LMMMIy F

Facultad de Farmacia
Imagen alusiva al manual correspondiente
Laboratorio Modular
de Microbiología
Médica, Inmunología
y Farmacología
(LMMIyF)
[5° semestre]
Universidad Autónoma del Estado de Morelos

2 LMMMIF
CONTENIDO
Contenido
Contenido ...................................................................................................................................................................2
Introducción. ............................................................................................................................................................ 10
Organización del Laboratorio: ................................................................................................................................. 11
Rubrica para reportes de laboratorio ....................................................................................................................... 11
Reglas de Laboratorio ...................................................................................................................................... 15
Reglas ADICIONALES AL LABORATORIO DE microbiología y parasitología ................................................... 16
Medidas de Seguridad ..................................................................................................................................... 17
PRACTICA 1: TOMA DE MUESTRA HUMANA E IDENTIFICACIÓN. .............................................................. 18
PARTE 1 HEMOCULTIVO .................................................................................................................................. 18
Objetivos:.......................................................................................................................................................... 18
Competencias:.................................................................................................................................................. 18
Introducción: ..................................................................................................................................................... 18
Actividades Preliminares: ................................................................................................................................. 19
Material y reactivos: ......................................................................................................................................... 19
Toxicologìa: ...................................................................................................................................................... 20
METODOLOGÍA: .............................................................................................................................................. 21
Resultados:....................................................................................................................................................... 23
Manejo ESPECÍFICO de residuos generados ................................................................................................. 24
DISCUSIÓN de resultados: .............................................................................................................................. 24
Conclusiones: ................................................................................................................................................... 24
BIBLIOGRAFÍA:................................................................................................................................................ 24
PRACTICA 2: TOMA DE MUESTRA HUMANA E IDENTIFICACIÓN. PARTE 1 COPROCULTIVO ............. 26
Objetivos:.......................................................................................................................................................... 26
Competencias:.................................................................................................................................................. 26
Manual del Laboratorio Modular de … 3
Introducción: ..................................................................................................................................................... 26
Toxicologìa: ...................................................................................................................................................... 28
METODOLOGÍA: .............................................................................................................................................. 29
Resultados:....................................................................................................................................................... 32
Conclusiones: ................................................................................................................................................... 34
BIBLIOGRAFÍA:................................................................................................................................................ 34
PRACTICA 3: TOMA DE MUESTRA HUMANA E IDENTIFICACIÓN. PARTE 2 EXUDADO FARÍNGEO Y

NASAL ................................................................................................................................................................. 35
Objetivos:.......................................................................................................................................................... 35
Competencias:.................................................................................................................................................. 35
Introducción: ..................................................................................................................................................... 35
Toxicologìa: ...................................................................................................................................................... 37
METODOLOGÍA: .............................................................................................................................................. 37
Resultados:....................................................................................................................................................... 40
Conclusiones: ................................................................................................................................................... 48
BIBLIOGRAFÍA:................................................................................................................................................ 48
PRACTICA 4: TOMA DE MUESTRA HUMANA E IDENTIFICACIÓN. PARTE 3 UROCULTIVO ..................... 49
Objetivos:.......................................................................................................................................................... 49
Competencias:.................................................................................................................................................. 49
4 LMMMIF
Introducción: ..................................................................................................................................................... 49
Toxicologìa: ...................................................................................................................................................... 51
METODOLOGÍA: .............................................................................................................................................. 51
Resultados:....................................................................................................................................................... 55
Candida albicans .............................................................................................................................................. 57
Escherichia coli................................................................................................................................................. 57
Aerobacter ........................................................................................................................................................ 57
Paracolon ......................................................................................................................................................... 57
Conclusiones: ................................................................................................................................................... 58
BIBLIOGRAFÍA:................................................................................................................................................ 58
PRACTICA 5: MANEJO DE ANIMALES DE LABORATORIO .......................................................................... 59
Objetivos:.......................................................................................................................................................... 59
Competencias................................................................................................................................................... 59
Introducción: ..................................................................................................................................................... 60
Toxicologìa: ...................................................................................................................................................... 63
METODOLOGÍA: .............................................................................................................................................. 63
Resultados:....................................................................................................................................................... 65
Conclusiones: ................................................................................................................................................... 66
BIBLIOGRAFÍA:................................................................................................................................................ 66
PRACTICA 6: INMUNIZACIÓN DE ROEDORES ............................................................................................... 67
Objetivos:.......................................................................................................................................................... 67
Competencias:.................................................................................................................................................. 67
Introducción: ..................................................................................................................................................... 67
Toxicologìa: ...................................................................................................................................................... 69
METODOLOGÍA: .............................................................................................................................................. 70
Resultados:....................................................................................................................................................... 71
Conclusiones: ................................................................................................................................................... 72
BIBLIOGRAFÍA:................................................................................................................................................ 72
PRACTICA 7: FARMACOCINÉTICA ADME ...................................................................................................... 74
Objetivos:.......................................................................................................................................................... 74
Competencias:.................................................................................................................................................. 74
Introducción: ..................................................................................................................................................... 74
Material y reactivos:c ........................................................................................................................................ 76
Toxicologìa: ...................................................................................................................................................... 77
METODOLOGÍA: .............................................................................................................................................. 78
Resultados:....................................................................................................................................................... 78
Conclusiones: ................................................................................................................................................... 79
BIBLIOGRAFÍA:................................................................................................................................................ 79
PRACTICA 8: VÍAS DE ADMINISTRACIÓN ...................................................................................................... 80
6 LMMMIF
Objetivos:.......................................................................................................................................................... 80
Competencias:.................................................................................................................................................. 80
Introducción: ..................................................................................................................................................... 80
Toxicologìa: ...................................................................................................................................................... 82
METODOLOGÍA: .............................................................................................................................................. 83
Resultados:....................................................................................................................................................... 85
Conclusiones: ................................................................................................................................................... 86
BIBLIOGRAFÍA:................................................................................................................................................ 86
PRACTICA 9: ABSORCIÓN DE FÁRMACOS Y PH. ......................................................................................... 87
Objetivos:.......................................................................................................................................................... 87
Competencias:.................................................................................................................................................. 87
Introducción: ..................................................................................................................................................... 88
METODOLOGÍA: .............................................................................................................................................. 90
Resultados:....................................................................................................................................................... 91
resultados: ........................................................................................................................................................ 92
Discusión: ......................................................................................................................................................... 93
Conclusiones: ................................................................................................................................................... 94
BIBLIOGRAFÍA:................................................................................................................................................ 94
Practica 10 “Influencia del ph en la eliminación de fármacos” .................................................................... 95
Objetivos:.......................................................................................................................................................... 95
Competencias:.................................................................................................................................................. 95
Introducción: ..................................................................................................................................................... 95
Toxicologìa: ...................................................................................................................................................... 97
METODOLOGÍA: .............................................................................................................................................. 97
Resultados:....................................................................................................................................................... 99
DISCUSIÓN de resultados: ............................................................................................................................ 101
Conclusiones: ................................................................................................................................................. 101
BIBLIOGRAFÍA:.............................................................................................................................................. 101
PRACTICA 11: DOT BLOT ............................................................................................................................... 103
Objetivos:........................................................................................................................................................ 103
Competencias:................................................................................................................................................ 103
Introducción: ................................................................................................................................................... 103
Actividades Preliminares: ............................................................................................................................... 104
Material y reactivos: ....................................................................................................................................... 105
Toxicologìa: .................................................................................................................................................... 106
METODOLOGÍA: ............................................................................................................................................ 106
Resultados:..................................................................................................................................................... 108
Manejo ESPECÍFICO de residuos generados ............................................................................................... 108
Conclusiones: ................................................................................................................................................. 109
BIBLIOGRAFÍA:.............................................................................................................................................. 109
PRACTICA 12: INMUNOELECTROTRANSFERENCIA (WESTERN BLOT) .................................................. 110
Objetivos:........................................................................................................................................................ 110
Competencias:................................................................................................................................................ 110
Introducción: ................................................................................................................................................... 110
8 LMMMIF
Toxicologìa: .................................................................................................................................................... 113
METODOLOGÍA: ............................................................................................................................................ 113
Resultados:..................................................................................................................................................... 117
Conclusiones: ................................................................................................................................................. 118
BIBLIOGRAFÍA:.............................................................................................................................................. 118
PRACTICA 13: ENSAYO INMUNOLÓGICO LIGADO A UNA ENZIMA: ELISA ............................................. 119
Objetivos:........................................................................................................................................................ 119
Competencias:................................................................................................................................................ 119
Introducción: ................................................................................................................................................... 119
Toxicologìa: .................................................................................................................................................... 123
METODOLOGÍA: ............................................................................................................................................ 124
Resultados:..................................................................................................................................................... 125
Conclusiones: ................................................................................................................................................. 125
BIBLIOGRAFÍA:.............................................................................................................................................. 126
PRACTICA 14 VIRUS PRIMERA PARTE......................................................................................................... 127
INOCULACIÓN DE EMBRIONES DE POLLO ................................................................................................. 127
Objetivos:........................................................................................................................................................ 127
Competencias:................................................................................................................................................ 127
Introducción: ................................................................................................................................................... 127
Material y reactivos:c ...................................................................................................................................... 131
Toxicologìa: .................................................................................................................................................... 133
METODOLOGÍA: ............................................................................................................................................ 134
Resultados:..................................................................................................................................................... 139
Conclusiones: ................................................................................................................................................. 141
BIBLIOGRAFÍA:.............................................................................................................................................. 141
PRACTICA 15: VIRUS SEGUNDA PARTE LAVADO Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIAL PARA CULTIVO
DE TEJIDOS ...................................................................................................................................................... 144
Objetivos:........................................................................................................................................................ 144
Competencias:................................................................................................................................................ 144
Introducción: ................................................................................................................................................... 144
Toxicologìa: .................................................................................................................................................... 150
METODOLOGÍA: ............................................................................................................................................ 151
Resultados:..................................................................................................................................................... 152
Conclusiones: ................................................................................................................................................. 153
BIBLIOGRAFÍA:.............................................................................................................................................. 153
PRACTICA 16: VIRUS TERCERA PARTE CULTIVO PRIMARIO DE EMBRIOM DE POLLO

(FIBROBLASTOS) ............................................................................................................................................ 154
Objetivos:........................................................................................................................................................ 154
Competencias:................................................................................................................................................ 154
10 LMMMIF
Introducción: ................................................................................................................................................... 155
Toxicologìa: .................................................................................................................................................... 156
METODOLOGÍA: ............................................................................................................................................ 157
Resultados:..................................................................................................................................................... 159
Conclusiones: ................................................................................................................................................. 159
BIBLIOGRAFÍA:.............................................................................................................................................. 161
INTRODUCCIÓN.
El Manual de Laboratorio Modular LMMMIyF está integrado por dieciséis prácticas, las cuáles
están conformadas por prácticas relacionadas al área de Microbiología Médica, Inmunología y
Farmacología.
El objetivo de este manual es proporcionar al estudiante de la Licenciatura en Farmacia las
herramientas necesarias para su desarrollo profesional.
ORGANIZACIÓN DEL LABORATORIO:
Para realizar las prácticas correspondientes al LMMIyF, al inicio del ciclo escolar, el docente
responsable, entrega el encuadre de la asignatura, en dónde, se integran a los estudiantes
inscritos en equipos de cuatro integrantes. Se proporcionan a los estudiantes las reglas para
trabajar dentro del laboratorio. También se le proporciona al estudiante los criterios de
evaluación de la Unidad de Aprendizaje de LMMMIyF.
RUBRICA PARA REPORTES DE LABORATORIO
Observaciones
Apartado Valor Características Necesarias
✓ Nombre y logotipo de UAEM y FF

✓ Nombre del laboratorio
✓ No. De Práctica
✓ Título de Practica
Portada 0.5 ✓ Grado y Grupo
✓ Nombre del equipo
✓ Nombre de los integrantes del
equipo
✓ Nombre del Profesor (es)
✓ Fecha.
✓ No menor a una cuartilla.
 No es válido
✓ No mayor de tres cuartillas.
comenzar con
✓ Debe contener en texto corrido, la
“La práctica fue
importancia de realizar la práctica,
importante
conceptos fundamentales para
Introducción 1.0 porque…”
entender la misma.
 No Rincón del
✓ Fundamentos químicos de las
vago
pruebas a realizar (ejemplo,
 No
Tinción de Gram, Azul de metileno,
monografías.com
Pruebas Bioquímicas, etc.)
12 LMMMIF
✓ Con Bibliografía actualizada y  No yahoo

confiable respuestas
 No tareas. com
 No Wikipedia
❖ Es decir lo que se
realizó en primer
lugar, luego en
✓ Descritos en orden cronológico
Métodos 0.5 segundo lugar y
✓ Escribiendo el nombre del método
así
utilizado
sucesivamente
❖ No diagrama de
flujo
Tablas: Nombre de la
✓ Descritos en orden cronológico tabla arriba de la misma
✓ Con correspondencia entre los
Resultados 1 títulos de los métodos Figura: Nombre de la
✓ Con Imágenes, Tablas , Gráficos
figura debajo de la
y/o figuras correspondientes
misma
✓ No menos de una cuartilla.

✓ No más de tres cuartillas
Discusión 3 ✓ Comparar Resultados con
bibliografía Actualizada y de
fuentes confiables.
 No es valido “ La
✓ No mayor de 10 renglones.
práctica me
✓ Relacionada al objetivo de la
Conclusiones 3 gusto”
Práctica , a los resultados
 “Salió bonita”
obtenidos y a las fuentes de
 “Fue como dijo
información consultada.
la maestra”
Queda estrictamente
✓ Obligatoria, mínimo 3. prohibido entregar su

✓ En formato APA 6th
reporte:
Bibliografía 1
 Mentir en las
referencias, de
lo contrario se le
reprobará en la
práctica
 Con referencias
de páginas web
no autorizadas
 Sin referencias
 Con referencias
que no
correspondan al
área.
 Si el reporte
presenta
alguno de los
puntos
anteriores se
les quitarán 3
puntos en su
calificación.
En caso de que algún integrante del equipo no haya cumplido con la asistencia al 100% de cada
una de las prácticas de laboratorio, el estudiante tendrá que hacer entrega de la solicitud para
entrega de reporte de prácticas, que se presenta a continuación.
Cuernavaca Morelos a _____ de _________del _______
14 LMMMIF
Asunto: solicitud para entrega de reporte de prácticas
Nombre completo del Docente
Profesor de Laboratorio de Microbiología Médica, Microbiología y Farmacología.
Presente.
Nombre del docente, sirva este medio para afirmar que mis compañeros (nombre de
cada uno de los integrantes del equipo) estuvieron de acuerdo en que, el que suscribe (nombre
de alumno que faltó) tomara parte de la redacción del reporte de la práctica titulada (Nombre
de la práctica), que se realizó los días (fechas), de los cuales no asistí el día (fecha), como
consta en el justificante anexo.
Entiendo y estoy de acuerdo en que el no haber estado presente en la totalidad de la

práctica mencionada me hace acreedor a una sanción de 2 puntos sobre la calificación obtenida
en el reporte.
Sin otro particular por el momento quedo de usted para cualquier aclaración.
Nombre y Firma Nombre y Firma de los

del alumno integrantes del equipo que
faltista si asistieron.
REGLAS DE LABORATORIO
1. El laboratorio será solo para los fines académicos señalados en los planes y programas
de estudio.
2. Cada sesión iniciará a la hora indicada y no se permitirá el acceso 10 minutos después
de dicha hora.
3. Por razones de seguridad TODA persona, sin excepción, que trabaje en el laboratorio
deberá
i. Portar debidamente bata blanca de manga larga y hasta la rodilla, de
preferencia de algodón, limpia y bien abotonada.
ii. Zapatos cerrados de piel.
iii. Calcetines (No tines).
iv. Ingresar al laboratorio:
1. Sin rímel.
2. Con cabello recogido.
3. Sin aretes largos.
4. Uñas cortas.
5. Uñas sin pintar.
6. Sin pulseras.
7. Sin reloj.
8. Sin anillos.
9. Sin gorras o cualquier otra prenda demasiado holgada.
4. Los alumnos que incumplan en el punto tres, se harán acreedores a la
preparación/inactivación de material, (primera vez), entrega de trabajos extra, o puntos
menos en calificación parcial/final, dependiendo del caso.
5. Al inicio del ciclo escolar, el alumno deberá haberse vacunado contra la hepatitis B y
contra el tétanos.
6. Queda estrictamente prohibido, fumar, ingerir alimentos o bebidas y el uso de celulares,
dentro del laboratorio. Los alumnos que incumplan este punto seis, se harán acreedores
a la preparación/inactivación de material, (primera vez), entrega de trabajos extra, o
puntos menos en calificación parcial/final, dependiendo del caso.
7. Queda prohibido, sentarse en las mesas de trabajo, jugar o hacer uso inadecuado de
las instalaciones, las llaves de paso de agua o aire y gas y en general con el equipo y
material de laboratorio.
8. En todo momento, el alumno deberá guardar respeto para sus profesores, compañeros,
personal administrativo y de intendencia. Cualquier acción de rebeldía destrucción o
vandalismo dentro de los laboratorios será sancionada.
16 LMMMIF
9. Se expulsará del laboratorio a los alumnos que no guarden el comportamiento debido.

