen, Marie Wickström-Lindholm, Katarzyna Wrobel,
Kazimierz Wrobel, Gloria Barbosa-Sabanero, Silvio Zaina y Gertrud Lund

To cita este artículo: Guillermo A. Silva-Martínez, Dalia Rodríguez-Ríos, Yolanda Alvarado Caudillo, Alejandro
Vaquero, Manel Esteller, F. Javier Carmona, Sebastian Moran, Finn C.
Nielsen, Marie Wickström-Lindholm, Katarzyna Wrobel, Kazimierz Wrobel, Gloria Barbosa Sabanero, Silvio Zaina
& Gertrud Lund (2016): Los ácidos araquidónico y oleico ejercen efectos distintos
sobre el metiloma del ADN, Epigenética, DOI: 10.1080/15592294.2016.1161873

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Publicado en línea: 18 de abril de 2016.

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EPIGENÉTICA
2016, VOL. 0, NO. 0, 1–14
http://dx.doi.org/10.1080/15592294.2016.1161873

TRABAJO DE INVESTIGACIÓN

El ácido araquidónico y oleico ejercen efectos distintos sobre el metiloma del ADN

, Dalia Rodríguez-Riosa, Yolanda Alvarado-Caudillob , Alejandro Vaquerod , Manel Estellere,

Guillermo A. Silva-Mart ÿneza
€

F. Javier Carmonae, Sebastián Morane, Finn C. Nielsenf, Marie Wickstrom-Lindholm , Katarzyna Wrobelc, gramo

Kazimierz Wrobelc, Gloria Barbosa-Sabanerob, Silvio Zainab, y Gertrud Lunda

un
Departamento de Ingeniería Genética, CINVESTAV Unidad Irapuato, Irapuato, México. Departamentos de Ciencias Médicas, Barcelona, Cataluña, España;
b C
Ciencias Médicas, División de Ciencias de la Salud, Le on Campus y Química, Barcelona, Cataluña, España; Química, División de Naturales y Exactas
d
Ciencias, Campus Guanajuato, Universidad de Guanajuato, México, Laboratorios de Biología de la Cromatina, Barcelona, Cataluña, España; biología de la cromatina,
y
Barcelona, Cataluña, España; Cancer Epigenetics, Cancer Epigenetics and Biology Program (PEBC), IDIBELL, Hospitalet de Llobregat, Barcelona,
F
Cataluña, España; Centro de Medicina Genómica, Rigshospitalet, Universidad de Copenhague, Copenhague, Dinamarca; gramo

Cardiovascular Experimental
Investigación, Hospital Universitario de Malm€o, Universidad de Lund, Malm€o, Suecia

RESUMEN HISTORIA DEL ARTÍCULO

El metabolismo y la disponibilidad anormales de los ácidos grasos son hitos de las enfermedades metabólicas, que a su vez son Recibido el 2 de octubre de 2015

asociado con perfiles de metilación de ADN aberrantes. Comprender el papel de los ácidos grasos en las enfermedades. Revisado el 23 de febrero de 2016

epigenética, buscamos perfiles de metilación del ADN inducidos específicamente por ácido araquidónico (AA) u oleico Aceptado el 29 de febrero de 2016

(OA) en células cultivadas y las comparó con perfiles publicados de tejidos normales y enfermos. THP-1 PALABRAS CLAVE
los monocitos se estimularon con AA u OA y se analizaron con Infinium HumanMethylation450 BeadChip b-oxidación; Metilación del
(Illumina) y matriz Human Exon 1.0 ST (Affymetrix). Los datos fueron corroborados en embriones de ratón. ADN; epigenómica; graso
fibroblastos. Las comparaciones con los datos disponibles públicamente se realizaron mediante bioinformática estándar. AA y ácido; PPAR; sirtuina
OA provocó una respuesta compleja marcada por una hipermetilación e hipometilación general del ADN en el
rango de 1 a 200 mM, respectivamente, con una respuesta diferencial máxima a la dosis de 100 mM. el divergente
La respuesta a AA y OA fue prominente dentro del cuerpo genético de los genes objetivo, donde se correlacionó
positivamente con la transcripción. Los perfiles de metilación del ADN inducidos por AA fueron similares a los correspondientes
perfiles descritos para ácido palmítico, aterosclerosis, diabetes, obesidad y autismo, pero relativamente diferentes
de perfiles inducidos por OA. Además, los perfiles de metilación del ADN asociados con el grado de aterosclerosis humana
se enriquecieron significativamente en los perfiles inducidos por AA. La evidencia bioquímica apuntaba a la b-oxidación, PPAR-a,
y la sirtuina 1 como mediadores importantes de los cambios de metilación del ADN inducidos por AA. En conclusión, AA y OA
ejercen efectos distintos sobre el metiloma del ADN. La observación de que AA puede contribuir a dar forma a la
epigenoma de importantes enfermedades metabólicas, apoya y expande las terapias y
esfuerzos preventivos.

Abreviaturas y acrónimos: matriz 450K, Infinium HumanMethylation450 BeadChip; 5mdC, 5-metil-20- desoxicitidina; AA, ácido araquidónico;
AACpG, CpG diferencialmente metilado inducido por AA; CGI, isla CpG; CpG, 50 -CG-30 dinucleótido; DB-CpG, CpG puntuado por Db; EPA,
ácido eicosapentaenoico; FACpG, CpG diferencialmente metilado común a
los conjuntos AACpG, OACpG y PACpG; FDR, tasa de descubrimiento falso; MEF, fibroblastos embrionarios de ratón; N-CpG, número de
CpG normalizados dividiendo el número de CpG diferencialmente metilados por el número total de CpG representados en la matriz de 450K
para un gen dado; OA, ácido oleico; ACpG, CpG diferencialmente metilado inducido por OA; PA, ácido palmítico; PACpG, CpG diferencialmente
metilado inducido por PA; PPAR, receptor activado por proliferador de peroxisomas;
SIRT, sirtuina. Se utilizaron siglas oficiales para todos los genes.

Introducción
La reserva de ácidos grasos (FA) de un organismo refleja tanto la composición de
la dieta y la síntesis endógena. Además, la FA anormal
Se ha reconocido desde hace mucho tiempo que los niveles participan en
enfermedades metabólicas como la diabetes.1 Dado que las enfermedades metabólicasmayor
son número de cambios de metilación asociados con este último.9 En ese
asociados con perfiles aberrantes de metilación del ADN,2 es concebible que los
ácidos grasos se encuentren entre los factores que median la remodelación de
el epigenoma en respuesta a la composición de la dieta, la célula
estado metabólico y señales patogénicas. En los humanos, sólo un
un puñado de estudios han investigado un vínculo entre la metilación del ADN y la
ingesta de grasas, centrándose en genes específicos asociados
con el metabolismo de FA, la inflamación y la regulación del ritmo circadiano
3-8 Además, un estudio reciente de todo el genoma que comparó los perfiles de
metilación de la sangre completa periférica con la cantidad y la calidad de la
ingesta de grasas en la dieta en adolescentes, encontró una
estudio, los perfiles de metilación del ADN asociados con
la proporción de ácidos grasos poliinsaturados:saturados se relacionó con las vías
regulado por el receptor a activado por el proliferador de peroxisomas
(PPAR-a) y adipogénesis. Por el contrario, no se encontraron rutas
identificado de los perfiles de metilación del ADN asociados con el
proporción de FA monoinsaturados:saturados. Además, numerosos

CONTACTO Gertrud Lund glund@ira.cinvestav.mx

Se puede acceder a los datos complementarios de este artículo en el sitio web del editor.
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2 GA SILVA-MART INEZ ET AL.