10. Todos los objetos personales deben ser guardados bajo las mesas de trabajo, las cuales
deberán mantenerse limpias y libres de objetos y equipo innecesario para evitar
accidentes.
11. En caso de algún incidente o contingencia, acudir siempre al profesor responsable de la
materia y del laboratorio para tomar las medidas necesarias pertinentes bajo su
vigilancia.
12. El material y equipo del laboratorio usado en la práctica deberá devolverse limpio y seco,
y en condiciones óptimas una vez terminada la misma, INCLUYENDO EL
MICROSCOPIO. El alumno que no cumpla con esta regla será suspendido de la
siguiente práctica. Una vez devuelto el material en las condiciones en las que les
proporcionó se le entregará la credencial al alumno.
13. El material y equipo de laboratorio roto, deteriorado o extraviado por los alumnos, deberá
reponerse, repararse y/o cubrir su costo total vigente de acuerdo con el proveedor y a la
coordinación del laboratorio, sin excusa en un plazo no mayor a ocho días naturales por
el responsable directo o por el grupo de trabajo que efectuó la práctica o en su defecto
por todo el grupo a juicio del profesor y del coordinador del laboratorio.
14. Todos los desechos sólidos tales como papel, tela o plástico que tengan RESIDUOS
PELIGROSOS BIOLÓGICO-INFECCIOSOS, (R.P.B.I) como torundas, gasas, algodón,
vendas, tela adhesiva, abate lenguas, guantes quirúrgicos, jeringas sin aguja, etc.
Deberán ser depositados estricta y exclusivamente en las bolsas rojas establecidas para
tales fines en los recipientes correspondientes.
15. Los alumnos deberán lavarse las manos con detergente al concluir el trabajo.
REGLAS ADICIONALES AL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y

PARASITOLOGÍA
16. Para tener derecho de ingresar a cada práctica cada uno de los alumnos deberán
haber contestado el cuestionario correspondiente dicha sesión (en g-mail).
17. Las prácticas se entregarán de manera individual en folder de color previamente
establecido por el docente.
18. Los reportes de las prácticas se entregan 8 días después de haberlas terminado.
19. Con la finalidad de que el alumno pueda entregar el reporte de su práctica éste
deberá cumplir con los siguientes requisitos
i. Entregar el tiempo, forma y en el folder correspondiente la práctica
a la profesora del curso.
ii. Haber asistido al menos al 50 % de las sesiones prácticas del
laboratorio (Cuando la práctica se lleve a cabo en más de una sesión)
En caso de anexar al reporte el justificante de inasistencia, firmado por
el responsable y el formato anexo correspondiente. El alumno que no
haya asistido a la realización de la práctica, se hará acreedor a una
sanción del 20% de la calificación obtenida en el reporte. En caso de no

contar con la documentación anterior, el alumno tendrá una calificación
de 0 en la práctica en la que no cumplió el 100% de asistencia.
20. En caso de entregar el reporte de la práctica en un formato diferente o en folder
de diferente color, la práctica no se evaluará y el equipo tendrá una calificación
de cero, en esa práctica.
21. En ningún caso se recibirán reportes a destiempo.
22. En el reporte de práctica se restará 1 punto por cada 10 errores
ortográficos detectados en los reportes de laboratorio.
23. La profesora de Laboratorio se reserva el derecho de bajar puntos, dejar
trabajos extra o reprobar a los alumnos que infrinjan el presente reglamento.
24. La bibliografía recomendada se encuentra en el manual de prácticas.
25. Queda estrictamente prohibido escuchar música, usar la computadora, o
cualquier dispositivo electrónico durante el tiempo que el alumno permanezca
en el Laboratorio Modular de Microbiología Médica, Inmunología y Farmacología.
(a menos que el profesor lo autorice).
26. Los alumnos son responsables de traer.
a. Jabón líquido para lavar las mesas
b. Jabón líquido para lavar manos
c. Franela para limpiar
d. Plumones indelebles para vidrio
e. Encendedor o cerillos
f. Portaobjetos
g. Cubreobjetos
h. Encendedor o cerillos
i. Alcohol y Lysol
j. Sanitas
k. Asa bacteriológica
l. Cubrebocas
m. Cofia personal
27. El presente reglamento deberá imprimirse en cada uno de los manuales de
los alumnos de la materia.
28. Cualquier punto no regulado en el presente reglamento se resolverá a
criterio del profesor de laboratorio.
MEDIDAS DE SEGURIDAD
Las generales para efectuar las pruebas de microbiología.
18 LMMMIF
PRACTICA 1: TOMA DE MUESTRA HUMANA E IDENTIFICACIÓN.
PARTE 1 HEMOCULTIVO
OBJETIVOS:
El alumno identificará cuales son las infecciones habitualmente diagnosticadas por medio
del hemocultivo.
El alumno se familiarizará con los métodos de aislamiento e identificación presuntiva de los
agentes etiológicos de la septicemia.
El alumno aprenderá a interpretar los hallazgos reportados de un hemocultivo.
COMPETENCIAS:
− Realiza e interpreta análisis moleculares y bioquímico-clínicos, en función de la

problemática y necesidades de los sistemas de salud, para contribuir en la prevención,
diagnóstico, tratamiento y rehabilitación de la enfermedad.
− Comprender las características fisicoquímicas y biológicas de las biomoléculas, que se

presentan en condiciones fisiológicas y patológicas. Aplicar los conocimientos adquiridos
para coadyuvar en el diagnóstico clínico o establecer mecanismo de acción; así como
favorecer el desarrollo de un nuevo fármaco o medicamento. Realiza e interpreta análisis
moleculares y bioquímicos, en función de la problemática y necesidades de los sistemas
de salud, para contribuir en la prevención, diagnóstico, tratamiento y rehabilitación de
la enfermedad.
INTRODUCCIÓN:
En numerosas enfermedades, los agentes infecciosos pasan a la sangre y producen septicemia

o bacteremia. El hallazgo de estos agentes por hemocultivo proporciona un dato importante en
los padecimientos infecciosos.
Del éxito que el laboratorio tiene en el aislamiento depende el apego que se tenga a la técnica
y a la asepsia, que en este caso deben extremarse. Se recomienda que se tome la muestra
antes de iniciar todo tratamiento con antibióticos, en el período febril y los más cerca del principio
clínico de la enfermedad, así es como se obtendrá el mayor éxito, de allí en adelante la
frecuencia de positividad desciende progresivamente durante el curso de la
infección.REFERENCIAS Nota, la introducción debe tener entre 1 y 1.5 cuartillas
ACTIVIDADES PRELIMINARES:
[Introduzca sugerencias sobre actividades que el alumno deba llevar a cabo antes del día de
ejecución de la práctica, con la finalidad de que el alumno adquiera los conocimientos básicos
y fundamentales para una buena realización de práctica, por ejemplo: páginas web, videos o
links que puede investigar, cuestionarios o tareas específicas a resolver, etc.]
MATERIAL Y REACTIVOS:
CANTIDAD MATERIAL CANTIDAD REACTIVOS
Solución de
1 Incubadora 100 ml merthiolate 1:10
000 ó tintura de
yodo
1 Kit para Tinción
Microscopio 1
de Gram
1 Aguja calibre estéril
Jeringa estéril de 10
1
ml
Par de guantes
1
desechables
20 LMMMIF
Caldo de soya
tripticasa con 15 a
50 ml 30% de sacarosa y
0.5% de polianetol
sulfato sódico
Caldo Thiol para
50 ml
anaerobios
1 Caja de Petri con Agar

EMB
Caja de Petri con Agar
1
Sangre
1
SIM
1
surraco
1
Kliger
1
sabouraud
TOXICOLOGÌA:
[LA TOXICOLOGÍA PUEDE CONSIDERARSE COMO UNA ACTIVIDAD PRELIMINAR, Y

SER UNA TAREA ENCOMENDADA PARA LOS ESTUDIANTES DENTRO DE CADA
SESIÓN, SI ASÍ SE DESEA PLANTEAR]
[NOMBRE DEL COMPUESTO]:
Propiedades Físicas y Químicas Generales:
[Introduzca generalidades como formula química, estado físico, punto de fusión, punto de
ebullición, clasificación (ácido, base, sal, reactivo redox, solvente, etc.)]
Riesgos a la salud:
[Introduzca los principales riesgos a la salud: inhalación, digestión, contacto piel y ojos]
Primeros Auxilios:
[Introduzca los primeros auxilios en caso de: inhalación, digestión, contacto piel y ojos]
METODOLOGÍA:
I. Toma de muestra sanguínea:

1. Revisar las venas del pliegue del codo y seleccione la que está más accesible para efectuar
la venopunción.
2. Verificar que el émbolo de la jeringa no se trabe (esto sin romper el empaque que la
contiene), asegurar la aguja con su capuchón para que no se separe.
3. Con una torunda limpie perfectamente con mertiolate o con tintura de yodo y alcohol la región
donde se hará la punción.
4. Colocar una ligadura a unos 10 cm arriba del sitio de punción, sin hacer mucha presión.
5. Solicitar al paciente que cierre el puño de modo que las venas se distingan y se pueda
puncionar.
6. Romper el empaque de la jeringa delante del paciente y mencionarle que el material que se
va a utilizar es nuevo y desechable.
7. Quitar el capuchón de la aguja.
8. Introducir la aguja con el bisel hacia arriba en la vena en un ángulo de 15°. Cuando aparezca
una gota de sangre en el interior del portaaguja, jalar el émbolo de la jeringa lentamente
hasta completar la cantidad de sangre deseada.
9. Retirar la ligadura en cuanto empiece a fluir sin dificultad la sangre.
10. Retirar firmemente la aguja del sitio de punción y con otra torunda limpia aplicar presión
sobre el sitio puncionado.
22 LMMMIF
11. Solicitar al paciente que mantenga flexionado el brazo por lo menos 5 minutos.
12. Afloje los tapones de rosca de las botellas que tienen los medios de cultivo.
13. Verter la muestra extraída por las paredes de las botellas.
14. Etiquetar con los datos completos del paciente las botellas que tienen los medios de cultivo.
II. Proceso de la muestra

1. Obtener 10 ml de sangre venosa
2. 5 ml se añaden al caldo tripticasa con sacarosa y 5 ml al caldo thiol.
3. Incubar las botellas que contienen los medios de cultivo durante 7 días a 37°C.
4. Después del tiempo de incubación realizar el resembrado de los microorganismos en los
medios de cultivo correspondientes como se indica en el cuadro 1, incubar las cajas con
medio de cultivo a 37°C por 24 a 48 hrs.
5. Realizar frotis; según el resultado obtenido, prosiga la identificación según las instrucciones
del cuadro 1.
6. Los hemocultivos, principalmente en casos de brucelosis, deben examinarse cada 24 horas
y no se deben desechar hasta después de 30 días, antes de eliminar los cultivos, haga frotis
y siembre nuevamente en agar sangre. Sin embargo, la mayor parte de las investigaciones
actuales coinciden en que bastan dos subcultivos, uno a las 24 h y otro a los siete días y
que no se justifica un tercer subcultivo al término de 14 días o más de los medios que no
tengan desarrollo bacteriano aparente.
7. En casos de endocarditis o cualquier otro tipo de septicemia se recomienda hacer cuatro
hemocultivos como máximo en un día y ocho en dos días si el paciente ha recibido
antibióticos durante las 48 h previas.
8. La sangre se coloca en recipientes que contienen 50 ml de medio líquido, así la muestra
queda diluida al 10% aproximadamente.
9. En casos de septicemia por Gram negativos, es importante la rápida iniciación de la
terapéutica, en este caso, la extracción de las cuatro muestras de sangre (20 ml) puede
realizarse en dos venipunturas separadas (10 ml en cada una); se inoculan dos recipientes
con medio para cultivo aeróbico (5 ml en cada una) y dos recipientes con medio para cultivo
anaeróbico.
RESULTADOS:
TABLAS DE RESULTADOS
Medio de Especie Crecimiento Apariencia Apariencia

cultivo Bacteriana del del medio de
crecimiento cultivo.
Agar EMB
Agar Sangre
Agar
Sabouraud
Pruebas Bioquímicas
TINCIÓN DE MOVILIDAD SIM KLIGER SURRACO

GRAM
24 LMMMIF
VALORES NORMALES:
Negativo.
MANEJO ESPECÍFICO DE RESIDUOS GENERADOS
[Introduzca las especificaciones para el tratamiento de los residuos generados por la

metodología realizada]
DISCUSIÓN DE RESULTADOS:
Para ayudar a redactar la discusión de resultados, responde el siguiente cuestionario.

1. ¿En qué casos está indicado realizar un hemocultivo?
2. ¿Por qué las muestras deben tomarse antes de iniciar un tratamiento con antibióticos?
3. Escriba cuál es la diferencia entre Septicemia y Bacteremia.
4. Explique el significado clínico de cada uno.
5. ¿Cuáles son los patógenos encontrados con mayor frecuencia en sangre?
6. ¿Cuáles son las venas de elección para una extracción de sangre en bebes, niños, adultos
y pacientes geriatricos?
CONCLUSIONES:
Concluya con base en los objetivos planteados y las competencias adquiridas
BIBLIOGRAFÍA:
Colini, L. y Kaufman, H.: Science (N.Y.) 131:604-605, 1960.
Cuze, L.B.: Micxrobio. Protoplasts, Spheroplasts and L. forms, The Williams and Wilkins Co.,
1968.
Rosner, R.: A cuantitative evaluation of three blood culture system, Amer. J. Clin. Path.
57:220-227, 1972.
Sonnenwirth, A.C. y col.: Bacteremia aspectos clínicos y de laboratorio, Editorial Médica
Panamericana, Buenos Aires, Argentina, 1975.
26 LMMMIF
PRACTICA 2: TOMA DE MUESTRA HUMANA E IDENTIFICACIÓN. PARTE 1

COPROCULTIVO
OBJETIVOS:
El alumno se familiarizará con los procedimientos de laboratorio diseñados para la
identificación de patógenos entéricos causantes de cuadros diarreicos.
El alumno conocerá cuales son los agentes patógenos entéricos mayormente causantes de
cuadros diarreicos.
El alumno identificara enterobacterias a partir de materia fecal.
COMPETENCIAS:
[Introduzca las competencias buscadas para la práctica realizada, recuerde que el verbo con el
que se inicia se expresa en tiempo presente]
Texto sin espaciado.
Aquí no hay espacio.
INTRODUCCIÓN:
La flora bacteriana del intestino es abundante y variada, mediante el estudio bacteriológico

puede determinarse la etiología del 40% de las diarreas; los gérmenes que se investigan de
ordinario son Salmonella, Shigella y, en niños menores de 10 años, sepas patógenas de
Escherichia coli; ocasionalmente es importante investigar Sthaphylococcus aureus y Candida
albicans en personas con diarrea intensa, debilitadas por otros padecimientos y con
antecedentes de haber recibido tratamiento con antibióticos de amplio espectro.
REFERENCIAS Nota, la introducción debe tener entre 1 y 1.5 cuartillas
links que puede investigar, cuestionarios o tareas específicas a resolver, etc ]

Antisuero para
1 Incubadora 1 identificación de
salmonella
Antisuero para
1 Microscopio 1
identificación de Shigella
Antisuero para
identificación de cepas
patógenas de
1 Mechero 1 Escherichia coli: 0-26, 0-
125, 0-86, 0-111, 0-112,
0-119, 0-125, 0-123, 0-
127 y 0-128
1 Asa Bacteriológica
1 Guantes desechables 50 ml Solución de yodo-lugol
Caja de Petri con agar
1 Eosina Azul de Metileno
(EMB)
1 Salmonella – Shigella
(SS)
28 LMMMIF

1 Desoxicolato citrato
(DCA)
1
Gelosa sangre
Caja de Petri con Caldo
1
Tetrationato o selenito
1
Kliger
1
SIM
Tubo con Caldo urea-

1 sacarosa (SURRACO).

1
Verde Brillante
Sulfito de Bismuto
TOXICOLOGÌA:

Riesgos a la salud:
Primeros Auxilios:
METODOLOGÍA:
PROCEDIMIENTO
I. Toma de muestra
1. La muestra de elección es la materia fecal recientemente evacuada; es importante
obtenerla en la etapa aguda de la enfermedad diarreica.
2. Las muestras obtenidas con hisopo durante la rectoscopía, directamente de las lesiones,
son la elección para aislar Shigella, en los estados agudos y crónicos de la disentería
bacilar.
3. Las muestras tomadas de la mucosa rectal mediante hisopo depositado, en un tubo de
2 ml de caldo nutritivo son las indicadas en pacientes con cuadro agudo de diarrea o
disentería, en pacientes hospitalizados o en grupos de enfermos durante una epidemia;
este procedimiento da menos resultados positivos que los dos anteriores. De ordinario
se emplea en niños menores de cinco años.