Los estudios en modelos de ratones han abordado los efectos epigenéticos a corto y
largo plazo de las dietas que contienen combinaciones variables de AG específicos.8,10
Aunque los estudios basados en la dieta son importantes ya que reconocen
la complejidad de la respuesta del organismo a los nutrientes, los conocimientos
mecanísticos se pueden obtener mediante un complementario simplificado
enfoque basado en la manipulación de los niveles individuales de FA.
En consecuencia, los efectos de los ácidos grasos cortos, como el butirato, en el ADN
metilación se han reconocido durante mucho tiempo.11 Además, muy
lipoproteína de baja densidad (VLDL) provocó una respuesta global de hipermetilación
del ADN que es notablemente más fuerte que la
inducida por lipoproteínas de baja o alta densidad en humanos cultivados
macrófagos THP-1.12,13 El hecho de que las VLDL sean característicamente ricas en
triglicéridos sugiere que los AG podrían ser mediadores
de las respuestas epigenéticas a VLDL. En consecuencia, araquidónico
ácido (AA) induce la hipometilación del ADN en el cordón umbilical humano
células endoteliales de vena a una concentración de 3 mM, globalmente y de
promotor del gen del receptor del dominio de inserción de la quinasa reguladora de la
angiogénesis.14,15 Otro estudio demostró que el ácido eicosa pentaenoico (EPA) 100
mM modifica directamente el estado de
del gen delta de la proteína de unión a CCAAT/potenciador.16 En cuanto a los modelos
de enfermedades celulares, se demostró que el ácido palmítico (PA) induce
hipermetilación global del ADN en miocitos humanos primarios
y células de los islotes pancreáticos humanos ex vivo a 500 mM y 1 mM
dosis, respectivamente, que afectan objetivos como el gen 1A del coactivador PPAR-
g.17,18 Además, un estudio reciente en un
modelo de cáncer hepático ha demostrado que una mezcla de ácido oleico
(OA) y PA provoca hipermetilación de seleccionados impresos
promotores de genes.19 Los posibles mecanismos de regulación epigenética por parte
de los FA incluyen la unión a los PPAR, una familia de mecanismos de transcripción
factores que regulan numerosos procesos metabólicos a través de la activación y
represión transcripcional dependiente de ligando.20,21
Actualmente, se desconoce si los efectos epigenéticos descritos anteriormente
son específicos de los ácidos grasos, al igual que la contribución de los ácidos grasos
a los perfiles de metilación relacionados con enfermedades. Para entender esos problemas,
nos enfocamos en los 2 ácidos grasos insaturados de cadena larga, OA y AA,
que se sabe que ejercen respuestas inflamatorias celulares generalmente
opuestas.22-24 Estudiamos los efectos de estos
FAs en el epigenoma y el transcriptoma de las células THP-1, un
modelo de monocitos humanos ampliamente aceptado, 25 y comparó nuestro
resultados a los datos disponibles de metilación del ADN de varios humanos
enfermedades y tejidos normales. Las implicaciones de nuestros resultados son
discutido en el contexto del conocimiento actual de la regulación epigenética por
componentes lipídicos y factores dietéticos, y su contribución al riesgo de enfermedad.
Resultados
Efectos del AA y OA puros en la metilación global del ADN
en células cultivadas
Primero examinamos los efectos de los FA puros, AA y OA, en
Metilación global del ADN, es decir, contenido normalizado total de 5mdC
en monocitos THP-1 humanos cultivados. Experimentos de estimulación

Figura 1. Efectos de los ácidos grasos puros en la metilación global del ADN en monocitos THP-1. A, respuesta a la dosis de FA después de una estimulación de 24 horas. B, coestimulación con AA y OA, en
en el que cada FA se mantuvo constante a la dosis de 100 mM (símbolos en el gráfico A) y el otro varió entre 1 y 100 mM (indicado como "FA variable" en el extremo de la pierna del eje horizontal). Los
datos en A se obtuvieron mediante la cuantificación 5mdC basada en HPLC, los datos en B mediante el ensayo MethylFlash (consulte el texto para obtener más detalles). Los puntos de datos representan
promedios y valores SD. La línea discontinua horizontal indica el valor correspondiente a las celdas no desafiadas (control). Este último valor difiere en los paneles A y B debido a los diferentes ensayos
utilizado. C, niveles de metilación de ALU. Los símbolos son como en A. En todos los casos, los asteriscos indican el significado de la diferencia en comparación con la dosis respectiva de 1 mM. Los
corchetes horizontales en A indican las dosis de AA u OA a las que la respuesta es significativamente diferente de la respuesta a la BSA del vehículo. , p<0,05; , P <0 0.01 (Scheff e
prueba a posteriori).
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se llevaron a cabo durante 24 h usando FA en el rango de concentración de
0–200 mM. Estas concentraciones están por debajo o dentro del rango de FA
circulante informado; consulte, por ejemplo, Higashiyama et al.26 de monocitos
THP-1.12,13 De acuerdo con un estudio similar de células THP-1 estimuladas
con AA, donde la proliferación celular se puntuó en función de la incorporación
de H-timidina,27 los AF no afectaron la proliferación celular evaluada mediante
recuento celular. En general, AA y OA provocaron respuestas distintas. El AA
3
indujo una hipermetilación del ADN dependiente de la dosis que alcanzó
máximo enun
la
dosis de 100 mM y ascendió a un aumento de 10,5% en el contenido de 5mdC
a 100 mM en relación con la dosis de 1 mM (Fig. 1A). A su vez, OA indujo una
respuesta más débil, con una hipometilación general del ADN a 100 mM en
relación con la dosis de 1 mM.
Notablemente, el efecto de OA fue significativamente diferente del del vehículo
BSA solo a dosis > 100 mM. Ni OA ni BSA provocaron respuestas
estadísticamente significativas en relación con las células no estimuladas o las
células estimuladas con 1 mM de cualquier FA, hasta la dosis de 50 mM. Para
validar las respuestas de dosis divergentes de AA y OA, se realizó un
experimento de coestimulación de 24 horas, en el que un FA se mantuvo
constante a una concentración de 100 mM mientras que el otro varió entre 1 y
100 mM. Los resultados confirmaron las distintas respuestas de metilación del
ADN a AA y OA en células THP-1 [Fig. 1B; tenga en cuenta que las respuestas
respectivas a 100 mM no fueron diferentes (PD 0,08)]. Es importante destacar
que los cambios de metilación del ADN inducidos por AA y OA observados no
fueron específicos para los monocitos THP-1, ya que las células 293 de riñón
embrionario humano también mostraron respuestas distintas a estos FA
después de una estimulación de 24 horas (Fig. 1 complementaria). Estos
experimentos se repitieron exhaustivamente y sus resultados fueron
consistentes a lo largo del tiempo (2004-2013), laboratorios de cultivo celular
y reservas de células THP-1 (Suecia, México y España), plataformas de HPLC
(México y España) y 5 mdC totales. ensayos (basados en HPLC o el sistema
MethylFlash basado en ELISA).
Como validación independiente de los datos totales de 5mdC, realizamos
un ensayo de metilación específico de ALU. Los ALU son una familia abundante
de transposones y, a menudo, se han utilizado como un sustituto de la
determinación de 5mdC total . estadísticamente significativo en el rango de 1
a 100 mM (Fig. 1C).
Efectos de AA y OA en la metilación del sitio CpG específico Para
detallar las regiones genómicas que experimentan metilación de ADN
diferencial dependiente de la dosis de FA a la resolución del nivel de CpG,
analizamos monocitos THP-1 estimulados con AA u OA 1, 10 o 100 mM,
utilizando las matrices Infinium HumanMethylation450 BeadChip (matriz 450K).
La plataforma representa >485 000 elementos CpG intergénicos e intragénicos
no repetidos.29,30 La justificación para usar 100 mM como dosis máxima fue
que produjo los efectos más divergentes entre los 2 FA en el ensayo de 5mdC
total.
El análisis de agrupamiento no supervisado de datos de matriz de 450K
mostró que los perfiles de metilación inducidos por FA eran más divergentes
con una dosis de FA de 100 mM en comparación con los perfiles de dosis
relativamente similares de 1 y 10 mM (Fig. 2), lo que refleja los datos globales de 5mdC
EPIGENÉTICA 3
Figura 2. Análisis de agrupamiento no supervisado de matriz de metilación de ADN de alta densidad
(matriz de 450K) basada en análisis de metilación de CpG dependiente de la dosis de FA.
(comparar con la figura 1A). A continuación, buscamos evidencia de una
respuesta de hipermetilación del ADN dependiente de la dosis de AA y una
respuesta opuesta para OA en datos de matriz de 450K. Restringimos nuestro
análisis a las células desafiadas con dosis crecientes de FA de 1, 10 y 100
mM, ya que los datos de las células no estimuladas reflejan una situación libre
de FA no fisiológica. Otra razón para no incluir células estimuladas con BSA
en el análisis de matriz de 450K fue que los datos globales de 5 mdC indicaron
que la tendencia global de la hipometilación del ADN inducida por OA era
estadísticamente diferente del conjunto de datos de BSA correspondiente.
Antes de realizar un análisis detallado de los datos de la matriz de 450K,
validamos los perfiles de metilación de 11 CpG correspondientes a 6 genes
mediante pirosecuenciación. Los genes se seleccionaron aleatoriamente entre
CpG con Db absoluto> 0.1 entre 1 y 100 mM AA. En todos los casos, la
pirosecuenciación reprodujo el perfil de metilación del ADN de los 7 CpG
representados en la matriz de 450K y los 4 CpG adicionales que lo flanquean
(Fig. 2 complementaria). Posteriormente, buscamos CpG autosómicos que
mostraran perfiles de metilación del ADN dependientes de la dosis, es decir,
CpG con cambios de metilación del ADN dependientes de la dosis de FA
estadísticamente significativos. Inicialmente, establecimos un Db> 0,2 entre
las dosis extremas de FA de 1 y 100 mM como criterio estricto para identificar
perfiles dependientes de la dosis de FA. Dicho filtrado arrojó 283 y 135 CpG
para AA y OA, respectivamente, una cifra que es inconsistente con los datos
globales de 5mdC que se muestran arriba. Por lo tanto, razonamos que los FA
imponen cambios de metilación de CpG pequeños y generalizados. En
consecuencia, los CpG que mostraban una Db absoluta > 0,005 entre dosis
consecutivas de FA (es decir, con una Db absoluta > 0,01 entre las dosis
extremas de 1 y 100 mM de FA) se consideraron para análisis posteriores.
Primero separamos los conjuntos de CpG para cada FA en 2 subconjuntos
que mostraban una Db positiva o negativa entre dosis extremas de FA y
realizamos una prueba de correlación de Spearman por separado en los
subconjuntos de CpG.
Esto nos permitió realizar una prueba de una cola usando un valor de umbral
absoluto r>0.985 correspondiente a P<0.05, para cada subconjunto. Esos CpG
se denominarán AACpG u OACpG.
El análisis identificó 57.187 AACpG y 48.917 OACpG, correspondientes a
14.483 y 13.914 genes, respectivamente (un
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4 GA SILVA-MART INEZ ET AL.

Se puede proporcionar una lista completa de AACpG y OACpG 5-fosfatasa (INPP5A), adenosina desaminasa, específica de ARN, B2
petición). La Dbs absoluta entre dosis de FA de 100 y 1 mM (ADARB2), molécula de adhesión celular auxiliar 1 (SDK1), ATPasa, clase
osciló entre 0,29 y 0,01 para los 2 conjuntos compuestos. Ninguno de VI, tipo 11A (ATP11A), cofactor de plegamiento de tubulina D (TBCD), y
los AACpG o los OACpG alcanzaron el umbral de significancia en todo el homólogo 2 de proteína que interactúa con disco (DIP2C). Además, tal
genoma de P<10¡7 . Una minoría de AACpG (6432 o También se observó divergencia en los perfiles de metilación específicos de FA de
11,2%) se superponen con OACpGs, correspondientes a 3.722 al menos 2 grandes regiones intergénicas que abarcan 605,7 kb y 758,0 kb
genes de tamaño en los cromosomas 4 y 8, respectivamente. La Fig. 4 muestra
ejemplos ilustrativos de perfiles de metilación inducidos por AA u OA recíprocos
de tres genes que mostraron más de >50 AACpG o AOCpG/
Importancia biológica de AACpG y OACpG gen y de la región intergénica en el cromosoma 8. Todos, o solo
Se muestran AACpG y OACpG superpuestas (izquierda y derecha).
Aunque la metilación diferencial inducida por AA y OA
paneles, respectivamente).
no alcanzó significación en todo el genoma, un número sustancial
Tercero, análisis de anotaciones funcionales usando la parte superior
de hallazgos convergentes apoyan un significado patobiológico
150 genes clasificados por número de metilados diferencialmente
para AACpG y OACpG.
AACpG y OACpG, normalizados por el número de sondas
Primero, de acuerdo con los datos globales de metilación del ADN, un
presente en la matriz de 450K para un gen dado (N-CpG), reveló
Se observó una tendencia general a la hipermetilación inducida por AA y la
enriquecimientos significativos para el receptor acoplado a proteína G
hipometilación inducida por OA, es decir, la mayoría de
(GPCR) y vías de señalización olfativa (REACT_14797 y
AACpGs (76,4%) y OACpGs (74,7%) mostraron
hsa04740, respectivamente; Tabla complementaria 1). Por el contrario, no
hipermetilación e hipometilación dependientes de la dosis, respectivamente
Se identificaron vías de señalización para los 150 genes principales clasificados
(PD 6,7£10¡32, prueba Chi-cuadrado; fig. 3). Asimismo, el peso compuesto de
por Db (DB-CpGs) (Tabla complementaria 1). Sorprendentemente, el análisis
AACpGs hipermetilados fue mayor que
de genes funcionales de genes expresados diferencialmente entre
las contrapartes hipometiladas: la suma de Dbs entre 100
Las dosis de 100 y 1 mM de AA y OA revelaron un enriquecimiento significativo
y AA 1 mM fue 1.661,3 y ¡408,7 para los 2 conjuntos, respectivamente. Por el
de la misma vía de señalización de GPCR (FDR < 10¡4 en
contrario, el efecto neto de OACpGs fue la hipometilación, ya que la suma de
Dbs entre 100 y 1 mM OA fue ambos casos; véase el párrafo siguiente “Metilación de CpG inducida por FA
y expresión génica”). En particular, el valor promedio absoluto de Db
381,6 y ¡1.308,7 para el hiper e hipometilado
de los 150 N-AACpG y N-OACpG principales fueron »4 veces
conjunto OACpG, respectivamente. Este perfil general divergente de metilación
menor en relación con DB-AACpG y DB-OACpGs (0.042 y
del ADN incluía los 6.432 CpG comunes entre los
0,044 vs 0,174 y 0,161 en promedio, respectivamente; Tabla complementaria
conjuntos AACpG y OACpG, ya que los valores de M entre 100 y
2), nuevamente señalando pequeños pero biológicamente relevantes
Las dosis de 1 mM de FA mostraron una correlación negativa entre los 2
efectos
conjuntos (r D ¡0.14, P<10¡6 ).
Cuarto, comparamos AACpG u OACpG con un estudio
En segundo lugar, a nivel de genes, la mayoría de AACpG y OACpG se co-
abordando los efectos de PA en el metiloma de ADN de primaria
localizaron en cuerpos de genes y promotores y, al mismo tiempo, fueron
islotes pancreáticos humanos, un modelo de diabetes inducida por FA libre
notablemente divergente para la dirección de la metilación del ADN
proinflamatoria. 18 En particular, recuerda los efectos de AA en
cambio. Para todos los genes superpuestos, AACpG y OACpG mostraron
Monocitos THP-1, PA induce una hipermetilación neta del ADN
hiper e hipometilación, respectivamente, entre FA extrema
en relación con los islotes pancreáticos estimulados con BSA libre de FA solo.
dosis (P<10¡5 en todos los casos). Esta tendencia fue particularmente evidente
En una primera instancia, preguntamos si los 2 estudios compartían alguna
de genes que albergaban >50 AACpG o AOCpG/gen, que
CpG diferencialmente metilada, es decir, las AACpG y OACpG dependientes
incluida la proteína tirosina fosfatasa, tipo receptor, polipéptido N
de la dosis, y las diferencialmente inducidas por PA.
2 (PTPRN2), tipo 1 deficiente en arresto mitótico (MAD1L1), dominio PR
CpG metilados (PACpG). Sorprendentemente, a pesar de la significativa
que contiene 16 (PRDM16), tenascina-XB (TNXB), proteína reguladora
diferencias de diseño experimental entre el PA-estimulado
asociada de mTOR (RPTOR), inositol-1,4,5-trifosfato