1. De la muestra se selecciona preferentemente para la siembra: moco, sangre y
fragmentos de epitelio.
2. Sembrar con un asa o hisopo en Caldo Tetrationato, Agar EMB y Agar SS.
3. Incubar el caldo Tetrationato a 37°C por 24 horas.
30 LMMMIF
4. Después del tiempo de incubación del Caldo Tetrationato resembrar en el Agar Verde
Brillante, Agar EMB y Agar SS.
5. Siempre que sea posible se deben cultivar varias muestras; muchos investigadores han
demostrado el valor de este procedimiento para aislar gérmenes patógenos de la materia
fecal. La muestra debe sembrarse inmediatamente en los medios adecuados antes de
que transcurran dos horas de su evacuación, cuando se demora la siembra, la muestra
se coloca en una solución o medio especial para conservarla o transportarla hasta que
pueda examinarse; con este objeto se pone un Gramo aproximadamente de materia fecal
en 10 ml de la solución salina glicerolada y amortiguada de Teage y Clurman, modificado
por Sachs o en le medios de Stuart,
6. Frotis. El frotis directo de la muestra, teñido por el método de Gram, se usa para
investigar la presencia y abundancia de Sthapylococcus aureus y Candida albicans.
7. Cultivo. Se usa para investigar la presencia de Salmonella y Shigella; con una asada de
la muestra o el hisopo con que se tomó, se inoculan directamente en los medios EMB,
agar SS y agar desoxicolato-citrato (DCA); además se ponen de 1 a 3 g de muestra en
5 ml de medio de tetrationato y se añaden 0.2 ml de solución de lugol o el hisopo con
que se tomo la muestra se deja en el tubo con los 2 ml de caldo nutritivo, se añaden 5
ml del caldo de tetrationato y 0.2 ml de la solución de lugol. Estos medios se incuban a
la temperatura de 37ºC durante 21 h.
8. El cultivo en el medio de tetrationato se resiembra en los medios de agar verde brillante
y de agar sulfito de bismuto y agar desoxicolato-citrato, los que se incuban a la
temperatura de 37ºC durante 24 h.
9. Lectura:
10. Escherichia coli. Es fácilmente reconocida y se diferencia de otras enterobacterias
porque fermenta rápidamente la lactosa, sus colonias se colocan en el medio de EMB
tienen color azul negro con brillo metálico, en los medios de agar SS, agar desoxicolato-
citrato tienen color rojo. Cuando la muestra sea de un niño menor de 10 años se
seleccionan 10 colonias de E. Coli y se siembra cada colonia de las que se van a
identificar serológicamente, en un área de 1 x 15 cm de la base de agar sangre o el medio
de agar soya tripticasa, se incuban a 37ºC durante 24 h, para obtener cultivos puros y
suficientes gérmenes para las pruebas, los otros medios pueden inhibir su desarrollo.
11. Salmonella y Shigella. Las colonias de estos microoranismos son incoloras en los medios
de EMB, agar SS y agar desoxicolato-citrato; las colonias de Salmonella son de color
rosa, opacas y rodeadas de una zona de color rojo brillante en el medio de verde brillante,
en el medio de agar sulfito de bismuto son de color negro.
III. Pruebas Bioquímicas:
Las colonias que tienen las características anteriores deben ser sembradas en los medios
siguientes para estudiar sus reacciones bioquímicas:
Kliger
En este medio se pueden observar las fermentaciones de la glucosa, lactosa y la producción de

sulfuro de hidrógeno y gas.
1. Se siembra por picadura y estrías en su superficie, se incuba por 24 h a 37ºC.
2. Fondo amarillo: fermenta la glucosa.
3. Superficie amarilla: fermenta la lactosa.
4. Trayecto de la picadura negro: produce sulfuro de hidrógeno.
5. Formación de burbujas en el medio y elevación del mismo: produce gas.
SIM
En este medio se puede observar la producción de sulfuro de hidrógeno, de indol y la movilidad

del germen.
1. Se siembra por picadura y se incuba por 24 h a 37ºC. Trayecto de la picadura negro: produce
sulfuro de hidrógeno.
2. Cuando se añade el reactivo de Kovac y da color rojo, indica producción de indol.
6. Cuando el germen se desarrolla en el trayecto de la picadura y se extiende a los lados: es
móvil.
Urea-sacarosa (SURRACO)
En este medio se puede observar la fermentación de la sacarosa y la hidrolísis de la urea.
32 LMMMIF
1. Color morado: hidroliza la urea.

2. Color amarillo: fermenta la sacarosa.
Identificación:
Cepas patógenas de Escherichia coli. Cuando la muestra es de un niño menor de 10 años con
diarrea, los cultivos puros de 10 colonias se prueban con los antisueros contra las 10 cepas
patógenas más frecuentes.
Salmonella y Shigella: Cuando los resultados de la bioquímica corresponden a gérmenes de los
géneros Salmonella o Shigella se procede a la identificación serológica.
Sthaphylococcus aureus. Se encuentra en escasa cantidad en la materia fecal (del 15 al 20%
de las personas sanas); tiene importancia cuando se aislan en gran número de colonias en un
medio no selectivo, como el de agar sangre y en el frotis directo de la muestra, teñido con el
método de Gram, se observan numerosos cocos Gram positivos agrupados en racimos.
Candida albicans. Este microorganismo como el anterior, puede encontrarse normalmente en
el intestino del hombre; tiene importancia cuando en el frotis directo de la muestra teñido con el
método de Gram, se observan levaduras y pseudomicelios.
FLORA NORMAL: Generalmente se encuentran Escherichia coli, Klebsiella, Citrobacter,
Proteus, Bacteroides y Clostridia.
RESULTADOS:
Medio Crecimiento Apariencia del

crecimiento
Agar Verde Brillante
Agar EMB
Agar SS
CÁLCULOS
TINCIÓN DE MOVILIDAD SIM KLIGER SURRACO

GRAM
34 LMMMIF

1. ¿Qué enterobacterias son de importancia clínica?

2. Describa las infecciones causadas por este tipo de organismos.
3. ¿En qué consiste las pruebas serológicas de un coprocultivo?
4. ¿Cuál es su fundamento?
5. ¿Cuál es la ventaja y desventaja de esas pruebas?
6. ¿Por qué es conveniente que una vez que se obtuvo la muestra se analize
inmediatamente?
CONCLUSIONES:
Realice sus conclusiones en base a la comparación entre los objetivos planteados y los
resultados obtenidos. Considere las competencias adquiridas.
BIBLIOGRAFÍA:
Bailey, W.R. y Scott, E.G.: Diagnostic Microbiology, 4º Ed., Saint Louis, The C.V. Mosby
Company, 1974
Breed, R.S.; Murray, E.G.D. y Smith, N.R.: Bergey´s Manual of Determination Bacteriology
7º Ed. Williams & Wilkins C., Baltimore, Md., EUA, 1957.
Edwars, P.R. y Ewing, W.H.: Identification of Enterobactereceae, Burges Publishing Co.
Minneapolis, Minnesota, EUA, 1972.
Kauffmann, F.: The Bacteriology of Enterobacteriaccae, Williams & Wilkins, Baltimore, 1966.

EXUDADO FARÍNGEO Y NASAL
OBJETIVOS:
El alumno conocerá los agentes etiológicos causantes de faringitis, amigdalitis y/o sinusitis
o rinitis.
El alumno conocerá la técnica mediante la cual se obtiene adecuadamente la muestra del
exudado faríngeo y nasal.
COMPETENCIAS:
Aquí no hay espacio
INTRODUCCIÓN:
Los cultivos de faringe y nasofaringe son importantes en el diagnóstico de ciertas

enfermedades, tales como las inflamaciones de la garganta de tipo estreptocóccico, diftérico,
etc., en el descubrimiento de focos de infección en algunas enfermedades como la escarlatina,
fiebre reumática, glomerulonefritis aguda y también en la detección de portadores de
organismos como el Streptococcus beta hemolítico, Staphylococcus aureus, bacilo diftérico y
Haemophilus influenzae. REFERENCIAS Nota, la introducción debe tener entre 1 y 1.5
cuartillas
36 LMMMIF

1 Incubadora 1 Kit para tinción de Gram
1 Microscopio 200 ml Sol. Azul de algodón

lactofenol
Cajas de Petri con Agar
1 200 ml Sol. Salina estéril 0.85%
sangre
Cajas de petri con Agar sales
1
y manitol
Caja de petri con Agar
1
chocolate
1
Sabouraud
1
Mckonkey
1 tubo Caldo de soya tripticasa o

BHI
1 Caja de petri con Agar EMB
1 Mechero
1 Asa Bacteriológica
1 par Guantes desechables
2 Hisopos estériles
1 caja Portaobjetos
1 Abatelenguas
TOXICOLOGÌA:

Riesgos a la salud:
Primeros Auxilios:
METODOLOGÍA:
PROCEDIMIENTO
I. Toma de la muestra
Faringe
1. Antes de iniciar la toma del exudado indicar al paciente que debe presentarse sin aseo bucal,
en ayunas y sin haber ingerido antibióticos cinco días entes de que se le tome la muestra.
2. Colocarse los guantes y cubrebocas.
3. Toma de la orofaringe: Indicar al paciente que incline la cabeza hacia atrás.
4. Iluminar lo mejor posible la cavidad oral.
5. Con ayuda de un abatelenguas oprimir la lengua hacia abajo.
6. Con un hisopo estéril obtener la muestra por rotación sobre las paredes de la faringe y
ambas amígdalas (o la fosa amígdalina en los amigdalectomizados) y en cualquier área de
38 LMMMIF
inflamación o exudación; se debe evitar tocar la lengua o los labios para no diluir o
contaminar la muestra;
7. Introducir el hisopo a un tubo con solución salina o en caldo de cultivo BHI ó TSB.
8. Con otro hisopo volver a tomar la muestra para hacer el frotis en el portaobjetos.
9. Etiquetar con los datos completos del paciente el tubo con la muestra y el portaobjetos.
Nasal
1. Se humedece el hisopo en el caldo BHI ó TSB ó en solución salina estéril.
2. Introducir cuidadosamente 2.5 cm por el orificio nasal derecho, imprimiéndole movimientos
rotatorios.
3. Realizar el mismo procedimiento para la fosa izquierda.
4. Introducir los hisopos a un tubo con solución salina.
5. Con otros 2 hisopos, realizar frotis en portaobjetos.
6. Etiquetar con los datos completos del paciente los tubos y los portaobjetos.
Nasofaringe
1. Indicar al paciente que incline su cabeza hacia atrás.
2. levantar suavemente la punta de la nariz con el dedo pulgar é índice.
3. Introducir el hisopo hecho con alambre de nicromel lentamente por una de las fosas nasales,
tocando primero el piso de las fosas nasales, después se sigue por abajo del cornete medio
hasta tocar la pared posterior de las fosas nasales, se deja allí unos segundos y se saca con
suavidad; esta muestra es particularmente útil para investigar Bordetella pertusis.
4. Conservación. La muestra debe sembrarse inmediatamente. Cuando es necesario aplazar
la siembra más de una hora se debe poner el hisopo en caldo y conservarlos en el
refrigerador.
5. Transporte. Cuando las muestras puedan entregarse en el laboratorio dentro de las primeras
cuatro horas, se colocan en un tubo estéril y se envían al laboratorio.
6. Cuando se envíen por correo se puede usar cualquiera de los tres métodos siguientes:
a. El hisopo de dacrón poliéster se coloca en un tubo estéril con tapón de rosca o en
cualquier recipiente que proteja la muestra, en ambos casos con un agente desecante
(sílice gel) dentro del recipiente que contiene el tubo, se empaquetan y se envían.
b. El hisopo puede ser sembrado en la superficie inclinada de un medio de agar sangre

contenido en un tubo de tapón de rosca, se tapa, se empaqueta y se envía al
laboratorio.
c. El hisopo se hace rodar y se frota sobre la superficie de una tira de papel filtro estéril,
se deja secar tres o cuatro minutos, se dobla, se coloca en un sobre para correo, se
rotula y se envía al laboratorio.
Siembra directa
1. inmediatamente después de que la muestra fue tomada, el hisopo se hace rodar y se frota
en el borde de una placa de agar sangre, cubriendo sólo un sexto de la superficie.
2. Con asa de alambre se extiende la muestra en la mitad de la superficie mediante 10 a 20
movimientos de un lado a otro de la placa; después sin volver a entrar en el sitio donde
se inoculó el hisopo, el asa extiende el inoculo que con ella se hizo, en el resto de la
superficie de la placa; al final el asa se hunde varias veces en el medio para investigar
hemolísis bajo la superficie.
3. Incubar las placas a la temperatura de 35-37ºC, durante 18 a 24 h. Para obtener los
mejores resultados posibles se recomienda incubar en un medio con tensión reducida de
oxígeno, de preferencia en una mezcla de 10% de bióxido de carbono y 90% de nitrógeno
(solo para las cajas con Agar chocolate).
4. Los hisopos, cuya siembra se demora, deben colocarse en caldo y si el retraso ha sido
de dos a ocho horas se deben incubar a la temperatura de 37ºC una hora antes de
sembrarse; cuando la demora ha sido más de ocho horas deben incubarse en caldo a la
temperatura de 37ºC. por 24 horas.
Vaciado en placa
1. Es otro procedimiento para sembrar las muestras, permite estudiar la morfología de las
colonias y la hemolísis en la superficie y en la profundidad en una placa de agar sangre
con material del cultivo primario; se procede de la manera siguiente:
40 LMMMIF
2. Se funden de 15 a 20 ml de agar base. Se ajusta su temperatura a 45ºC,

aproximadamente antes de usarlo.
3. El hisopo que se puso en 1 ml de caldo soya-tripticasa, se exprime contra la superficie
interior del tubo, se saca y se coloca en un tubo estéril.
4. Se añaden 0.6 a 0.8 ml de sangre de carnero desfibrinada estéril al agar base fundido.
5. Se toma una asada del caldo que contiene el hisopo, se toca la superficie interna del tubo
para eliminar el exceso y se transfiere el asa al agar con la sangre y se mezcla por
rotación.
6. Se flamean los labios del tubo y se vacía su contenido en una caja de Petri; se limpian o
se secan los labios del tubo con un algodón empapado con desinfectante para esterilizar
el residuo de agar sangre inoculado que haya quedado en la superficie de ellos.
7. Cuando el agar se haya solidificado, se toma el hisopo que se dejó en el tubo estéril y se
siembra en un sexto de la superficie; con el asa se extiende este inóculo como en la
siembra directa.
8. Se incuba a 35ºC - 37ºC , durante 18 a 24 horas.
Siembra de la muestra en papel filtro

1. La superficie del papel donde se colocó la muestra se pega a la superficie del agar sangre
y se hace suave presión sobre el papel hasta que este quede completamente humedecido
por el medio, se incuba seis horas a 35ºC, se retira el papel y se vuelve a sembrar en otra
parte del mismo medio.
2. Después de incubarse seis horas el inóculo se extiende con el asa de alambre; se incuba
de 24 a 48 h a la temperatura de 35 a 37ºC.
3. Vaciar los datos obtenidos en la siguiente tabla e indicar los tipos de organismos que podrían
estar presentes en las muestras.
RESULTADOS:
Medio de cultivo Exudado Faríngeo Exudado Nasal
Agar sangre
Tipo de hemólisis
Agar chocolate
Colonias rosas a púrpura

(+) o (-)
Agar sabouraud
Presencia o ausencia de
levaduras
Agar de sales manitol
Crecimiento positivo o
negativo
Color del medio
Tipos de organismos
presentes
Exudado
Frotis
Faríngeo Nasal
Tinción de Gram
Morfología
Organismo
42 LMMMIF
Reacción con Azul de

algodón lactofenol
Morfología
organismo
Lectura de los cultivos:

1. Estreptococo beta hemolítico. Las colonias de la superficie del agar sangre son
pequeñas, de menos de 1 mm de diámetro, convexas, traslúcidas, grisáceas, opacas, duras y
secas, rodeadas por una zona de hemólisis de 2 mm de diámetro (se observa transparente e
incolora), sin eritrocitos o muy escasos; las colonias debajo de la superficie son de forma
lenticular y están también rodeadas por una zona de hemólisis sin eritrocitos.
2. La clasificación del estreptococo grupo A con bacitracina. Se hace de la forma siguiente:
se toman colonias de estreptococo hemolítico descritas en el párrafo anterior, se siembran en
una placa de agar sangre, en su superficie se coloca un disco de papel impregnado con 0.04
unidades de bacitracina; se observa una zona de inhibición del desarrollo de 15 a 20 mm de
diámetro cuando el estreptococo del grupo es del tipo A. Sólo de cuatro a siete por ciento de
los estreptococos beta hemolítico del grupo A son relativamente resistentes a esta
concentración de bacitracina.
3. La clasificación del estreptococo grupo A por inmunofluorescencia. Este procedimiento
proporciona un medio rápido y seguro para identificar el estreptococo beta hemolítico del grupo
A, sin embargo, el procedimiento sólo se efectúa en laboratorios especializados o de
referencia.
4. Estreptococo alfa hemolítico. Las colonias están rodeadas inmediatamente por una zona,
que puede ser estrecha, de eritrocitos intactos pero decolorados, de color verde o café verdoso
por la de granulación de la hemoglobina beta biliverdina; después de esta zona de
decoloración, se puede observar una zona más clara de hemólisis.
5. Las colonias pueden confundirse con las de neumococo y para diferenciarlas se utiliza la
cualidad que tiene éste último germen de ser soluble en sales biliares o la prueba de la
optoquina.
6. Estreptococo no hemolítico. Las colonias no producen ningún cambio demostrable en la
sangre que las rodea, es decir no producen ningún tipo de hemólisis.
7. Estafilococo dorado coagulasa positiva: En agar sangre desarrollan colonias grandes
aperladas, opacas, de consistencia butirosa y generalmente producen hemólisis beta.
8. Algunas veces las colonias de éste germen pueden confundirse con las del estreptococo
beta hemolítico; la diferenciación puede hacerse con la prueba de la catalasa, en la cual se
añade 0.5 ml de agua oxigenada al 3% a las colonias en una placa de agar nutritivo o al 0.5
ml de un cultivo en caldo. Las colonias de estafilococo producen burbujas de gas, las de
estreptococo no; otro método es tomar las colonias y emulsionarlas en una gota de peróxido
de hidrógeno al 30% (superoxol) colocada en un portaobjeto: la inmediata producción de
burbujas indica la presencia de catalasa, debe recordarse que los eritrocitos tienen catalasa,
por eso cuando se toman colonias del agar sangre, se recomienda tener cuidado para no
tomar eritrocitos que puedan dar una reacción falsa positiva.
9. Los estafilococos crecen en el medio selectivo sal y manitol, las cepas patógenas de este
grupo fermentan el manitol y dan positiva la prueba de la coagulasa. Esta prueba se puede
efectuar en tubo o en placa, para el trabajo ordinario se recomienda la prueba en placa.
10. Prueba en placa: con un lápiz graso se divide la superficie de un portaobjetos en tres
partes, en una se coloca una gota de plasma y una asada de gérmenes, se hace una
suspensión lo más uniformemente posible. En la parte central del portaobjetos se pone una
gota de solución de cloruro de sodio al 0.85% y una asada de gérmenes y se hace otra
suspensión. En la otra parte restante del portaobjeto se pone una gota de plasma y una de
solución de cloruro de sodio al 0.85%.
11. Se agita manualmente durante unos segundos y se examina para ver si hay coagulación
macroscópica, si la hay en la primera reacción y en las otras no, la prueba será positiva.
12. Si hay coagulación en algunas de las otras áreas la prueba se desecha y se repite con
otro plasma y con otra colonia de gérmenes.
44 LMMMIF
13. Prueba en tubo: en un tubo de 13 x 100 mm se colocan 0.5 ml de plasma citratado

humano, diluido 1:2 o 1:4; se le añade una asada de cepa problema, se incuba a 37ºC durante
seis horas, se hace una segunda lectura a las 24 h. Se toma como prueba positiva la
coagulación del plasma.
14. Neumococo. La morfología de los neumococos es muy típica, sor gérmenes de forma
lanceolada, con cápsula, se disponen en pares o en cadenas cortas. Si se encuentran estas
formas típicas se puede intentar un diagnóstico de presunción y sembrar en agar sangre e
incubar a la temperatura de 37ºC durante 24-48 h.
15. Las colonias son brillantes, transparentes y con una zona de alfa hemólisis.
16. Pueden confundirse con el estreptococo alfa hemolítico, para diferenciarlo se usa la
prueba basada en la propiedad que tiene el neumococo de ser soluble en las sales biliares.
17. Prueba de solubilidad en bilis: en esta prueba se emplean sales biliares al 10% Bacto
Oxgall. La colonia sospechosa se siembra en agar sangre en sectores y se incuba por 24 h a
la temperatura de 37ºC, se hace un frotis y se siembra en caldo BHI o BHI con clara de huevo
coagulada. Se incuba 24 h. Se centrifuga el tubo de BHI, se decanta y se resuspende el
sedimento en solución de cloruro de sodio al 0.85%. Se centrifuga nuevamente y se decanta.
Se resuspende el sedimento y se divide en dos partes:
1. Sedimento más solución salina (tubo testigo).
2. Sedimento más sales biliares al 10% (tubo problema).
3. Se incuba a 37ºC 20 o 30 minutos y se examina si hay solubilidad. Si la hay en el tubo
que contiene sales biliares (tubo problema), quedará transparente y el germen será un
neumococo.
4. Es posible también hacer esta diferenciación con discos de papel impregnados con
hidrocloruro de etilhidrocupreina (Taxo-P 831 u Optochin-Difco).
1. Bacilo diftérico: La búsqueda de este germen generalmente se hace de urgencia, por lo
que es importante conocer su morfología. El informe preliminar es presuntivo y se hace en dos
frotis teñidos con las técnicas de Albert y Gram. Son bacilos Gram positivos, rectos o
ligeramente encorvados, que se presentan en empalizada o semejantes a las letras chinas;
no se tiñen uniformemente, sino que presentan gránulos metacromáticos.
2. El cultivo se hace en placas de agar sangre telurito, Tinsdale modificado, medio Löefler
o en cualquiera de los otros medios diferenciales. En agar sangre telurito crecen colonias
pequeñas, que van de color gris al negro, dependiendo del tipo de cepa de que se trate.
3. Las pruebas de toxicidad in vivo o in vitro deben hacerse en todos los casos en que se
sospeche el C. diphteriae.
4. Haemophilus. Debido a la dificultad de crecimiento de estos gérmenes en los medios
comunes, es recomendable usar medios muy enriquecidos como el medio de agar chocolate
con hemina y extracto de levadura o el de Bordet Gengou con sangre de conejo al 15%,
incubar hasta 72 horas o más, con objeto de obtener un mejor desarrollo; son gérmenes Gram
negativos, de forma cocobacilar en cultivos recientes y formas bacilares grandes, formando
madejas, en cultivos viejos. Sus colonias son pequeñas, mucosas y de un milímetro de
diámetro. Su identificación se puede hacer con reacciones de aglutinación con sueros
específicos. Para la obtención de cultivo de Haemophilus, se recomienda usar agar sangre
preparada con sangre de conejo, pues la sangre de carnero no es útil para este propósito.
5. Candida albicans. Sólo es importante cuando se observan numerosas esporas y micelios
en el frotis, en este caso se cultiva la muestra para investigar si es Candida albicans (véase
exudado cervicovaginal).
6. Bacilos coliformes. La abundancia de su desarrollo se puede valorar tanto en EMB como
en el agar sangre; lo importante es que las colonias de estos microorganismos predominan
claramente sobre las otras.
7. Bordetella pertussis. Se investiga de preferencia en la muestra nasofaringe, también en
las gotitas pequeñas de secreción que se expulsan al toser y que se recogen en la superficie
del medio que se coloca a 10 o 15 cm de la línea: se incuba a la temperatura de 35 a 37ºC
durante cuatro o cinco días, las colonias de este microorganismo son como pequeñas gotas
de mercurio, mucoides, pegajosas y rodeadas de una zona de hemólisis. Estas colonias están
formadas por bacilos aislados, en pares, ocasionalmente forman cadenas cortas, no móviles,
tienden a mostrar tinción bipolar y pueden ser encapsulados; la identificación de la Bordetella
pertussis además se confirma por la prueba de aglutinación en lámina con el antisuero
específico.
46 LMMMIF
8. Meningococo. Se siembra la muestra de nasofaringe en medio de Thayer Martin como

para investigar gonococo, se identifica mediante las pruebas de la oxidasa, fermentación de
los azúcares (véase exudado cérvico vaginal) y serológico de aglutinación en lámina.
9. Informe del resultado. A los tres días, debe informarse el tipo de hemólisis, la cantidad
cuando menos aproximada de colonias en la placa o la proporción de colonias de
estreptococos o de estafilococo, grupo al cual pertenece el estreptococo, y las pruebas con
las que se hizo la clasificación de los gérmenes (bacitracina, serológicas, etc.), además la
susceptibilidad a los antimicrobianos cuando sea necesaria (no para el estreptococo.
10. Ejemplo: Desarrollaron abundantes, moderadas o escasas colonias de estreptococo beta
hemólitico del grupo A (sensible a la bacitracina, y abundantes, moderadas o escasas colonias
de estafilococo dorado coagulasa positiva.
Valores normales:
Microorganismos encontrados en la Microorganismos encontrados en la

faringe de personas sanas. faringe de personas con proceso
inflamatorio de ella.
Estreptococo beta hemólitico (no del Estreptococo beta hemólitico del

grupo A) grupo A, ocasionalmente grupos B, C
y D. *
Estreptococo alfa hemólitico. ¿?
Estreptococo gama hemólitico ¿?
Neisseria catarrhalis y otras ¿?

Neisserias.
Estafilococo coagulasa negativo. ¿?
Estafilococo dorado coagulasa Estafilococo dorado coagulasa

positivo. positivo. *
Haemophilus haemolyticus. Bordetella pertussis **
Neumococo Meningococo (portadores).
Bacilos difteroides. Corynebacterium diphteriae.
Bacilos coliformes.(después de Bacilos coliformes. **

tratamiento con penicilina.
Levaduras, incluyendo Candida Candida albicans. *

albicans.
La importancia de estos microorganismos como responsables de una infección, está

relacionada con la abundancia de ellos en el exudado que se estudia; por esta razón es
importante señalar el porcentaje aproximado que representan sus colonias en los cultivos.
**La importancia de estos microorganismos como agentes responsables de la infección
faríngea es dudosa, pero, en caso de ser así, también está en relación con la abundancia
de ellos en cultivo de la muestra que se estudia.
CÁLCULOS
[Introduzca los cálculos requeridos que el alumno debe realizar para el cumplimiento de
objetivos y competencias establecidos]

1. ¿Qué agentes patógenos pueden causar infección en el aparato respiratorio?

2. ¿Cuáles son las enfermedades comunes asociadas a estos agentes patógenos?
3. Describa el cuadro clínico de cada una de las enfermedades anteriores.
48 LMMMIF
4. ¿Cuál es la biota microbiana normal de la boca y nasofaringe en el hombre?

5. ¿Por qué razón no son aceptables para proceso las muestras de exudados faríngeos
con saliva?
CONCLUSIONES:
[solo indicativo].
BIBLIOGRAFÍA:
Bailey, W.R. and Scott, E.G.: Diagnostic Microbiology third edition C.V. Mosby Co., St. Louis,
1970, pag. 89,
Committee on Acute Respiratory Diseases: Problems in Determining the Bacterial Flora of
Pharynx, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 69:45-52, 1948.
Eickhoff, T.C. and Finland, M.; In vitro susceptibility of Gruo A Beta Hemmolytic streptococci
to 12 Antibiotics. Amer. J. Med. Sel. 219:261-268, 1965.
Hollinger, N.F., Lindberg, L.H., Russell, E.L., Sier, H.B., Cole, R.M. Browne, A.S. and
Ubbykk, E.L., Transport of streptococci on filter papers strip. Pub. Health Rep. 75:251-259,
1960.

UROCULTIVO
OBJETIVOS:
El alumno se familiarizará con los organismos comúnmente responsables de las infecciones

del tracto urinario.
El alumno se familiarizará con los métodos de laboratorio para la detección de bacteriuria e
identificación de microorganismos asociados con el tracto urinario.
COMPETENCIAS:
INTRODUCCIÓN:
La orina de pacientes con pielonefritis tiene mayor número de leucocitos que el normal y el
número de bacterias viables de la porción media de la micción excede de 100 000 en un mililitro.
El diagnóstico de las infecciones de las vías urinarias se hace demostrando bacteriuria por
medio del cultivo. El urocultivo cuantitativo permite distinguir la bacteriuria significativa de la
simple contaminación de la muestra. REFERENCIAS Nota, la introducción debe tener entre 1 y
1.5 cuartillas
50 LMMMIF

1 Incubadora 100 ml Solución salina 0.85%
Solución de merthiolate
1 Microscopio 100 ml
al 1:10 000
Solución acuosa de
1 Centrífuga 100 ml cloruro de benzalconio
al 1: 10 000
Caja de Petri con agar Eosina
1
Azul de Metileno (EMB)
1 Caja de Petri con agar sangre
1 Caja de Petri con agar Soya

tripticasa o BHI.
1
estafilococo 110
1 Mechero
Asa Bacteriológica calibrada
(4mm de diámetro de 0.01
ml)
1 par Guantes desechables
2 Tubos de centrífuga de 15 ml
1 Portaobjetos
1 Cubreobjetos
Matraces Erlenmeyer de 125
2
ml
TOXICOLOGÌA:

Riesgos a la salud:
Primeros Auxilios:
METODOLOGÍA:
PROCEDIMIENTO
I. Recolección de la muestra
1. La muestra de elección para hacer el diagnóstico es la primera orina de la mañana.
2. La recolección de muestra para la mujer: realizar limpieza en la zona genital y meato
urinario con benzal y eliminar el exceso con agua.
52 LMMMIF
3. Con los dedos índice y medio de la mano separar labios mayores y menores de tal
manera que el orificio urinario quede libre.
4. En un frasco estéril y de boca ancha depositar la orina dejando caer primero el chorro
medio en el inodoro, es decir, una vez que empieza la micción, se desecha la primera
orina que arrastrará los organismos contaminantes, se interrumpe la micción para
recoger en un matraz estéril de 125 ml, unos 10 ml de orina de la porción media de la
micción, se desecha el resto de la orina. El resto de la orina se recolectará en el frasco.
5. La recolección de muestra para el hombre: realizar limpieza en la zona genital y meato
urinario con benzal y eliminar el exceso con agua.
6. En un frasco estéril y de boca ancha depositar la orina dejando caer primero el chorro
medio en el inodoro, siguiendo las instrucciones del punto 5. El resto de la orina se
recolectará en el frasco.
7. La recolección de muestra para bebes: se les debe proporcionar una bolsa recolectora
para orina.
8. Realizar limpieza en la zona genital y meato urinario con benzal y eliminar el exceso con
agua.
9. Colocar la bolsita en la zona genital evitando tocar el área que se ha limpiado.
10. Si no se ha obtenido la muestra de orina en un período de 30 minutos retirar la bolsa y
colocar otra nueva.
11. La muestra de orina deberá ser trasladada al laboratorio en un período no mayor de 30
minutos.
12. El uso de la sonda para obtener la muestra de la orina, aún bajo las mejores condiciones
de asepsia, puede producir infecciones en las vías urinarias, por lo que no se recomienda
su uso.
13. El urocultivo debe hacerse dentro de la hora siguiente a la recolección de la orina, o bien
si esto no es posible, debe guardarse la orina en el refrigerador a 4ºC hasta que pueda
cultivarse.
Cuenta de leucocitos:
1. El número de leucocitos se determina en el sedimento urinario; para ello se depositan10

ml de orina, habiéndose tomado previamente la muestra para el cultivo, en un tubo de
centrífuga graduado.
2. Centrifugar a 2 000 rpm durante cinco minutos.
3. Desechar el sobrenadante y se resuspender en la gota de orina residual el sedimento.
4. De éste se toma una gota, la cual se deposita en un portaobjeto limpio y se cubre con un
cubreobjeto.
5. Observar con el microscopio con 0objetivo seco y fuerte y contar el número de leucocitos
por campo. Observar 10 campos y sacar el promedio.
Cuenta de bacterias:
Método con asa calibrada.