Figura 3. - Distribución de AACpGs y OACpGs hipermetiladas e hipometiladas. Los conjuntos AACpG y OACpG se piden para aumentar Db entre los 2 extremos
dosis de FA. Las líneas discontinuas horizontales indican el Db promedio general para cada conjunto de CpG.
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EPIGENÉTICA 5

Figura 4. Ejemplos de perfiles de metilación específicos de locus de AACpG y OACpG. Los gráficos de la izquierda muestran los cambios en la metilación del ADN de AACpG (círculos sólidos) y
OACpG (cuadrados abiertos). P indica la posición y el número de mapas de CpG para los promotores. Los gráficos de la derecha muestran los valores Db de CpG comunes a los conjuntos AACpG
y OACpG en cada gen o región intergénica. Los valores P se refieren a pruebas no paramétricas no pareadas (izquierda) y pareadas (derecha) (prueba U de Mann-Whitney y prueba de Wilcoxon,
respectivamente).

modelo de islote pancreático y células THP-1 estimuladas con AA u OA,
incluida la concentración de FA (rango de 1 mM y 1–100 mM), tiempo de
incubación (48 y 24 horas) y tipo de célula (islotes pancreáticos y
monocitos THP-1), se observó una superposición del 10 al 12 % entre los
CpG. Un total de 445 CpG correspondientes a 430 genes eran comunes
a los conjuntos de datos AACpG, OACpG y PACpG (denominados
FACpG; Tabla complementaria 3). Un análisis de anotación funcional
reveló un enriquecimiento significativo para la regulación por una serie de
factores de transcripción, incluida la proteína de unión potenciadora/
CCAAT biológicamente plausible (C/EBP), a (CEBPA), un activador crítico
de genes específicos de adipocitos (FDR D 8.2£10¡7 ) y PPAR-a (FDR D
0.03), pero no el PPAR-g relacionado (FDR D 0.33).31,32 Además,
encontramos que los valores M entre AACpGs y PACpGs estaban
correlacionados positivamente (r D 0.21, PD 1.20£10¡5 ) y la mayoría
(72.8%) estaban hipermetilados en ambos conjuntos. Por el contrario, no
se observó correlación entre OACpGs y PACpGs (r D 0.08, PD 0.10) y la
mayoría (70.3%) de FACpGs eran hipo y
hiper-metilado en los 2 conjuntos, respectivamente. Además, similar a AA
y OACpG, el análisis funcional de los 150 PACpG normalizados principales
(número de CpG diferencialmente metilados dividido por el número de
sondas en la matriz de 450K) reveló un enriquecimiento en la proteína G
y las vías de transducción de señales olfativas (Tabla complementaria 1 ).
Estos datos sugirieron una divergencia funcional entre AA y PA por un
lado, y OA por otro lado con respecto a la metilación del ADN.
Las analogías entre las células THP-1 estimuladas por FA y un modelo
de inflamación pancreática plantearon la cuestión de si existen
coincidencias similares dentro de una variedad de enfermedades
humanas. Para abordar ese problema, comparamos AACpG y OACpG
con los conjuntos de datos de perfiles de metilación de ADN humano
basados en matrices de 450K que estaban disponibles hasta la fecha.
Estos conjuntos de datos cubrían una amplia gama de tipos y condiciones
de enfermedades, es decir, enfermedades metabólicas (aterosclerosis,
obesidad, diabetes tipo 2),33-35 trastornos psiquiátricos (autismo—perfil
de las áreas 10 y 24 de Brodmann—y esquizofrenia),36,37 cáncer (leucemia, carcinoma
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6 GA SILVA-MART INEZ ET AL.

carcinoma hepatocelular, sangre de pacientes con cáncer de mama),38-

41
y envejecimiento42 (Tabla complementaria 4). La inclusión de la
estudios mencionados se justifica por la relevancia general de los AF como
proveedores de energía y metabolitos biológicamente activos, y
su implicación reconocida en los trastornos psiquiátricos (revisado

en 43). Además, el análisis comparativo incluyó 450K

perfiles de metilación de ADN basados en matrices de 8 tejidos no enfermos.44 La
porción de CpG diferencialmente metilados identificados
en cada estudio, que se superpusieron AACpG o OACpG varió
entre 12-17%. Además, a pesar de las diferencias en el corte de Db entre matrices
(Tabla complementaria 4), no observamos
correlación significativa entre el grado de superposición y Db
valores de corte. Excluyendo el conjunto de datos de sangre de cáncer de mama,
que no representaba el tejido diana de la enfermedad, observamos un
superposición notablemente menor en cáncer en comparación con conjuntos de
tejidos metabólicos, psiquiátricos y normales (P<0 0.01 en todas las comparaciones,
prueba post-hoc de Scheff y; el envejecimiento no se incluyó en el análisis
dado que representaba un solo estudio). Dado que no encontramos una correlación
entre la extensión de la superposición y el número de diferencialmente
CpG metilados producidos por cada estudio (r D ¡0.12, n D 20,
PD 0.62), nuestros datos sugirieron una superposición no aleatoria a pesar de
el número relativamente alto de AACpG y OACpG. Gene
análisis de función para los 150 principales genes que albergan N-CpG
reveló un enriquecimiento significativo común en la vía de señalización de GPCR
entre los perfiles de cáncer y autismo (BA24)
(FDR<10¡2 en todos los casos), pero no en muestras de tejido normal, lo que sugiere
una especificidad biológica subyacente (en cursiva en la Tabla 1 complementaria).

A continuación, comparamos el estado de metilación de AACpG y

OACpGs al de CpGs diferencialmente metilados identificados en
tejido enfermo o normal. El análisis de agrupamiento de los niveles de metilación de
CpG (Db) promediados por gen mostró claramente que los perfiles inducidos por AA
y PA eran más similares entre sí que
a los perfiles inducidos por OA. Además, los primeros agrupados
con enfermedades metabólicas, envejecimiento y perfiles de autismo, mientras que
los perfiles específicos de cáncer, esquizofrenia y tejidos normales agrupados
lejos de los FA (Fig. 5A). Estos patrones fueron fácilmente observados
en el análisis de agrupamiento de los 50 genes principales, clasificados por el
número de CpG superpuestas (Fig. 5B). por ejemplo, el
la mayoría de los genes se hipermetilaron consistentemente después
estimulación con AA o PA pero hipometilado después de la estimulación con OA.

En quinto lugar, preguntamos si las AACpG se superponen significativamente con

un conjunto de perfiles de metilación de matriz de 450K obtenidos en humanos
lesiones ateroscleróticas aórticas de diferente gravedad histológica45.
Ese estudio identificó 1985 CpG autosómicos, que cambian significativamente su
estado de metilación con la progresión de la lesión.
(grado-CpG), principalmente por la deriva hacia la hipermetilación como
aumenta el grado de la lesión. Grade-CpGs se enriquecieron significativamente
en AACpGs, ya que 510 CpGs se superpusieron entre los 2 conjuntos y
324 mostraron la misma tendencia de metilación, en su mayoría (311 de
324) hacia la hipermetilación tanto en respuesta al aumento
Dosis de AA y con progresión de la lesión (PD 0,011 para enriquecimiento, test
hipergeométrico). Una lista de los 324 superpuestos y
Los CpG concordantes entre los 2 conjuntos se muestran en la Tabla complementaria
5.
Sexto, perfiles de metilación del ADN inducidos por AA y OA
mostró un grado de especificidad para las secuencias con específicos
firmas epigenéticas y funcionales. En cuanto a la preferencia por
Figura 5. Análisis de agrupamiento de CpG que son comunes a AACpG o OACpG o
ambos, ya los perfiles de metilación del ADN de la enfermedad y del tejido normal indicados. UN,
Agrupación general de datos. B, 50 genes principales clasificados por el número de CpG alojados
incluidos en el análisis de conglomerados. Los asteriscos indican los 11 genes principales clasificados por
el número de AACpG/gen. Rojo y azul, hipermetilación e hipometilación, respectivamente. El origen o
relación del tejido se indica para tejido no normal
muestras como sigue: Ad, tejido adiposo; Ao, aorta; Bl, sangre; hermano, cerebro; En, intestino;
Li, hígado; Papá, páncreas.
secuencias hipo o hipermetiladas, analizamos la distribución de AACpG y OACpG a
través de los valores b. Nosotros
observó un claro enriquecimiento de la inicialmente hipermetilada
grupo, es decir, a una dosis de FA de 1 mM tanto para AACpG como para
OACpGs, que era independiente de la dirección del cambio de metilación (Figura 3
complementaria). En cuanto a los compartimentos de genes y el contenido de GC,
las AACpG hipermetiladas
Machine Translated by Google
asignados preferentemente a sitios en mar abierto (es decir, >4 kb
de la isla CpG más cercana), mientras que los hipometilados
AACpG asignados preferentemente a islas CpG (PD 0,031
y PD 0.009, respectivamente, en comparación con la matriz de 450K
distribución de sonda; Figura complementaria 4). Ningún otro GPC
conjunto mostró cualquier preferencia de mapeo significativa.
En general, estos hallazgos respaldan una amplia significación biológica y
mecanismo(s) instructivo(s), en lugar de siembra al azar, para el general
comparativamente pequeño inducido por AA y OA.
Perfiles de metilación del ADN.
Metilación de CpG inducida por FA y expresión génica
Para evaluar el impacto de los cambios dependientes de la dosis en la metilación
del ADN sobre la expresión génica, se extrajo el ARN del mismo
celdas utilizadas para producir datos de matriz de 450K y analizadas usando el
Plataforma Affymetrix Human Exon 1.0 ST. Para investigar una asociación entre la
expresión y la metilación del ADN, nos enfocamos
en AACpG y OACPG que se colocalizaron en exónicos o
regiones promotoras. Para los CpG promotores y exónicos, correlacionamos
cambios dependientes de la dosis en la metilación del ADN con promedio
valores de expresión de todos los exones o la sonda de exón correspondiente,
respectivamente. Mientras que la metilación del ADN cambia en cualquier genómica
contexto mostró asociaciones tanto positivas como negativas con
transcripción, se descubrieron correlaciones dependientes del contexto;
en particular, una correlación negativa en el promotor, 50 UTR y
primer exón y una correlación positiva dentro del cuerpo del gen y
30 regiones UTR. Es importante destacar que los valores promedio de Db exónicos entre
las dosis de FA 100 y 1 mM fueron más altas de AACpG en comparación con
OACpGs (0.023 y ¡0.021, respectivamente). Dado que esto refleja
Figura 6. Efectos de los cambios dependientes de la dosis en la metilación del ADN sobre la expresión génica. A, Correlación entre 100–1 mM AA u OA Db y los niveles de expresión correspondientes
basados en matrices de expresión. B, análisis de RT-PCR de genes seleccionados después de la estimulación con AA y AO de células THP-1 durante 24 ha una concentración de 1 y 100 mM. C, expresión
normalizada de ARN de GAPDH. Las barras para cada gen indican, de izquierda a derecha: AA 1 mM, AA 100 mM, OA 1 mM, OA 100 mM, respectivamente.
EPIGENÉTICA 7
la tendencia general de todos los AACpG y OACpG, concluimos
que la metilación del cuerpo del gen se asoció más frecuentemente con
un aumento, en lugar de una disminución, en la transcripción. RT-PCR
análisis de genes que mostraron una gran cantidad de cambios opuestos
dependientes de la dosis en la metilación del ADN después de la estimulación
con AA y OA, también apoyó una tendencia a una asociación positiva entre la
metilación del cuerpo del gen y la expresión de algunos de
los genes analizados (Fig. 6B, C). Además, el gen funcional
El análisis reveló un enriquecimiento significativo en la señalización de GPCR.
(FDR<10¡4 en ambos casos), reflejando el enriquecimiento funcional
observado en los perfiles de metilación inducidos por FA (ver arriba).
Factores que median los cambios inducidos por AF en el ADN
metilación
Para explorar los posibles mecanismos subyacentes a los cambios inducidos por
AA y OA en la metilación del ADN, nos centramos en PPAR-a
y PPAR-g, dado que ambos se expresan en células THP-1 y
que los FA, o sus derivados, son ligandos conocidos de estos
receptores nucleares.46,31 Primero, debido a que los datos de anotación funcional
presentados anteriormente sugirieron un papel potencial para PPAR-a,
pero no PPAR-g en la regulación de la metilación de FACpG y, en segundo lugar,
debido al vínculo entre la vía de señalización del receptor cannabinoide de proteína
G y la vía de transcripción de PPAR-a,47,48 examinamos los efectos de los
antagonistas de PPAR-a y PPAR-g
GW6471 y GW9662, respectivamente, sobre las respuestas de metilación inducidas
por FA. GW6471, significativa y sustancialmente,
inhibió la hipermetilación global del ADN inducida por 100 mM
AA de forma dependiente de la dosis, mientras que no se observó ningún efecto
en células estimuladas con OA (Fig. 7A, B). En cuanto a GW9662,
 Machine Translated by Google
8 GA SILVA-MART INEZ ET AL.