1. El método cuantitativo que se utiliza de rutina es el del asa calibrada, el método de
diluciones sólo en casos especiales. Como su nombre lo indica, en el primero se usa un
asa calibrada para inocular. Dicha asa es de 4 mm de diámetro y de 0.01 ml de
capacidad.
2. Se toma una asada de la orina sin centrifugar y se hace una siembra por estrías en toda
la superficie de la placa. Como en las infecciones del tracto urinario pueden encontrarse
bacterias Gram positivas (estreptocos y estafilococos y bacilos Gram negativos (E. coli,
Paracolobactrum y Proteus, es conveniente sembrar la orina en una placa de agar
sangre y en uno de los medios selectivos para las bacterias Gram negativas, tales como
el medio EMB o el de MacConkey. En ambas placas la orina debe sembrarse del modo
descrito anteriormente, incubarlas a 37ºC y examinarlas después de 24 a 48 h. Se
multiplica por 100 el número de colonias que aparezcan en la placa, para determinar el
número de bacterias que existen en un mililitro de orina.
3. Ordinariamente se hace antibioGrama a las bacterias encontradas en el urocultivo.
Tinción de Gram
54 LMMMIF
1. Además de la siembra se hace un frotis con orina bien mezclada sin centrifugar, para
estudio microscópico directo.
2. Depositar la orina en la lámina con la misma asa calibrada
3. Realizar tinción de Gram al frotis. Éste será positivo cuando contenga por lo menos
unas cuantas bacterias por campo.
4. Si en el frotis directo se encuentran cocos Gram positivos, se sembrará la orina en
una caja con medio S-110.
5. El resultado del frotis está en relación con la contaminación o la infección. La
correlación entre los resultados del frotis y del cultivo es de 75 por 95%.
Método de diluciones:
1. Con solución salina al 0.85%, se hacen diluciones 1:10, 1:1000 y 1:10 000 de la orina.
2. En tubos que contienen 13 o 15 ml de BHI, agar soya-tripticasa o cualquier otro medio
nutritivo, el cual se esterilizará y cuando se encuentre de 45-47ºC de temperatura poner
un mililitro de cada una de las diluciones de orina.
3. Agitar por rotación y practicar la técnica de vaciado en placa, incubar a 37ºC durante 24
h y hacer la cuenta de las colonias que desarrollaron al cabo de este tiempo, se multiplica
por la dilución, y así se obtendrá el número de bacterias por mililitro de orina.
OBSERVACIONES:
Estimación cuantitativa de colonias: En general, cuentas de menos de 10 000 bacterias por

mililitro de orina indican contaminación; cuando el número está entre 10 000 y 100 000,
se sospechara infección, y si es mayor de 100 000, se confirmará la sospecha.
Hay casos de pielonefritis en los que el número de bacterias es menor de 10 000 en un mililitro
de orina.
Esos casos se presentan cuando existe aumento en la diuresis (poliuria), la densidad de

la orina es menor de 1.003, el paciente tiene micciones frecuentes, y cuando está siendo
tratado con agentes antimicrobianos o el pH de la orina es menor de 5.
Microorganismos presentes en el tracto urinario: Las infecciones bacterianas del tracto

urinario pueden presentarse en pacientes de cualquier edad y cualquier sexo y pueden variar
desde infecciones inaparentes hasta enfermedades sistemáticas severas. El diagnóstico clínico
de pielonefritis frecuentemente pasa inadvertida, debido a la ausencia de síntomas en el tracto
urinario. La relación entre la poliuria y pielonefritis activa inaparente sólo ha sido demostrada
recientemente en autopsias. La demostración de los microorganismos por cultivos apropiados
es, por lo preciso, la única manera posible de hacer el diagnóstico. Debido a que las muestras
de orina frecuentemente se contaminan en su recolección, el desarrollo de microorganismos
aún de patógenos conocidos, no establece necesariamente el diagnóstico de infección del tracto
urinario. Las publicaciones recientes de Kass, Sanford, MacDonald, Beeson y otros, constituyen
una bibliografía extensa y contienen una revisión actual de este tema, indican que la cuenta de
bacterias en orina fresca de pacientes con infección de las vías urinarias, habitualmente es
mayor de 100 000 en un mililitro, mientras que las muestras de personas no infectadas y
normales o son estériles o no contienen más de 10 000 bacterias en un mililitro.
Por lo tanto, para valorar el significado clínico de un cultivo de orina, se recomienda tomar en
cuenta el número de bacterias presentes en la muestra
RESULTADOS:
RESULTADOS
Número de Color del Grupo

Microorganismo UFC/ ml Diagnóstico
colonias medio presuntivo
56 LMMMIF
Dilución de la Número de Organismos por Bacteriuria

muestra de orina colonias ml de muestra positiva ó negativa
10 1
10 2
10 3
Sedimento urinario
Leucocitos:
Eritrocitos:
Bacterias:
Levaduras:
Parásitos:
VALORES NORMALES:
Leucocitos en orina:
Adultos: hasta 100 en un mm3
Niños: hasta 50 en un mm3
La flora bacteriana de las orinas normales difiere de la de las orinas con microorganismos
patógenos.
En el primer caso, los microorganismos encontrados más frecuentemente son:
FLORA MICROBIANA EN LA ORINA
GRAM POSITIVA PATÓGENA NO PATÓGENA
Estreptococo beta hemolitico Difteroides
Estafilicoco coagulasa positivo Bacillus subtillis

CANDIDA ALBICANS
Estafilococo coagulasa
negativa
Levaduras saprófitas
ESCHERICHIA COLI
GRAM NEGATIVA
AEROBACTER
Proteus
Salmonellas y Shigellas
PARACOLON
Neisseria gonorraeae
58 LMMMIF
BAAR Mycobacterium tuberculosis
Para personas normales, generalmente no hay desarrollo de gérmenes o tienen de 10 000 en

1 ml, sin aumento de leucocitos en la orina.
CÁLCULOS

1. ¿Cuáles son los agentes patógenos comunes de un urocultivo?

2. ¿A todo urocultivo positivo se le debe realizar un antibiograma?. Sí ó No. Justifique su
respuesta.
3. Indique el cuadro clínico de una infección de vías urinarias.
4. ¿Por qué debe realizarse un examen en fresco del sedimento urinario después de
haberse sembrado la muestra?
5. ¿Cuáles son los parámetros de referencia establecidos para indicar que hay bacteriuria?
CONCLUSIONES:
[solo indicativo].
BIBLIOGRAFÍA:
Kass, E.H. y Finland, M. Asymptomatic Infections of Urinary Tract. Trans. Am. Physiclans, 69:59,
1956.
Kass, E.H., Bacteriuria and Diagnosis in Infections of the Urinary Tract. Arch. Int. Med., 100:700,
1957.
Sonnenwirth, A.C.: Collection and culture of specimens and guides for bacterial identification.
Chapter 63. Clinical laboratory methodos and diagnosis 7º. Ed., Saint Louis, the C.V. Mosby
Company, 1970, Vol. II, pag. 1137.
PRACTICA 5: MANEJO DE ANIMALES DE LABORATORIO
OBJETIVOS:
Conocer las características anatómicas de algunas especies animales empleadas en el
laboratorio.
Desarrollar las destrezas necesarias para manejar apropiadamente a los animales de
laboratorio.
Aprender a observar el comportamiento que exhiben los organismos en condiciones
normales.
Conocer y aplicar algunos de los procedimientos empleados para sacrificar a los
animales de laboratorio.
COMPETENCIAS
60 LMMMIF
Capacidad del alumno para el aprendizaje de forma autónoma antes, durante y

después de la sesión práctica.
Capacidad de pensamiento crítico y reflexivo.
Capacidad crítica y autocrítica.
Capacidad de aprender y actualizarse permanentemente.
Capacidad de comunicación oral y escrita.
Habilidades en el uso de las tecnologías de la información y de la comunicación.
Habilidad para el trabajo en forma colaborativa.
Capacidad para identificar, plantear y resolver problemas.
Conocimientos sobre el área de estudio y la profesión.
Capacidad de expresión y comunicación.
Participación con responsabilidad social.
Capacidad para organizar y planificar el tiempo.
Capacidad de trabajo en equipo.
Habilidades interpersonales.
Compromiso con su medio sociocultural.
INTRODUCCIÓN:
Un espécimen de laboratorio es cualquier animal que, mantenido bajo determinadas

condiciones controladas es utilizado como instrumento de medida en experimentación científica,
desarrollo tecnológico e innovación, pruebas de laboratorio y docencia, para la generación de
datos, los cuales son utilizados como información. Los modelos animales de mayor uso dentro
del laboratorio son: ratones, ratas, cuyos, conejos, ranas, peces y perros; los cuales se emplean
de acuerdo con sus características anatomo-fisiológicas, en relación al estudio realizado. (1)
Los investigadores que trabajen y experimenten con animales, están moralmente obligados a
manifestarles tres tipos de actitudes: (2)
• Respeto: por tratarse de seres vivos y sensibles, que tienen necesidades y también están
experimentando sufrimiento.
• Afecto: considerándolos partícipes con nosotros del misterio de la vida.
• Gratitud: reconocimiento por la importante ayuda, siendo ellos nuestros más íntimos
colaboradores, dando su vida para poder descubrir nuevas alternativas terapéuticas o
determinar la seguridad de ciertas moléculas en estudio, e inclusive para poder recibir

conocimientos durante la formación profesional.
Así mismo, se puede decir que la investigación biomédica en animales es éticamente aceptable,
si se sigue el principio de las tres R de la experimentación humanizada para con los animales,
propuesta por William Russell y Rex Burch, este principio es de gran importancia y debe de
tomarse en cuenta antes de iniciar una investigación y estipulan: (2,3)
• Reemplazar: buscar alternativas para no utilizar animales en la investigación, entre las
que se incluyen los ensayos bioquímicos in vitro, los cultivos celulares, los órganos
perfundidos, las rebanadas de tejido y las simulaciones por ordenador.
• Reducir: emplear cualquier estrategia que resulte en la utilización del menor número
posible de animales para obtener la misma cantidad de información o para maximizar la
información que se obtiene por animal.
• Refinar: evaluar el impacto de cualquier procedimiento o condición sobre el bienestar del
animal y desarrollar estrategias para minimizar ese impacto.
Actualmente no solo se elige a la especie animal de acuerdo con la facilidad de su manejo y

obtención, sino de acuerdo al tipo de experimento que se desea realizar, ya que se conoce que
en algunos procesos biológicos humanos se llevan a cabo de manera parecida a lo que ocurre
en un organismo animal. Basándose en lo anterior se presentan a continuación la descripción
del manejo de algunos de los animales que con mayor frecuencia se utilizan en el laboratorio:
(1, 4)
RATONES: Se toman del extremo de la cola con los dedos pulgar e índice de la mano derecha,
se coloca al animal sobre la mesa procurando que únicamente las extremidades delanteras se
apoyen en ellas y queden suspendidas las extremidades posteriores. Con el pulgar e índice de
la mano izquierda, se toma al animal de la nuca, pero al nivel de la garganta, al mismo tiempo
que la cola se sostiene, se sujeta con los dedos anular y meñique de la misma mano izquierda,
volteando la mano hacia arriba, quedará la porción ventral del ratón expuesta al operador para
que la mano derecha pueda usarse para administrar.
RATAS: Se debe evitar la manipulación de la rata con violencia, pues rápidamente aprende a
defenderse, tornándose difícil y peligroso su manejo; primero se debe tomar suavemente, pero
con seguridad con la mano dominante por el dorso y colocarla en la mesa sin soltarla, o bien,
por la cola procurando que solamente las extremidades anteriores se apoyen sobre la mesa.
Con la mano contraria se sujeta la piel del cuello, manteniéndola inmóvil, con la mano dominante
se puede estirar la cola o las patas posteriores (sin lastimarla) y se presenta a la otra persona
quien hará la administración o manipulación necesaria.
CONEJO: No se debe tomar por las orejas, sino por la piel del cuello con la mano no dominante
y la mano dominante se utiliza para sujetar las extremidades posteriores (estirando sin lastimar)
e inmovilizar al animal para poder manipularlo. Existen cajas especiales (cepos) provistas de
una abertura circular por donde sale la cabeza, lo que permite su fácil manejo.
62 LMMMIF
Revisa la norma, guías y documento que a continuación se te especifica:

Norma Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999. Especificaciones técnicas para la producción,
cuidado y uso de los animales de laboratorio.
http://www.fmvz.unam.mx/fmvz/principal/archivos/062ZOO.PDF
Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-
the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf
Guía para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio. http://www.uss.cl/wp-
content/uploads/2014/12/Gui%CC%81a-para-el-Cuidado-y-Uso-de-los-Animales-de-
Laboratorio.pdf
Principio de las 3R´s https://www.nc3rs.org.uk/
De manera adicional, revisar los siguientes videos:

https://youtu.be/ApcwVRzbydQ
https://youtu.be/nGEJJsMYkFE
https://youtu.be/5B67NaxNAuU
https://www.youtube.com/watch?v=Gs-ebUnPQEc
https://www.youtube.com/watch?v=jIGKgZPMYxI
https://www.youtube.com/watch?v=oYCmKIhveFY
Guantes de látex o
2 pares 1 piseta Etanol 70%
nitrilo
1 Cubrebocas 1 Cubo de 3X5 cm
Ratones macho de
4
25g
1 Rata macho de 180g

1 Pinza de ropa
Fragmento de madera
1
de 5X15cm
TOXICOLOGÌA:
Riesgos a la salud:
• Mordedura del ratón o rata.
• Caída del animal al piso.
Primeros Auxilios
En caso de mordedura:
• Lavar la herida con agua y jabón.
• Avisar inmediatamente al profesor y/o técnico.
Si el animal cae al piso:
• Evitar en la medida de lo posible gritar o correr, avisar al profesor.
Los animales son nobles siempre y cuando se les trate de manera correcta, de lo contrario
podrían reaccionar agresivamente
METODOLOGÍA:
Nota: El manejo de cada uno de los animales es importante en todo momento, recuerda que los
animales serán utilizados durante el curso para ofrecerles, a ti y a tus compañeros, una
oportunidad para aprender. De tal manera que, a lo largo de los experimentos, se deberán
aplicar las sustancias procurando el mínimo de sufrimiento al animal y llevando a cabo un buen
manejo del animal sin inducir algún sufrimiento innecesario.
El manejo de los animales y los ensayos se llevarán a cabo bajo las instrucciones de la Guía
de manejo y exploración que se muestra a continuación.
64 LMMMIF
Para cada parámetro estudiado se señalará su valor basal. Los signos que no se presentan en
condiciones normales (ejemplo: convulsiones) tienen un valor de 0. Cuando se presentan, el
valor máximo que puede anotarse en función de su intensidad es de 4. A otros signos que se
presentan normalmente (ejemplo: actividad locomotora) se les asigna un valor basal de 4 y a
su modificación, por el aumento o disminución, se les asigna un valor máximo de 8 o 0,
respectivamente.
GUÍA PARA LA OBSERVACIÓN Y EXPLORACIÓN DE LOS ANIMALES
1. Actividad locomotora. Desplazamiento espontáneo del ratón utilizando sus cuatro