UN 4

3.75
(%5mdC)

3.5 *
Metilación
global
ADN
del

3.25
*
3

2.75

2.5
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19
peso nulo peso nulo peso nulo
SIRT1 SIRT2 SIRT6

B
4.50

(%5mdC)
4.25

4.00
** *
3.75
**
Metilación
global
ADN
del

3.50

3.25

3.00
012101320 50 100 10 20 50 100 5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
superficialinol splitomicina TSA

Figura 7. Participación de los PPAR y la b-oxidación en el ADN global inducido por AA u OA Figura 8. Participación de las histonas desacetilasas en el ADN global inducido por AA u OA

cambios de metilación. Los monocitos THP-1 se estimularon con FA 100 mM durante 24 h cambios de metilación. A, respuesta de metilación del ADN en MEF genéticamente nula para
SIRT1, ¡2 o ¡6 (indicado como "nulo") y controles WT emparejados, estimulados con
tras 1 h de preestimulación con inhibidores de la b-oxidación (etomoxir), PPAR-a
(GW6471) o PPAR-g (GW9662). Los datos se representan como diferencia en la metilación del ADN entre células AA 100 mM u OA durante 24 h, o sin estimular (U). La significación estadística es en comparación con las celdas

estimuladas y no estimuladas con AA y AO. El correspondiente WT correspondientes. B, Efectos de los inhibidores de SIRT1 (sirtinol, splitomicina) y desacetilasas de histonas

se indica la concentración de inhibidor (mM). La significación estadística está en las comparaciones. (TSA) de amplio rango en el AA inducido por 100 mM

con células cultivadas en ausencia de cualquier inhibidor (C). La línea discontinua horizontal respuesta. Para los símbolos estadísticos y la prueba, consulte la leyenda de la Fig. 1.

indica el nivel de referencia (células no estimuladas). Para símbolos estadísticos y pruebas, consulte
leyenda de la Fig. 1.