extremidades. Para apreciar correctamente esta manifestación, tome simultáneamente al
animal control y al tratado y deposítelo sobre la superficie de la mesa.
2. Aumento de la base de sustentación. Inmovilidad o desplazamiento con las extremidades
en posición anormal. En casos extremos se arrastra o descansa sobre el abdomen.
3. Marcha tambaleante. Desplazamiento irregular e incordiando.
4. Temblor. Movimiento discreto y continuo del cuerpo o de alguna de sus partes.
5. Inmovilidad. Permanencia sin movimientos corporales, en el mismo sitio. Para apreciar
correctamente esta manifestación, tome al ratón de la cola y deposítelo suavemente en otra
parte de la mesa.
6. Piloerección. Levantamiento persistente de los pelos del dorso.
7. Signo de Straub. Levantamiento persistente de la cola, la cual toma forma de J.
8. Estereotipia. Movimiento repetitivo sin un propósito aparente (desplazamiento en círculos,
movimientos masticatorios, acicalamiento continuo).
9. Convulsiones. Movimientos alternados de reflexión y estiramiento se puede apreciar
hipertensión del tren posterior y, habitualmente, se presenta muerte.
10. Pasividad. Ausencia de respuesta a un estímulo. Sople con fuerza sobre el ratón y
observe su conducta.
11. Escape. Movimiento de huida al intentar tomar al animal por el dorso.
12. Vocalización. Chillidos durante la realización de la maniobra anterior.
13. Facilidad de manejo. Grado de dificultad o resistencia que presenta un animal para ser
manipulado.
14. Tono muscular. Dureza muscular que se percibe al tacto. El animal debe ser colocado
sobre la palma de la mano, la cual debe cerrarse con suavidad.
15. Fuerza muscular. Resistencia que opone un animal a la tracción. Para esta maniobra
coloque al animal sobre una rejilla, tómelo de la punta de la cola y tire hacia atrás suavemente.
16. Cuerda tirante. Permanencia y desplazamiento, por medio de las patas delanteras, en una
cuerda. Coloque al ratón en el centro de la cuerda y observe su comportamiento. Los animales
no afectados pueden permanecer por más de 5 segundos.
17. Plano inclinado. Desplazamiento a lo largo de una superficie inclinada a 45°C. Coloque al
animal en el centro de la superficie inclinada y observe su comportamiento. Los animales no
afectados pueden caminar fácilmente sobre este dispositivo. Si el animal está afectado
permanecerá inmóvil o se deslizará.
18. Catatonia. Inmovilidad en alguna posición forzada. Tome al ratón por el dorso y por la cola
y trate de que descanse una de sus patas delanteras sobre un cubo de 3 a 5 cm. Si permanece
en esta posición más de 5 segundos anótelo como catatonia.
19. Abertura palpebral. Grado en que mantienen su posición normal los párpados sobre el
globo ocular. Durante el curso de la maniobra antes citada determinar la existencia de esta
manifestación.
20. Lagrimeo. Presencia de secreciones sobre el globo ocular y en los párpados.
21. Salivación. Presencia de secreciones alrededor del hocico.
22. Reflejo nociceptivo. Movimiento brusco del animal, habitualmente acompañado de
chillidos, en respuesta a la aplicación de un estímulo nociceptivo. Coloque al animal sobre la
rejilla y haga tracción jalándolo de la cola. Aplique la pinza de 1 cm de la base y retire
rápidamente sus manos, la respuesta es positiva cuando el animal muerde la pinza en un
periodo de 10 segundos.
RESULTADOS:
Observar el comportamiento del animal y realizar una tabla comparativa de los parámetros,
donde se vea reflejado el comportamiento normal de un ratón y de una rata.
Preparar una guía de manejo del animal, especificando las necesidades básicas de un animal
de investigación, describir su manipulación y los métodos de eutanasia según la NORMA Oficial
Mexicana NOM-062-ZOO-1999, Especificaciones técnicas para la producción, cuidado
Y uso de los animales de laboratorio.
Sanitas y aserrín sucio colocarse en una bolsa de plástico y llevarse al contenedor indicado por
el profesor o técnico de laboratorio.
Discutir acerca del comportamiento del animal, indicando las diferencias entre las dos especies
evaluadas. Determinar las ventajas y desventajas en el uso de rata y ratón.
66 LMMMIF
CONCLUSIONES:
Concluir según los objetivos de la práctica.
BIBLIOGRAFÍA:
1. Fuentes, F., Mendoza, R., Rosales, A. & Cisneros, R. (2008). Guía de manejo y cuidado de
animales de laboratorio. Perú, Lima. Instituto Nacional de Salud (Perú). p. 52
2. Cardozo de Martínez, C. A. & Mirad de Osorio, A. (2015). Ética en investigación con
animales: una actitud responsable y respetuosa del investigador con rigor y calidad
científica. Revista Latinoamericana de Bioética, 8(15), 46-71.
3. Russell, W. M. S. and Burch, R. L. (1959). The Principles of Humane Experimental
Technique. London: Methuen & Co. Special edition published by Universities Federation
for Animal Welfare (UFAW), 1992.
4. National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals. National
Academy Press, Washington. 1997
5. NORMA Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999, Especificaciones técnicas para la
producción, cuidado y uso de los animales de laboratorio.
PRACTICA 6: INMUNIZACIÓN DE ROEDORES
OBJETIVOS:
Generar una respuesta inmune específica en ratón contra una proteína de suero humano.
Evaluar la generación de una respuesta inmune específica en ratones.
Determinar la importancia de los Adyuvantes en la generación de Anticuerpos.
COMPETENCIAS:
INTRODUCCIÓN:
La inmunización es el proceso por el cual se introduce en el organismo un antígeno para generar
inmunidad específica que puede ser humoral o celular. Este proceso es el que se utiliza para
generar inmunidad específica mejor conocido como vacunación.
Existen diferentes vías por las cuales se puede llevar a cabo la inmunización: Vía Oral, Vía
Subcutánea, Vía Parenteral (Intravenosa e Intramuscular) o Intranasal.
Para que una vacuna resulte eficaz debe de tener las siguientes características:
• Activar células presentadoras de antígenos.
• Tener una buena estimulación de linfocitos T y B.
• Garantizar una adecuada memoria inmunológica para poder generar anticuerpos contra los
microorganismos patógenos.
• Seguridad
68 LMMMIF
La respuesta inmunológica que se obtiene varía dependiendo de la vía de administración, la

dosis del antígeno, la frecuencia con que se repiten las inmunizaciones, las especies animales
inmunizadas y las características particulares del mismo.
Algunos antígenos requieren de ciertas sales y aceites inorgánicos que al ser añadidos o
emulsificados con el antígeno ayudan al organismo a estimular la producción de anticuerpos, lo
cual garantiza una mejor protección ante dicho antígeno. Dichoas sales agentes se denominan
Adyuvantes. Loas más utilizadoas en vacunas para humanos son en forma de sales, como el
hidróxido de aluminio, el fosfato de aluminio y el fosfato de calcio.
Para la inmunización de animales en general se utilizan técnicas asépticas. Los ratones se
pueden inyectar por vía intravenosa en las venas laterales de la cola, por vía intraperitoneal o
intramuscular. La dosis de antígeno varía entre 1 a 50 g por ratón, en un volumen máximo de
0.25 ml dependiendo si es un antígeno soluble y se utiliza adyuvante o no.
Esta práctica será desarrollada en varias secciones. La primera consiste en preparar el material
para inmunizar realizar la primera inmunización. Las siguientes dos semanas se “retará” o re-
inmunizará a los animales una vez por semana. A la cuarta semana se hará el sangrado total
del animal. Se obtendrán los sueros obtenidos y serán almacenados a -20° C, hasta que sean
probados en las prácticas de dot-blot, Western-Blott y ELISA.

Tubos de plástico de 15 ml Adyuvante incompleto
2
limpios y estériles. de Freund (AIF).
Tubos eppendorf limpios y

2 estériles.
Pipetas de 1 ml, limpias y

estériles, o Micropipetas.
PBS estéril
Agitador tipo Vortex.
Mechero
3 ratones Balb/c por equipo
Proteína para inmunizar,

p.e albúmina sérica bovina.
Gasas.
Algodón.
3 Jeringas de 1 ml con aguja

anaranjada.
Jeringa de 3 ml con aguja

verde.
TOXICOLOGÌA:

70 LMMMIF
Riesgos a la salud:
Primeros Auxilios:
[Introduzca los primeros auxilios en caso de: inhalación, digestión, contacto piel y ojos].
METODOLOGÍA:
PROCEDIMIENTO.
PARTE I:
A) Preparación del antígeno con adyuvante.
1) Limpie bien la mesa de trabajo antes de iniciar. Prenda el mechero 10 minutos antes de iniciar
la preparación del antígeno.
2) Cerca del mechero diluya la proteína en PBS estéril a una concentración de 200 g por ml,
prepare 0.2 ml.
3) En el vortex, y cerca del mechero, agregue gota por gota 0.2 ml de Adyuvante Incompleto de
Freund. El vortex tiene que estar encendido y el tubo agitándose, para formar una emulsión.
4) Coloque la emulsión en una jeringa de 1 ml, coloque la aguja, con aguja y apague el mechero.
B) Preparación del antígeno sin adyuvante.
1) Cerca del mechero diluya la proteína en PBS estéril a una concentración de 200 g por ml,
prepare 0.2 ml.
2) En el vortex, y cerca del mechero, agregue gota por gota 0.2 ml de AIF. El vortex tiene que
estar encendido y el tubo agitándose, para formar una emulsión.
3) Cargue la solución en una jeringa de 1 ml con aguja y apague el mechero.
INMUNIZACION
A. Inmunización de ratones por vía Intraperitoneal.
Se requieren 3 ratones por equipo, uno que se utilizará sólo con el diluyente (PBS), otro
inmunizado únicamente con el antígeno y otro con antígeno más adyuvante.
Cada equipo marcará e identificará los ratones que va a utilizar. Se pueden marcar con un
marcador indeleble en la base de la cola, por ejemplo una rayita corresponde al ratón tratado
solo con PBS, dos rayitas inmunizado con antígeno solo y tres rayitas antígeno más adyuvante.
Tiene que volver a marcarlos dos veces por semana, para que no se pierda la marca y pueda
identificarlos correctamente.
1) El ratón se sostiene por la cola con la mano derecha y con el pulgar y el índice de la mano
izquierda se toma se toma en un pliegue de la piel por atrás del cuello.
2) El ratón se levanta mientras la cola se mantiene tiesa, y se le da vuelta de manera que
presente el abdomen al operador.
3) La cola se coloca se coloca entre la palma de la mano y el cuarto y quinto dedos, de manera
que el ratón esté sostenido enteramente con la mano izquierda.
4) La pata derecha trasera se estira y se le mantiene junto con la cola, dejando la mano derecha
libre para practicar la inyección.
5) La aguja se inserta en un ángulo moderado directamente en la cavidad abdominal, y después
se retracta ligeramente.
6) Se inyecta la solución y se retira la aguja.
PARTE II:
A los 7 y 14 días se volverán a inocular, el ratón control sólo con PBS estéril, y los ratones 2 y
3 con antígeno SIN ADYUVANTE, también el ratón que en la primera fase se utilizó adyuvante,
ya no lo requiere. Tenga cuidado, ya que puede provocar un gran sufrimiento o muerte al
animal si lo vuelve a retar con adyuvante.
PARTE III.
A los 8 días de la última inmunización, los ratones se sangrarán a blanco por punción cardiaca.
El suero se almacena en tubos Eppendorf estériles a temperatura ambiente, durante 30 min. Se
centrifugan los tubos y se colecta el suero en Eppendorf nuevos estériles.
Este suero será utilizado en las prácticas de Dot-Blot, Western-Blot y ELISA, para determinar la
producción de IgM e IgG contra la proteína inoculada.
RESULTADOS:
72 LMMMIF
[Introduzca tablas que faciliten la comprensión y tratamiento de datos obtenidos]
CÁLCULOS

1. ¿Qué es un antígeno?
2. Defina lo que es un adyuvante.
3. ¿Qué importancia tienen las vías de inoculación en la generación de anticuerpos?
4. ¿Qué es la inmunización?
5. Indique la diferencia entre suero y anti-suero
CONCLUSIONES:
[solo indicativo].
BIBLIOGRAFÍA:
Manual de Inmunología. Morilla G. A., Baustista G., C R. DIANA . México. 1986.

Inmunoquímica Experimental. 2a. Ed. Kabat. E. A. La Prensa Médica Mexicana. México.
1968
Inmunología e Inmunoquímica. 5a. Ed. Margni. R. A. Médica Panamericana. Buenos Aires,

Argentina. 1996
Inmunología. 4a. Ed. Roitt I., Brostoff, J., Male, D. Harcourt Brace. Madrid, España. 1998
74 LMMMIF
PRACTICA 7: FARMACOCINÉTICA ADME
OBJETIVOS:
Que el alumno pueda obtener parámetros farmacocinéticos utilizando un modelo

abierto de un compartimiento.
Que el alumno pueda comparar dos sistemas y pueda identificar cada uno de ellos con
el análisis de los resultados.
COMPETENCIAS:
El alumno aprenderá a interpretar datos y analizar el comportamiento de dos diferentes

sistemas.
El alumno será capaz de utilizar tecnologías para poder resolver problemas.
El alumno será capaz de identificar dos vías de administración solo analizando el
comportamiento de un sistema y planteando posibilidades
INTRODUCCIÓN:
La farmacocinética es todo proceso o acción del organismo sobre un fármaco, está conformada
por diferentes fases: la absorción, la distribución, el metabolismo y la excreción o eliminación.
Es de gran interés farmacéutico, puesto que su principal objetivo es la individualización
posológica u optimización de los tratamientos farmacológicos, a fin de alcanzar la máxima
eficacia terapéutica con la mínima incidencia de efectos adversos (1).
La farmacocinética estudia el curso temporal de concentraciones de un fármaco en el

organismo, construye modelos para interpretar estos datos y por tanto para valorar o predecir
la acción terapéutica o toxicológica de un fármaco. Es el cambio de concentración del fármaco
mediante su absorción, distribución, metabolismo y excreción. Se puede representar en un
gráfico con la concentración de fármaco contra tiempo (figura 1). Datos como la concentración
máxima alcanzada (Cmáx), el ABC, la exposición acumulada al fármaco son datos de relevancia
(2).
Los fármacos se utilizan partiendo de criterios preestablecidos anteriormente en diversos

estudios basándose en la estrategia de “acierto-error”. Este empirismo basado en la respuesta
clínica o bioquímica en relación con la presencia del fármaco, no es posible en todos los casos,
siendo necesarios métodos alternativos aplicados a la situación individual de cada paciente.
Uno de estos métodos es la farmacocinética clínica que emergió como una nueva disciplina a
finales de la década de los 60, ofreciendo una importante proyección clínica para el farmacéutico
de hospital con una sólida base científica (1).
Figura 1: Representación práctica de los parámetros farmacocinéticos
Revisar sobre farmacocinética, los diferentes modelos según los compartimentos implicados y
revisar cómo aplicar regresiones lineales en calculadora y Excel.
Llenar tabla de toxicología.
Revisar siguientes videos:
76 LMMMIF
https://www.youtube.com/watch?v=YIKjP4XpUu0
https://www.youtube.com/watch?v=VF06Nm_PcsY
https://www.youtube.com/watch?v=9zkFm09UhG8
https://www.youtube.com/watch?v=l85tUR7LFyg&t=304s
https://www.youtube.com/watch?v=znzV1cyH5Gs
MATERIAL Y REACTIVOS:C
Botellas de
Venoclisis solución salina
1 2
normogotero al 0.9% de 250
ml
Tubos de hemólisis
20 1 NaCl
13 x 100
Pipetas graduadas
3 1 Agua destilada
de 5mL
Azul de metileno al
2 Soportes universales 100 ml
1%
10 ml Etanol al 70%
1 Pinzas para soporte
Parrilla de
1 calentamiento con
agitación
Vasos de pp de
2
250 ml
Matraces kitazato
2
de 250 ml
2 Mangueras de latex
Agitadores
2
magnéticos
Celdas para
2 espectro o placa de
96 pozos
1 Piseta
Espectrofotometro o lector
1
de placas de ELISA
TOXICOLOGÌA:
AZUL DE METILENO
El azul de metileno puede causar toxicidad aguda al tener contacto con la piel o
los ojos, al ser inhalado, ingerirse de manera oral
Primeros auxilios
Inhalación: aire fresco. Llamar inmediatamente al médico. Tras parada

respiratoria: inmediatamente respiración instrumental. Aplicar oxígeno en caso
necesario.
En caso de contacto con la piel: Quitar inmediatamente todas las prendas

contaminadas. Aclararse la piel con agua/ducharse. Llame inmediatamente al
médico.
En caso de contacto con los ojos: Tras contacto con los ojos: aclarar con
abundante agua. Consultar al oftalmólogo. Retirar las lentillas.
Por ingestión Tras ingestión: aire fresco. Hacer beber etanol (p. ej. 1 vaso de
una bebida alcohólica del 40%). Consultar inmediatamente al médico (referirse al
metanol). Solamente en casos excepcionales, si no es posible la asistencia
médica dentro de una hora, provocar el vómito
77
78 LMMMIF
METODOLOGÍA:
Construcción de una curva estándar con solución de azul de metileno:

1. Rotular 7 tubos, uno como blanco y el resto del 1 al 6.
2. En el primer tubo colocar 3.9mL de solución salina al 0.9% y 0.1mL de
azul de metileno al 1% (dilución final 1/40).
3. El resto de los tubos colocar 2mL de solución salina y de manera serial
colocar 2mL de la solución previa como se muestra en la figura 1 (excepto
al tubo blanco).
4. Al tubo blanco solo colocar
5. Colocar las muestras por duplicado en celdas para espectrofotómetro o
en una placa de 96 pozos, leer a 590nm.
Figura 2: Dilución serial de azul de metileno para curva estándar
RESULTADOS:
Tabla 1: ABSORBANCIAS OBTENIDAD DE LA CURVA ESTÁNDAR DE AZUL DE METILENO (COMPLETAR LOS

TADOS FALTANTES).
Curva Estándar de azul de metileno

No ug/mL Absorbancia promedio D.O
Blanco 0.1001 0.098
6 0.1556 0.1441
5 0.1891 0.1809
4 0.3236 0.319
3 0.458 0.4382
2 0.8635 0.8176
1 1.534 1.4989
Desecha los residuos en los contenedores asignados para ello
Que pudiste observar en ambos sistemas, ¿que te refleja?
CONCLUSIONES:
Concluye en concordancia al objetivo
BIBLIOGRAFÍA:
1. Calvo, M. (2001). Farmacocinética clínica. Farmacia hospitalaria.