y splitomicina, en monocitos THP-1. Ambos inhibidores llevaron a

ni las respuestas de metilación inducidas por AA ni por OA se vieron afectadas
significativamente. Carnitina palmitoiltransferasa-1 (CPT1), un
[CINVESTAV]
Descargado
mayo
2016
13:41
del
de
09
por
las
a enzima que regula la importación de transporte de AG de cadena larga
en la mitocondria, es un objetivo conocido de PPAR-a: similar a
el antagonista de PPAR-a, etomoxir, un inhibidor de CPT1, inhibió significativamente
la hipermetilación global del ADN inducida por
AA 100 mM de forma dependiente de la dosis (Fig. 7A), mientras que no
Se observó un efecto significativo de las células estimuladas con OA.
(Figura 7b).
Numerosos datos prestan apoyo a interacciones complejas
entre PPAR y sirtuinas, las últimas de las cuales también regulan
redes transcripcionales de procesos metabólicos críticos a través de sus
Actividad de histona desacetilasa dependiente de NADC.49 Para comprender si las
sirtuinas jugaron un papel en la metilación de FA
respuestas, fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) obtenidos de
Ratones sin SIRT1, SIRT2 o SIRT6 y sus respectivos
controles WT emparejados, fueron estimulados con AA 100 mM o
AA durante 24 horas. Estas sirtuinas particulares fueron elegidas debido a
su ubicación nuclear facultativa o preferencial y evidencia previa de sus funciones
reguladoras en la oxidación de AG (revisado en 49).
Es importante destacar que tanto AA como OA provocaron respuestas de metilación
en WT MEF, que fueron comparables a los observados en
células THP-1 humanas. Sin embargo, entre los mutantes analizados
Las respuestas de metilación del ADN específicas de MEF, AA y OA fueron
solo se inhibió significativamente en células nulas de SIRT1 (Fig. 8A). Como
validación adicional de la participación de SIRT1 en la hipermetilación inducida por
AA, examinamos los efectos de los inhibidores de SIRT1, sirtinol
niveles reducidos de metilación del ADN en células estimuladas con
AA 100 mM, mientras que TSA, un inhibidor general de histona desacetilasa
con una preferencia por los láseres de desacetilidad de histonas no dependientes
de NADC, no lograron provocar ningún efecto (Fig. 8B).
Discusión
Hemos descubierto distintos perfiles de metilación del ADN inducidos
por AA y OA, 2 AG insaturados generalmente conocidos por
sus propiedades proinflamatorias y antiinflamatorias,
respectivamente. Nuestro CpG global, específico de ALU e individual
datos de metilación obtenidos en varios laboratorios a lo largo de un largo
período de tiempo (ver Resultados), muestran consistentemente efectos divergentes
de los 2 FA en el rango de dosis analizado, es decir, AA y OA inducen
Hipermetilación e hipometilación del ADN, respectivamente,
tanto en células cultivadas de humanos como de ratones. Un análisis comparativo
de datos de metiloma de ADN humano disponibles públicamente, más
confirman la relevancia biológica de estos hallazgos, a pesar de la
diferentes criterios utilizados para identificar loci CpG relevantes. Los FA
proinflamatorios AA y PA inducen ADN marcadamente similar
perfiles de metilación, en comparación con los correspondientes perfiles inducidos
por OA. Sin embargo, la metilación y la expresión inducidas por FA
ambos perfiles están enriquecidos en la función de señalización de GPCR, lo que
sugiere efectos antagónicos en vías celulares comunes.
Esas similitudes se confirman aún más cuando se comparan los perfiles inducidos
por FA con los datos correspondientes específicos de la enfermedad y del tejido
normal. AA y PA se agrupan junto con metabolismo
Machine Translated by Google
enfermedades (aterosclerosis, obesidad, diabetes tipo 2), envejecimiento y
autismo. OA, por otro lado, se agrupa más débilmente con
estas últimas condiciones. Esta agrupación, por lo tanto, refleja fielmente
las distintas propiedades patobiológicas conocidas de AA y PA en
por un lado y OA por el otro. Además, varios de los
Los genes diana identificados son relevantes desde una perspectiva
nutricional y evolutiva. Por ejemplo, una suplementación de 12 semanas
con AA y DHA en babuinos se asocia con regulación a la baja de PTPRN2
en la corteza cerebral. 50 Asimismo, un
asociación entre la metilación del ADN, una variante de secuencia de
PTPRN2 y la secreción de insulina de los islotes también se ha
identificado.51 A su vez, TNXB es uno de los dos genes que muestran
polimorfismos específicos de la población asociados con la dieta
adaptación a la grasa, la leche y la carne.52 Estas asociaciones, aunque
independientes y convergentes, no son prueba definitiva de causalidad.
Además, los efectos de los AG presentados aquí son cuantitativamente
modestos, lo que refleja el cambio del 10 % o menos en los perfiles de
metilación del ADN que se detectó en respuesta a los AF, la dieta rica en grasas y entre el cáncer y los perfiles de metilación del ADN inducidos por FA
ejercicio.18,53,54 A pesar de estas limitaciones, los datos proporcionan
hipótesis comprobables para comprender mejor la regulación de la
metiloma de ADN por FA y posiblemente para mejorar la dieta
estrategias para mejorar la salud humana.
Estas comparaciones ofrecen una serie de conocimientos sobre la
relevancia fisiológica de las respuestas epigenéticas a los AF. En
el caso de la aterosclerosis humana, mostramos concordancia con 2
estudios publicados anteriormente. En primer lugar, las CpGs45 asociadas al
grado histológico están significativamente enriquecidas en AACpG. Segundo,
16 de los genes más representados en el ADN analizado
estudios de perfiles de metilación, están densamente hipermetilados en
las primeras etapas de la aterosclerosis aórtica y muestran una dirección de
cambio de metilación del ADN que es concordante con la
uno de AA y PA.33 Tanto en la aterosclerosis como en las células estimuladas
por AA, la hipermetilación es prominente dentro del cuerpo de
estos genes. En conjunto, estos datos comparativos sugieren
que una parte de la hipermetilación del ADN que caracteriza
aterosclerosis en sus fases iniciales y durante la progresión
de la lesión vascular estable,33,45 puede ser sembrado por circulación
AG proinflamatorios o sus metabolitos. Junto con la evidencia de que los
agentes hipometilantes pueden retardar la progresión de
la lesión vascular,55 nuestras observaciones pueden conducir a comprobables
estrategias nutricionales para reprogramar o salvaguardar el sistema vascular
epigenoma. En cuanto al autismo, la participación de AA en esa condición ha
sido establecida por los primeros estudios prospectivos que documentan los
efectos de las fórmulas infantiles sin AA en el autismo.
riesgo y por un estudio comparativo reciente de glóbulos rojos AA
contenido entre pacientes autistas y controles.56,57 Otro
hallazgo de nuestro estudio es la divergencia del ADN de la diabetes tipo 2
perfiles de metilación de los de AA y, en particular, PA.
Los loci hipermetilados identificados en las células estimuladas con AA y PA
muestran un parecido distante, si es que lo tienen, con los perfiles
correspondientes en la diabetes, lo que revela un conjunto de CpG que
no modelan la participación de los AG proinflamatorios libres en
diabetes. Además, mostramos que los perfiles inducidos por FA son
relativamente distantes de los tejidos específicos normales. Este resultado
se espera, ya que debido al acceso ubicuo de los FA circulantes
a órganos y tejidos, es probable que los AF generen perfiles de metilación del
ADN que representan características comunes de la mayoría de los
los epigenomas del organismo. Por cierto, nuestros hallazgos confirman
EPIGENÉTICA 9
y amplíe la observación anterior de que la sangre normal muestra un perfil de
metilación del ADN sorprendentemente único, en comparación
a los otros tejidos y enfermedades probadas.44 Además de todos estos
consideraciones, cabe señalar que la especificidad de la superposición con
una serie de estudios publicados constituye un poderoso
validación independiente de nuestros resultados basados en arreglos de 450K.
Las vías vinculadas a la b-oxidación juegan un papel fundamental en
determinación de perfiles de metilación relacionados con FA. Mostramos que
La hipermetilación del ADN inducida por AA es sensible a la inhibición de la
importación de FA a las mitocondrias y está aguas abajo de
PPAR-a y SIRT1, 2 reguladores centrales del metabolismo de los AG
y b-oxidación.48 Monocitos THP-1, en contraste con el cáncer
Las células en general, dependen más de la b-oxidación que de la glucólisis.
para la producción de energía y se ha demostrado que el AA es un sustrato
para la oxidación beta en las células THP-1.58,59 Ambas observaciones
respaldan los efectos de la inhibición de la oxidación beta en nuestras
sistema modelo. De hecho, la superposición comparativamente pequeña
puede explicarse por el efecto Warburg que establece que
Las células cancerosas producen principalmente ATP a partir de la glucólisis, incluso en
condiciones de hipoxia.60 Siguiendo esta lógica, el ADN
hipometilación observada en la diabetes es una consecuencia predecible de
la actividad mitocondrial defectuosa asociada
con esa enfermedad.61 En general, el bloqueo de la maquinaria mitocondrial
cambia rápidamente la producción de ATP a la glucólisis.
para asegurar la supervivencia celular. Suponemos que tal adaptación
tiene lugar en las células THP-1 después de la exposición al inhibidor de la b-
oxidación etomoxir, lo que sugiere que la inhibición de la hipermetilación del
ADN inducida por AA por etomoxir no da como resultado
desde el suministro reducido de ATP hasta los modificadores de la cromatina. Sobre el
Por otro lado, la respuesta de hipometilación inducida por OA es
no se ven afectados por estos inhibidores. Esto sugiere que los distintos
perfiles de metilación inducidos por AA y OA podrían relacionarse
a las diferencias específicas de FA en la oxidación-b. En efecto, tanto en
in vitro y un reciente estudio dietético in vivo en humanos muestran
que OA en relación con otras FA, como PA y EPA, es un
pobre sustrato de la b-oxidación,62-64 aunque al contrario
también se ha informado . 65 Alternativamente, los niveles aumentados
de productos de oxidación-b intermedios específicos observados en
PA- en relación con las células del músculo esquelético humano estimuladas con OA
también podría explicar parte o la totalidad de la metilación inducida por PA.
62 Aunque nuestros datos contrastan con el predominante
vista de que SIRT1 se activa únicamente en condiciones de inanición, la
regulación al alza mediada por SIRT1 independiente de NADC de
El metabolismo oxidativo se ha informado en varios otros
estudios.66-68 Finalmente, la observación de que SIRT1 participa
en la respuesta de hipermetilación del ADN inducida por AA en
MEFs, indica que la respuesta correspondiente observada