Disponible en:
https://www.sefh.es/bibliotecavirtual/fhtomo1/cap212.pdf. Fecha de
acceso: Julio 2020.
2. Carrillo, R. (2012). La importancia de los parámetros

farmacocinéticos y farmacodinámicos en la prescripción de
antibióticos. Fecha de acceso: Julio 2020.
79
80 LMMMIF
PRACTICA 8: VÍAS DE ADMINISTRACIÓN
OBJETIVOS:
El alumno reconocerá las ventajas y desventajas de cada una de las vías de
administración.
El alumno elegirá la vía de administración más adecuada y adquirirá la
habilidad en la administración de medicamentos por diferentes vías.
El alumno conocerá los factores que determinan su aplicación y determinará
el efecto de un fármaco con relación a las diferentes vías de administración.
COMPETENCIAS:
[Introduzca las competencias buscadas para la práctica realizada, recuerde que
el verbo con el que se inicia se expresa en tiempo presente]
INTRODUCCIÓN:
Un capítulo propio de la farmacología aplicándose ya como una técnica, se refiere

a los métodos de las vías de administración de los fármacos. Las vías de
administración determinan en gran parte la velocidad y la intensidad de la acción
del fármaco y ésta a su vez es dependiente de las dosis y grado de absorción,
nivel de concentración en sangre etc., solamente la experimentación puede
determinar cuál vía de administración es la más apropiada para cada fármaco en
particular.
Las vías de administración son diferentes según el caso, la edad, sexo,

enfermedad, economía del paciente etc. Las razones pueden ser múltiples y van
desde una simple imposibilidad para administrar por determinada vía debido a
solubilidad, distribución, biotransformación y excreción, que pueden provocar
daño, que inclusive puede llegar a ser fatal a nuestro paciente o animal de
experimentación.
Las vías de administración más usadas son las siguientes: vía oral, rectal,
intrarraquídea, intravenosa, parenteral, intramuscular, subcutánea, intradérmica,
intraperitoneal, por inhalación, aplicación sobre mucosas y piel (tópica), y
aplicación de fármacos por iontoforesis.
La farmacológica experimental utiliza animales de laboratorio y la aplicación de
drogas por diversas vías de administración a los mismos. Es conveniente por lo
tanto que el alumno se familiarice con dichas vías, por lo que a continuación se
hará una evaluación de algunas de ellas.
El conocimiento de estos factores determina en todos los casos la vía de
administración que permite los mejores resultados. Teniendo en cuenta el
concepto anterior, se llega a la conclusión de que: NO SE PUEDE, NI SE DEBE
UTILIZAR CUALQUIER VÍA DE ADMINISTRACIÓN.
[Introduzca sugerencias sobre actividades que el alumno deba llevar a cabo antes
del día de ejecución de la práctica, con la finalidad de que el alumno adquiera los
conocimientos básicos y fundamentales para una buena realización de práctica,
por ejemplo: páginas web, videos o links que puede investigar, cuestionarios o
tareas específicas a resolver, etc.]
81
82 LMMMIF

Agujas hipodérmicas
1 (por alumno)
Tapaboca
1 (por alumno)
Guantes
1 (por alumno)
Cánula para
administración
gástrica, jeringa para
1 (por alumno)
insulina de 50U (0.5
ml)
Balanza
1 (por alumno)
Bote de plástico o caja
1 (por alumno)
de cartón
Ratones
6
Fenobarbital sódico,
0.9% solución fisiológica al
0.9 %
MEDIDAS DE SEGURIDAD:
• Mantener la bata cerrada.
• Uso de guantes y tapaboca para la manipulación de los animales.
• Extrema precaución en el manejo de las jeringas.
• Evitar platicar mientras se realice la administración para no picarse con la
aguja.
• Identificar la zona de aplicación antes de picar al animal.
• Administrar con seguridad para evitar lastimar al animal.
TOXICOLOGÌA:
[LA TOXICOLOGÍA PUEDE CONSIDERARSE COMO UNA ACTIVIDAD

PRELIMINAR, Y SER UNA TAREA ENCOMENDADA PARA LOS
ESTUDIANTES DENTRO DE CADA SESIÓN, SI ASÍ SE DESEA PLANTEAR]
[Introduzca generalidades como fórmula química, estado físico, punto de fusión,

punto de ebullición, clasificación (ácido, base, sal, reactivo redox, solvente, etc.)]
Riesgos a la salud:
Picarse con la aguja.

Mordedura del animal.
Primeros Auxilios:
En cualquiera de los dos casos, lavarse con agua y jabón, avisar inmediatamente
al profesor y/o al técnico en turno.
METODOLOGÍA:
Pesar a las ratas, anotando los pesos correspondientes.

Se numeran las ratas del 1 al 5. Posteriormente se administra 30 mg/kg de
fenoobarbital sódico a cada ratón en un volumen de 0.5 ml. por una de las vías
siguientes:
VIA ORAL:
Se realiza con la ayuda de una aguja con oliva, la cual se introduce por el
diastema, hasta las 2/3 partes de la aguja, de esta manera se administra un
volumen de 0.5 ml de solución. También puede utilizarse una sonda gástrica
procurando no introducirla en tráquea.
VIA PARENTERAL:
a) Vía subcutánea: Se realiza en la región dorsal de la espalda del animal, la
aguja debe quedar debajo de la piel para realizar la administración. Se
83
84 LMMMIF
administra el mismo volumen de solución, observando la formación de una

ámpula.
b) Vía endovenosa: La administración se efectúa en la cola del animal, la cual

previamente se introduce en agua a 45°C, hasta provocar la dilatación venosa
y después se liga la base de la cola. Una vez localizada la vena se inyecta 0.5
ml de la solución.
c) Vía intraperitoneal: Es la vía que más facilidades nos ofrece cuando el material
biológico es pequeño y es la vía que más se utiliza en prácticas de
farmacología. Se toma al animal firmemente por la nuca con una mano,
ejerciendo presión para inclinar la cabeza y llevarla sobre el lomo, manteniendo
al animal en esta posición. Con la otra mano se sujeta de las extremidades
inferiores y otra persona administra en el área abdominal, tomando como
referencia la parte superior de la misma extremidad. La aguja se introduce en
un ángulo de aproximadamente 45°, cuidando no perforar los intestinos.
d) Vía intramuscular: Cuando una sustancia es de naturaleza oleosa, se utiliza

de preferencia esta vía, ya que, si usáramos la vía endovenosa, por ejemplo:
tendríamos el peligro de producir un embolo graso que puede ser fatal. Se
localiza el músculo superior de la pata del ratón, inyectándole 0.5 ml de
solución.
Se observará detenidamente a los animales, anotando en el protocolo la
frecuencia y amplitud de la respiración, la respuesta superficial y profunda al dolor,
los reflejos corneal y palpebral, el ritmo cardiaco, el diámetro pupilar, reflejo a la
luz, actividad espontánea y reflejos normales antes y después de los intervalos de
administración de la droga: a los 15, 30 y 60 minutos.
Cada estudiante observará el estado de anestesia en que se encuentran los
ratones durante el curso del experimento.
MEDIDAS DE SEGURIDAD:
• Mantener la bata cerrada.
• Uso de guantes y tapaboca para la manipulación de los animales.
• Extrema precaución en el manejo de las jeringas.
• Evitar platicar mientras se realice la administración para no picarse con la
aguja.
• Identificar la zona de aplicación antes de picar al animal.
• Administrar con seguridad para evitar lastimar al animal.
RESULTADOS:
Es conveniente realizar tabulaciones para cada mesa y posteriormente, comentar

los datos para realizar la tabulación de todo el grupo.
Después de ser administrado el fármaco por cada una de las vías señaladas se
tabularán los datos siguientes:
1. La intensidad del efecto máximo logrado.
a. Depresión.
b. Hipnosis.
c. Anestesia.
2. Tiempo de latencia (lapso transcurrido desde la administración a la pérdida
de reflejos normales).
3. Duración de la hipnosis y de la anestesia.
CÁLCULOS
[Introduzca los cálculos requeridos que el alumno debe realizar para el

cumplimiento de objetivos y competencias establecidos]
85
86 LMMMIF
[Introduzca las especificaciones para el tratamiento de los residuos generados por

la metodología realizada]
[Puede incluir preguntas clave que lleven al alumno a la reflexión y comprensión

de resultados].
CONCLUSIONES:
[solo indicativo].
BIBLIOGRAFÍA:
1. [Introduzca las fuentes consultadas en formato APA] [Recuerde

referenciar imágenes, tablas y texto]
PRACTICA 9: ABSORCIÓN DE FÁRMACOS Y PH.
OBJETIVOS:
El alumno determinará a través de un modelo sencillo, el efecto de pH sobre
las propiedades fisicoquímicas de los fármacos que favorecen su absorción.
COMPETENCIAS:
Capacidad del alumno para el aprendizaje de forma autónoma antes,

durante y posterior a la práctica.
Capacidad de aprender y actualizarse permanentemente.
Capacidad de comunicación escrita.
Habilidades en el uso de las tecnologías de la información y de la
comunicación.
Habilidad para el trabajo en forma colaborativa.
Capacidad para identificar, plantear y resolver problemas.
Capacidad para organizar y planificar el tiempo.
Capacidad de trabajo en equipo.
Compromiso ético
87
88 LMMMIF
INTRODUCCIÓN:
Para lograr que un fármaco se distribuya y se observen los efectos
terapéuticos que este produce en el organismo, se requiere que las
moléculas del fármaco se desplacen desde el lugar donde se administró
hasta el torrente circulatorio, este proceso es denominado absorción. (1).
Los fármacos pueden ser absorbidos de forma pasiva atravesando las

células mediante difusión lipídica, mediante el cual el fármaco se disuelve en
los componentes lipídicos de las membranas celulares, o a través de la
migración de poros acuosos presentes en las membranas celulares,
denominado difusión acuosa, Así mismo, algunos fármacos se absorben
mediante mecanismos de transporte activo o difusión facilitada. (2)
Uno de los factores indispensables a considerar para favorecer la absorción

de ácidos y bases débiles es el efecto del pH. Gran parte de los fármacos
son ácidos o bases débiles que existen en forma ionizada como no ionizada,
en específico, solo la forma no ionizada de los fármacos es lo bastante
soluble en membranas lipídicas como para ingresar a través de ellas. La
proporción entre la forma protonada y la no protonada de estos fármacos se
puede calcular mediante la fórmula de Henderson-Gasselbalch. (3).
El alumno deberá revisar los conceptos de pH, coeficiente de partición y

absorción.
El alumno deberá buscar los factores que modifiquen la absorción de
fármacos.
Estudiar sobre el pH y como determinar unidades protonadas y no
protonadas mediante la fórmula de Henderson-Gasselbalch.
Llenar tabla de la sección de toxicología de la práctica.
De manera adicional revisar los siguientes videos:
https://www.youtube.com/watch?v=bhbAeCIFVwQ&t=206s
https://www.youtube.com/watch?v=5dPAeakTnlA
https://www.youtube.com/watch?v=DbU_ZcCtTp4
https://www.youtube.com/watch?v=92991PqXw6Q

Frasco de 50 ml
Tubos De ensaye
15 1 conteniendo
de 13X100 mm
NaOH 1N
Propipeta Frasco de 50 ml
1 1
conteniendo HCl 1N
Pipetas graduadas
3 de 5 mL 250 mL Agua destilada
Vasos de pp de 500
2 mL
Gradilla para tubos

1 de ensaye
1 Parrilla electrica
Vaso de pp de 250
2 mL
Tiras reactivas para

medir pHNavaja o
11
bisturí
DE CASA

Col morada o repollo
1 Cuchillo grande 1/4
morado
1 Tabla de picar mediana ½ litro Aceite de cocina
Coladera mediana de
1
agujeros pequeños
2 Vaso de pp de 500mL
1 Regla de 20 a 30cm
89
90 LMMMIF
METODOLOGÍA:
Preparación del extracto:

1. Cortar la col morada o repollo, con ayuda del cuchillo y la tabla, finamente
en forma de juliana.
2. Poner a calentar aproximadamente 250mL de agua destilada en un vaso
de pp de 500mL.
3. Una vez que comience a hervir el agua, introducir la col picada y dejar
durante algunos minutos (2 a 5 minutos) hasta que se torne el agua a un
color morado intenso.
4. Con ayuda del colador, colocar el extracto en un vaso de pp de 500mL
limpio y dejar enfriar.
Preparación del carrusel de colores:
1. Etiquetar con un marcador permanente o un masking tape, 11 tubos de
ensaye de 13 x 100.
2. Colocarlos en una gradilla y agregar a cada uno 3mL del extracto de col
morada.
3. El tubo no 6 es el control, del 5 al 1 se agregan gotas de HCl hasta que
tengas diferentes tonalidades o colores en cada uno, del 7 al 11 se le
agregan NaOH hasta tener tubos de diferentes tonalidades o colores. Al
final obtendrás 11 tubos de diferente tonalidad o color.
4. Tomar el pH de cada tubo (incluyendo al tubo control) y ajustar a un
volumen a 3mL.
Prueba de Coeficiente de partición

1. Añadir 5mL de aceite comestible a cada tubo (incluyendo al tubo control).
2. Agitar vigorosamente cada tubo hasta que las dos fases se unan.
3. Dejar reposar y que se separen nuevamente ambas fases.

4. Con una regla medir la altura total de cada tubo y la altura de cada fase.
5. Determinar el coeficiente de partición de cada tubo.
Nota: En casa se puede hacer este experimento pero utilizando utensilios de la

cocina, como un pequeño pozuelo para preparar el extracto en la estufa y colar y
colocar en un recipiente.
• Puedes utilizar pequeños vasos de plástico o vasos de gelatina desechable
pequeños.
• Para ajustar el pH pueden utilizar jugo de limón para el ácido y bicarbonato
de sodio para la base.
• Utilizar cualquier aceite de cocina
RESULTADOS:
Durante el experimento realizado en un grupo anterior se obtuvieron los

siguientes resultados, podemos observar en la figura 1 la gama de colores que
tomo el extracto cuando se modificó el pH con el ácido clorhídrico (1-5) y con el
hidróxido de sodio (7-11).
Cuando se adiciono el aceite después de la toma del pH y se agito vigorosamente

se separaron ambas fases de cada tubo, y como se puede observar en la figura 1
el comportamiento de ambas fases Posterior a la adición del aceite y agitación
vigorosa se dejaron reposar los tubos y se obtuvieron las diferentes fases en cada
tubo como se muestra en la figura 1.
91
92 LMMMIF
Figura 1: Tubos con extracto de col morada: A) ajuste de pH con HCl y NaOH y B) fases oleosa o acuosa posterior
a la adición de aceite comestible.
Extracto de col sin químicos se puede desechar en la tarja.

Extractos con aceite comestible en el recipiente asignado por el técnico.
RESULTADOS:
Como se puede observar en la tabla 1, se encuentran los pH obtenidos después

de adicionar el ácido o la base correspondiente a cada tubo, así como las alturas
de los tubos de ambas fases y de la fase lipídica u oleosa. Completar la tabla
obteniendo la fase acuosa y posteriormente el coeficiente de partición.
..
Tabla 2:RESULTADOS DE PH Y ALTURAS DE LOS EXTRACTOS POSTERIOR DE LA ADICIÓN DEL ACEITE
COMESTIBLE Y AGITACIÓN VIGOROSA
No Tubo pH Total Fase lipídica Fase acuosa C.P

1 0.87 5.0 1.6
2 1.32 5.1 1.6
3 1.84 5.0 1.5
4 3.15 4.8 1.5
5 3.99 5.0 1.9
6 6.01 5.0 1.8
7 6.38 5.0 1.8
8 6.80 5.0 2.1
9 7.14 5.0 2.1
10 7.55 5.4 2.3
11 8.01 5.4 2.0
Realizar gráficos comparativos que apoyen al análisis del comportamiento del

coeficiente de partición frete al pH y con ello el proceso de absorción.
En el caso de esta práctica es necesario que el alumno discuta el comportamiento
del coeficiente de partición de cada tubo según su pH, debe investigar y justificar
según las propiedades del extracto de col morada.
CÁLCULOS
Coeficiente de partición visual: (altura de la fase lipídica) / (altura de la fase

acuosa)
DISCUSIÓN:
1. ¿Qué factores determinan la absorción de un fármaco?