en las células THP-1 no es una célula cancerosa restringida, p53- y
Evento dependiente de MIR34a.69
La regulación específica de PPAR-a del ADN inducido por AA
metilación, presumiblemente refleja la observación de que los ácidos grasos
poliinsaturados son activadores más potentes de PPAR-a que
70
PPAR-g. La participación de PPAR-a, pero no de PPAR-g, es
apoyado además por los resultados de la anotación funcional
análisis de genes portadores de FACpG. SIRT6 también puede ser activado
por FA de cadena larga, en particular OA, y contribuye a
regulación de la b-oxidación.71,72 Sin embargo, la eliminación de SIRT6
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10 GA SILVA-MART INEZ ET AL.
en MEF no tuvo efecto sobre los cambios inducidos por FA en la metilación
del ADN.
Nuestra observación de que AA y OA participan en la formación de
metilomas de ADN específicos de enfermedades metabólicas a través de
la b-oxidación, PPAR-a y la señalización de sirtuina 1, tiene implicaciones
potenciales para la terapia y la prevención orientadas a la dieta. De hecho,
se ha argumentado que la dieta cetogénica rica en grasas y baja en
carbohidratos, que tiene éxito en el tratamiento clínico de pacientes con
errores congénitos del metabolismo y epilepsia farmacorresistente, puede
ser beneficiosa en una gama de enfermedades mucho más amplia que la
reconocida anteriormente. 73,74 Por el contrario, una dieta baja en grasas
y baja en carbohidratos puede conducir a la normalización de la función
de las células b y la resistencia a la insulina en personas con diabetes tipo
2.75 Sin embargo, si un cambio en la preferencia de sustrato hacia la
oxidación de grasas reduce o no el riesgo de enfermedad todavía es muy
debatido. Por ejemplo, la administración dietética prolongada del agonista
de PPAR-a WY 14643 se asocia con una disminución gradual de la
metilación del ADN global y LINE y de la hepatocarcinogénesis en ratones .
NB4 expuesto a una dieta alta en grasas o alta en carbohidratos,78
subraya la importancia de comprender el metabolismo energético de los
subtipos de enfermedades antes de las intervenciones dietéticas.
Además, descubrimos una correlación positiva entre la metilación del
cuerpo del gen y la expresión en las células THP-1. Esa correlación
representa el comportamiento de la mayoría, pero no de todos los genes,
lo que subraya una asociación compleja entre la transcripción y la
metilación del cuerpo del gen. Se han extraído conclusiones similares en
varios estudios de genoma completo sobre la metilación del ADN con
informes recientes que sugieren que la metilación del cuerpo génico
aumenta los niveles de expresión génica.79,80
Métodos
Cultivo de células
Los monocitos THP-1 se cultivaron en medio RPMI-1640 (Gibco)
complementado con L-glutamina 2 mM (Sigma), suero de ternero fetal al
10 % (Gibco) y penicilina/estreptomicina al 1 % (Gibco). Nunca se permitió
que las células crecieran por encima de una concentración de 1–1,5 £ 106
células/ml. Los MEF obtenidos de ratones sin SIRT1 o SIRT6 fueron un
amable obsequio del Dr. Raul Mostoslavsky (Universidad de Harvard,
Boston, EE. UU.) y la Dra. Eva Bober (MPI, Bad Nauheim, Alemania),
respectivamente. Los MEF sin SIRT2 se generaron mediante procedimientos describe en otro lugar.29,86 Sondas proximales de SNP y sondas con un
estándar a partir de ratones sin SIRT2. Los MEF WT se derivaron de
compañeros de camada de cada cepa de ratones mutantes. Las células
MEF y HEK293T se cultivaron en las mismas condiciones que los
monocitos THP-1 pero con DMEM como medio. Los FA puros (Sigma) se
conjugaron con BSA libre de FA de grado de cultivo celular (fracción V,
libre de FA, Sigma n.° 820022) para lograr una relación FA:BSA de 6:1,
esencialmente como se describe.81 Típicamente, 5–6 £ 106
las células en 10 ml de medio se estimularon con una mezcla de BSA-FA
100x en FCS al 2%. Se utilizó la exclusión de azul de tripán como criterio
de viabilidad. Los inhibidores etomoxir, GW9662, GW6471, sirtinol,
splitomicina o tricostatina A (TSA) se utilizaron en las concentraciones y
condiciones experimentales reportadas en estudios previos.82,83 Se
realizaron al menos 3 réplicas técnicas y biológicas para cada experimento,
excluyendo microarrays. experimentos
Metilación global del ADN
El ADN se extrajo de las células cultivadas mediante métodos estándar
(sistema DNeasy, Qiagen). Para medir los niveles globales de metilación
del ADN, se determinaron 5-metil-20- desoxicitidina (5mdC) y 20
-desoxiguanosina (dG) mediante un método basado en HPLC.84 Los
niveles normalizados de 5mdC se calcularon como porcentaje de edad
5mdC/dG. Cuando se indicó, la metilación global del ADN se midió
mediante el sistema MethylFlash (Epigentek). El ensayo arrojó valores de
5mdC como porcentaje de ADN de entrada cuantificado con PicoGreen
(peso/peso). Cada valor se multiplicó por 4 para obtener un valor final
comparable al obtenido por el método basado en HPLC. El ensayo
MethylFlash arrojó respuestas a AA y OA en monocitos THP-1, que fueron
consistentes con las obtenidas por la cuantificación 5mdC basada en
HPLC, excepto por los valores de referencia (células no estimuladas) que
fueron un 5% más bajos (P>0 0.05, datos correspondientes a un total de
15 y 21 experimentos, respectivamente).
Metilación repetida de ALU
La metilación del elemento ALU se determinó de acuerdo con Siriva
nichsuntorn y colaboradores.28 Brevemente, el ADN tratado con bisulfito
se amplificó mediante PCR con los cebadores específicos de ALU AluF:
50 -GGY GYG GTG GTT TAY GTT TGT AA-30 y AluR: 50 - TTA ATA
AAA ACR AAA TTT CAC CAT ATT AAC CAA AC-30 de la siguiente
manera: 95C durante 30s, 53C durante 20s (40 ciclos) y 72C durante 20s.
Posteriormente, el amplicón ALU de 117 pb se digirió durante la noche a
65 °C con TaqI (Invitrogen). Los productos resultantes, que oscilan entre
42 y 117 pb según los estados de metilación de los elementos ALU, se
separaron mediante electroforesis en gel, se tiñeron con GelRed y se
cuantificaron utilizando Image Lab (BioRad).
Matrices de metilación de ADN
Para identificar los objetivos de la metilación del ADN inducida por FA,
utilizamos la plataforma Infinium HumanMethylation450 BeadChip
(Illumina). Se agruparon tres réplicas biológicas en igual proporción para
cada concentración de FA. El agrupamiento promedia los datos de manera
efectiva y reduce el ruido.85 Se llevaron a cabo controles de calidad del
ADN, modificación con bisulfito, hibridación, normalización de datos con el
software GenomeStudio (Illumina) y cálculo del valor Beta como se
valor P de detección >0.05, es decir, no estadísticamente diferente del
fondo, se descartaron como se informó.45 El nivel de metilación para cada
citosina, expresado como un valor b, se calculó como la relación de
intensidad de fluorescencia de las versiones metiladas y no metiladas. de
cada sonda. Los valores beta variaron entre 0 (no metilado) y 1 (metilado).
Los valores b transformados logit (valores M) se usaron en las pruebas
estadísticas a menos que se indique lo contrario.87 Los valores b o Db se
usaron para la descripción de los datos, debido a su naturaleza más
intuitiva. La anotación relativa a islas CpG (CGI) utiliza la siguiente
nomenclatura: “orilla”, cada una de las secuencias de 2 kb que flanquean
un CGI; “estante”, cada una de las secuencias de 2 kb junto a una orilla; "mar abierto,"
ADN no incluido en costas, plataformas o CGI.29 TSS200 o TSS1500
indican la región entre la posición ¡200 pb o ¡1500 pb y el sitio de inicio de
la transcripción (TSS), respectivamente.
Machine Translated by Google
Cuando una citosina se mapeó en diferentes elementos génicos debido a la
presencia de múltiples transcritos alternativos, se contaron todas las variantes
de mapeo. La anotación de genes funcionales se analizó con la herramienta
DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/). Se puede acceder a los datos de matriz de
450K en Gene Expression Omnibus88 de NCBI con el número de acceso
GSE67331. Los datos de matriz de metilación de ADN de CpG seleccionados se
validaron mediante pirosecuenciación (Pyro Mark Q96 ID, Qiagen). Las
secuencias de los cebadores de pirosecuenciación se muestran en la Tabla
complementaria 6.
Matrices de expresiones
La expresión del genoma se analizó mediante matrices Human Exon 1.0 ST
(Affymetrix) y utilizamos el software Affymetrix Expression ConsoleTM (versión
1.3) y el algoritmo Robust Multichip Aver age (RMA) para normalizar y analizar
los datos de la matriz. La biblioteca utilizada fue HuEx-1_0-st-v2.r2.pgf con el
conjunto de sondas HuEx-1_0-st-v2.r2.dt1.hg18.extended.mps (nivel de gen) y
HuEx-1_0-st-v2. r2.dt1.hg18.full.mps (nivel de exón). Se puede acceder a los
datos de la matriz de expresión en Gene Expression Omnibus88 de NCBI
con el número de acceso GSE57076. La validación de los objetivos seleccionados
se realizó mediante PCR semicuantitativa normalizada a niveles de expresión de
GAPDH.
Estadísticas
Se realizó la prueba de Kruskal-Wallis para probar las diferencias en
los niveles de metilación del ADN entre tratamientos o dosis para
variables continuas. Si la comparación general era significativa, las
muestras se volvían a analizar mediante ANOVA seguido de la
prueba post-hoc de Scheff e para identificar diferentes grupos
específicos. Al comparar 2 grupos, la prueba U de Mann-Whitney
(muestras no apareadas) o la prueba de Wilcoxon (muestras
apareadas). Se aplicó la prueba de Chi-cuadrado para comparar
porcentajes. Las correlaciones se probaron calculando el coeficiente
de correlación de Pearson y el valor de p asociado. Las pruebas se
realizaron con el software Statistica (StatSoft) o las herramientas
estadísticas de Excel (Microsoft Office 2011 para Macintosh). La
importancia del enriquecimiento de CpG se estimó con la prueba
hipergeométrica usando una herramienta en línea (www.geneprof.org/GeneProf/tools/hypergeometric.jsp).
Divulgación de posibles conflictos de interés
No se revelaron posibles conflictos de intereses.
Expresiones de gratitud
Agradecemos a los Dres. Holger Heyn y Anna Marazuela-Duque por sus consejos
y asistencia; Al Dr. Luis Delaye y Alejandro González por permitirnos el acceso a su
instalación de clúster de cómputo (financiado por el Consejo para la Ciencia y la
Tecnología del Estado de Guanajuato (CONCyTEG), proyecto “Laboratorio de apren
dizaje e investigaci on en computo biol ogico LAICBIO” no. GTO-2012-C02-187442).
Este trabajo fue financiado generosamente por: Beca CONCyTEG núm.
08-03-K662-020-A01, Consejo Mexicano de Ciencia y Tecnología (CON ACyT)
Beca de Ciencias Básicas (Ciencia B asica) no. 83401 a GL; Becas Sabáticas
CONACyT no. 166209 a GL y no. 166058 a SZ; CONACyT Doctorado Beca no.
334370 a GAS-M; el Ministerio de Economía y Competitividad de España (MINECO)
otorga SAF2011-25619 a AV
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