2. ¿Qué es y qué indica el coeficiente de partición de una sustancia?
3.- Escribe y menciona los factores más importantes de la ecuación de Henderson-
Hasselbach.
93
94 LMMMIF
CONCLUSIONES:
Realiza la conclusión en concordancia con el objetivo
BIBLIOGRAFÍA:
1. Adame, S. (2015). SCRIBD. Obtenido de Determinación de pH y

absorción de fármacos:
2. https://es.SCRIBD.net/sullyadame/practica-1-45634278
3. Armijo, J., (2004). Absorción, distribución y eliminación de los fármacos.
Recuperado el 14 julio del 2020.
http://www.pdcorynthia.sld.cu/Documentos/estudiantes/Absorci%F3n%20
distribuci%F3n%20y%20eliminaci%F3n%20de%20los%20f%E1rmacos
PRACTICA 10 “INFLUENCIA DEL PH EN LA ELIMINACIÓN DE

FÁRMACOS”
OBJETIVOS:
• El alumno determinará la influencia del pH urinario sobre la excreción de

un fármaco, esto mediante la cuantificación de su metabolito excretado en
la orina.
COMPETENCIAS:
El alumno analiza el comportamiento en la eliminación de un fármaco

según el pH de la orina.
El alumno comprueba la eliminación de un fármaco mediante otras vías.
INTRODUCCIÓN:
La eliminación es el paso de un fármaco de la circulación hacia el exterior del

organismo. El riñón es el principal órgano excretor, es el responsable de eliminar
las sustancias con características hidrosolubles. Otro medio de eliminación es el
sistema biliar, el cual también elimina algunos fármacos y metabolitos menos
hidrosolubles. Los fármacos, además pueden eliminarse por otras vías, entre las
cuales podemos mencionar a los pulmones, la saliva, el intestino, el sudor y la
leche materna, la contribución global de estas vías suele ser pequeña.
(Pierre, 2010)
Los fármacos al ser excretados por riñón, alcanzan en la orina concentraciones

mucho más elevadas que en el plasma sanguíneo. El plasma sanguíneo se filtra
completamente en los capilares del glomérulo renal y los fármacos que están
disueltos en el plasma pueden pasar así a la luz de la nefrona. (Lorenzo, 2008) La
velocidad de eliminación depende de la concentración en el plasma sanguíneo, y
esta a su vez depende de la velocidad de absorción y también de la fijación de las
sustancias en el organismo. (Pierre, 2010)
El Ácido acetilsalicílico es un polvo cristalino derivado del ácido salicílico. Se

absorbe mayoritariamente en el duodeno y sufre efectos de primer paso intestinal
y hepático. La fracción minoritaria no metabolizada, se excreta por orina sufriendo
procesos de filtración glomerular, secreción y reabsorción tubular. (Santos, 2019)
95
96 LMMMIF
Revisar sobre la eliminación de fármacos y que factores modifican a este

proceso.
Revisar sobre el Ácido acetil salicílico y el ácido fólico, cuáles son sus
metabolitos y sus vías de eliminación.
De manera adicional, revisar los siguientes videos:

https://www.youtube.com/watch?v=WQKKZXi8tYI
https://www.youtube.com/watch?v=9MX_oc6iL4Q
https://www.youtube.com/watch?v=i8xghf5_AGo&t=118s

Matraz volumétrico
1 20 mg Salicilato de Sodio
250mL
Matraz volumétrico de Nitrato férrico-
1 10 g
25mL Nonahidratado
Matraz volumétrico de
1 10 g Cloruro mercúrico
10mL
Pipetas volumétricas de
3 30 mL Ácido clorhídrico 1N
3mL
Pipeta volumétrica de
1 500 mL Agua destilada
5mL
1 Gradilla
Tubos de ensaye de
12 CANTIDAD FÁRMACO
13x100
1 Balanza analítica 2 tabletas Aspirinas de 500mg
Ácido ascórbico
1 Espectofotómetro 2 tabletas
efervescentes
Celdas de plástico o
6 8g Bicarbonato de sodio
cuarzo
Metodología en casa:

1 Hoja de papel 2mL Cloro comercial
1 pqt Cotonetes
CANTIDAD FÁRMACO
2 tabletas Ácido Fólico
Ácido ascórbico
2 tabletas
efervescente
8g Bicarbonato de Sodio
TOXICOLOGÌA:

ESTUDIANTES DENTRO DE CADA SESIÓN, SI ASÍ SE DESEA
PLANTEAR]
[Introduzca generalidades como formula química, estado físico, punto de fusión,

Riesgos a la salud:
[Introduzca los principales riesgos a la salud: inhalación, digestión, contacto piel

y ojos]
Primeros Auxilios:
[Introduzca los primeros auxilios en caso de: inhalación, digestión, contacto piel y
ojos]
METODOLOGÍA:
Toma de muestra protocolo Aspirina (laboratorio):
1) El día del experimento cada voluntario vaciará completamente la vejiga a las
5:00 am.
97
98 LMMMIF
2) Llevar a cabo la micción en un recipiente limpio (muestra basal o tiempo cero)

y guardar una muestra de 5 a 10ml aproximadamente.
3) Tomar el pH de la orina, anotar el valor en la hoja de registro y desechar el
resto de la orina.
4) Tomar dos tabletas de aspirina de 500 g con 200 mL de agua natural. Anotar
en la hoja de registro la hora exacta de la toma del medicamento.
5) A las 6:00 a.m. Orinar en un recipiente y tomar el volumen y pH. Almacenar
de 5 a 10mL y desechar el resto de la orina. Tomar la siguiente solución, según
corresponda:
a) Orina alcalina: tomar 40 mEq (4 g) de bicarbonato de sodio (NAHCO3),
posteriormente tomar 12 mEq (1g), cada 4 horas (a las 10:00 am y 2:00
pm).
b) Orina ácida: tomar 4 g de ác. Ascórbico, posteriormente tomar 2 g cada
4 horas (10:00 am y 2:00 pm).
c) Control: tomar 200 mL de agua natural.
6)Tomar muestras cada hora (7am a 3pM), orinando en un recipiente, midiendo
el volumen y tomando pH. Recordar almacenar una alícuota por separado y bien
rotulada.
7) Durante el estudio no tomar café, refresco de cola, bebidas energéticas ni
diuréticas. Beber mucha agua, comer de manera ligera y evitar alimentos ácidos
y muy grasos.
Toma de muestra protocolo Ácido Fólico (casa):

1) El día del experimento el voluntario tomará la primer muestra de orina a las
5:00 am.
2) Llevar a cabo la micción sobre un cotonete por ambos lados (muestra basal o
tiempo cero) y colocar en una hoja previamente preparada con cloro comercial.
3) Tomar dos tabletas de ácido fólico de con 200 mL de agua natural. Anotar en
la hoja de registro la hora exacta de la toma del medicamento.
5) A las 6:00 a.m. Orinar nuevamente en un cotone por ambos lados y colocar
en la hoja previamente preparada. Tomar la siguiente solución, según
corresponda:
a) Orina alcalina: tomar 40 mEq (4 g) de bicarbonato de sodio (NAHCO3),
posteriormente tomar 12 mEq (1g), cada 4 horas (a las 10:00 am y 2:00
pm).
b) Orina ácida: tomar 4 g de ác. Ascórbico, posteriormente tomar 2 g cada
4 horas (10:00 am y 2:00 pm).
c) Control: tomar 200 mL de agua natural.
6)Tomar muestras cada 2 horas posteriores (8am, 10am, 12pm y 2pm), orinando
en un cotonete por ambos lados y colocando en el sitio correspondiente de la
hoja previamente preparada. Llevar un correcto registro, anotando la hora de la
muestra,
7) Durante el estudio no tomar café, refresco de cola, bebidas energéticas ni

diuréticas. Beber mucha agua, comer de manera ligera y evitar alimentos ácidos
y muy grasos.
Preparación de soluciones para determinación de salicilatos de sodio

(laboratorio):
Reactivo para desarrollar color: pesar con exactitud y por separado 10 g de

Nitrato Férrico Nonahidratado y 10 g de Cloruro Mercúrico, colocarlos en un
matraz volumétrico de 250 mL. Adicionar un poco de agua destilada para disolver,
añadir 30 ml de una solución 1 N de ácido clorhídrico y diluir hasta el aforo con
agua destilada.
Solución patrón de referencia de salicilato de sodio de 100 mcg/mL: pesar

con exactitud 10 mg de Salicilato de Sodio y depositarlos en un matraz volumétrico
de 10 ml, disolver totalmente en 5 ml de orina libre de medicamentos (diluida 1:1
con agua) y llevar hasta el aforo con la misma orina. De esta solución tomar con
exactitud una alícuota de 2.5 mL y depositar en un matraz volumétrico de 25 mL,
llevar al aforo con agua destilada.
Método analítico para cuantificar metanolitos de aspirina en orina (casa).

En un tubo de ensaye colocar 1 ml de muestra de orina y adicionar 5 ml del
reactivo para desarrollar color, agitar la muestra en vortex durante 1 min. Para
obtener una solución transparente, decantar la solución a un nuevo tubo de
ensaye y determinar absorbencia a una longitud de onda de 590 nm, ajustando a
cero con un blanco de orina preparado a las mismas condiciones que la muestra.
De igual manera proceder con 5 ml de la solución patrón de referencia de salicilato
de sodio a 100 mcg/ml.
Preparación de material para ácido fólico (casa):

1.- Hacer una tabla en una hoja de papel para colocar las muestras donde
colocarás tiempo, muestra orina ácida, muestra orina básica y muestra control.
2.- Realizar pequeños círculos para colocar las muestras.
3.- Colocar con ayuda de un cotonete cloro en todos los círculos donde se colocará
muestra y se dejará secar una noche antes.
Método analítico para cuantificar metabolitos de ácido fólico en orina (casa).

1.- Colocar las muestras de orina conforme se van obteniendo
2.- Dejar secar
3.- exponer al sol por lo menos dos días.
RESULTADOS:
99
100 LMMMIF
Tabla No 1. Eliminación de salicilato de sodio en orina en dferentes condiciones
Orina ácida
Concentración Cantidad Acumulada
Hrs Vol Orina (mL) D.O
mcg/mL mg mg
0 220 0.00
1 185 0.17
2 160 0.34
3 160 0.39
4 160 0.17
5 80 0.44
6 60 0.73
7 100 0.27
8 120 0.50
9 80 0.17
10 80 0.41
Patrón n/a 0.230 100 n/a
Orina básica
Hrs Vol Orina (mL) D.O mcg/mL mg mg
0 230 0.00
1 110 0.30
2 200 0.88
3 120 1.15
4 100 1.52
5 120 1.74
6 160 1.05
7 110 0.68
8 100 0.32
9 80 0.34
10 90 0.35
Control
Vol Orina (mL) D.O
Hrs mcg/mL mg mg
0 560 0
1 70 0.247
2 200 0.453
3 100 1.528
4 100 1.539
5 110 0.968
6 60 0.969
7 120 0.889
8 40 0.527
9 130 0.369
10 120 0.495
CÁLCULOS
Calcular la concentración de salicilato, la cantidad de salicilato y la cantidad
acumulada de salicilato de sodio y graficar cantidad acumulada vs tiempo
Fórmulas
mcg/mL salicilato de sodio= (Absorbacia muestra * 100mcg patrón)
/(absorbancia de patrón)
Cantidad de salicilato mg= (mcg/mL muestra * volumen de la orina)/1000
Cantidad acumulada = Suma de las cantidades por cada hora
[Introduzca las especificaciones para el tratamiento de los residuos generados

por la metodología realizada]
Deben discutir acerca de la eliminación de los metabolitos ambos fármacos en

las tres condiciones y justificar ese comportamiento.
CONCLUSIONES:
BIBLIOGRAFÍA:
101
102 LMMMIF
1. Lorenzo, P., Moreno, A., Lizasoain, I., Leza, J., Moro, M. &
Portoles, A. (2008). Metabolismo y excreción de farmacos.
Velázquez, Farmacología básica y clínica. pp. 48-51. Medica
Panamericana.
2. Pierre, M. (2010). Farmacocinética. Manual de farmacología básica

y clínica. Pp 14-16. McGraw Hill.
3. Santos, V. (23 noviembre, 2019). Aspectos biofarmaceuticos y

farmacocinéticas del ácido acetilsalicílico. Facultad de Farmacia.
PRACTICA 11: DOT BLOT
OBJETIVOS:
Detectar la presencia de anticuerpos específicos en ratones inmunizados.
Aprender los fundamentos de la técnica de Dot Blot
COMPETENCIAS:

INTRODUCCIÓN:
La transferencia de proteínas o 'blotting' supone la inmovilización de las proteínas

sobre membranas sintéticas, seguido de la detección empleando sistemas
especialmente diseñados para la tinción de 'blots'. El método más potente es el
denominado 'Western blot' en el que los antígenos son primero separados
mediante electroforesis en geles de poliacrilamida y posteriormente se transfieren,
mediante la aplicación de un campo eléctrico a una membrana sintética
(nitrocelulosa, polivinil,etc).
Hay, sin embargo, otros métodos de transferir o aplicar proteínas sobre una
membrana. El más sencillo es aplicarlas directamente en forma de una pequeña
gota, a partir de una solución concentrada, sobre la membrana. La absorción de
la gota provoca la adhesión de la proteína a la membrana, quedando en forma de
una mancha o 'dot' (es el caso del 'dot blot').
El trabajar con las proteínas fijadas sobre una membrana tiene ventajas:
103
104 LMMMIF
• Son más rápidas de teñir y desteñir.
• El 'blot' es un registro conveniente.
• Las membranas son mucho más fáciles de manipular que el propio gel.
Todo procedimiento de 'blotting' consta de 5 etapas:
• Inmovilización de proteínas sobre la membrana ya sea mediante

transferencia (electroforética, aspiración, presión, etc.) o mediante aplicación
directa.
• Saturación de todos los lugares de unión de proteínas de la membrana no

ocupados para evitar la unión no específica de anticuerpos, que son proteínas.
• Incubación del 'blot' con anticuerpo primarios contra la/s proteína/s de

interés.
• Incubación del 'blot' con anticuerpos secundarios, o reactivos que actúan

de ligando del anticuerpo primario unidos a enzimas u otros marcadores.
• Los antígenos marcados con enzimas se hacen visibles por incubación con
los sustratos apropiados para formar productos coloreados insolubles en el lugar
donde se encuentran estos. REFERENCIAS Nota, la introducción debe tener
entre 1 y 1.5 cuartillas
Una membrana de
nitrocelulosa de
5cm de alto por 3 Proteína usada
cm de ancho para inmunizar
1 Proteína usada
ratones
Micropipeta de 2ul para inmunizar
(Albúmina).
con puntas. ratones
1 (Albúmina).
Solución de
leche al 3% en
5 5 pipetas de 5 ml
PBS-Tween
Suero de los
ratones de la
Tubos de ensaye práctica de
3
de 5 ml inmunización
(diluido 1:100 en
PBS-Tween)
Navaja de bisturí
1
Anti-IgG de
ratón acoplado
a peroxidasa
Solución de
revelado: 5 ml
1 Guantes
de PBS; 8 mg de
DAB; 15 ul de
H2O2 al 30%.
PREPARAR AL
MOMENTO DE
REVELAR.
Lápiz
1
1 Regla
105
106 LMMMIF
TOXICOLOGÌA:


Riesgos a la salud:
[Introduzca los principales riesgos a la salud: inhalación, digestión, contacto piel y

ojos]
Primeros Auxilios:
ojos]
METODOLOGÍA:
Una membrana de nitrocelulosa de 5 cm de alto por 3 cm de ancho divídala en

3 partes iguales.
2) En la base marque con un lápiz cada columna del 1 al 3, el número no debe

de medir más de 1/2 cm.
3) A 1.5, 3 y 4.5 cm de la base de la membrana agregue 1ul de proteína usada

para inmunizar ratones (Albúmina) y deje secar.
4) A las gotas que corresponden a 3 y 4.5 cm de la base de la membrana

agregue una segunda gota de proteína usada para inmunizar ratones y deje secar.
5) A la gota que corresponde a 4.5 cm de la base de la membrana agregue

una tercera gota de proteína usada para inmunizar ratones y deje secar.
6) Incube la membrana con una solución de leche 3%-PBS-Tween durante 45

min, en agitación a temperatura ambiente, con el fin de bloquear las cargas de la
membrana.
7) Con una navaja de bisturí corte las columnas de la membrana de

nitrocelulosa.
8) A la columna número 1 incúbela en un tubo de ensaye con tapa con 1 ml

de suero de ratón no inmunizado (diluido 1:100 en PBS-Tween), durante 1 hora a
temperatura ambiente.
9) Ponga cada columna en un tubo de ensaye con tapa, A la columna número

1 incúbale en PBS-Tween; la columna 2 incúbela con 1 ml de suero de ratón
inmunizado sin adyuvante y la 3ª columna con el suero del animal inmunizado con
adyuvante. Identifique bien cada tubo (diluido 1:100 en PBS-Tween), durante 1
hora a temperatura ambiente.
10) Lave las columnas 5 ml de PBS Tween durante 5 min. y en agitación

constante, después retire el PBS-Tween y realice la misma operación dos veces
más.
11) Incube las columnas 1, 2 y 3 en tubos de ensaye con 2ml de anti-IgG de

ratón peroxidasa (diluido 1:4000 en PBS-Tween), durante 45 min. a temperatura
ambiente y en agitación constante.
12) Lave todas las columnas con 5 ml de PBS Tween como en el paso número
10. Al momento del último lavado prepare la solución de revelado y protéjala de
la luz.
107
108 LMMMIF
13) Revele las columnas con 10 ml de la solución de DAB
14) Espere 15 min., retire la solución de DAB con una pipeta.
15) Para detener la reacción, lave las columnas con 10 ml de agua destilada
manteniéndolas en agitación constante durante 10 min. Realice la misma
operación 2 veces más.
REPORTE DE LA PRÁCTICA
En el reporte de la práctica tendrá que incluir una discusión de qué significan los
resultados que obtuvo y, en la conclusión, determinar si la inmunización de los
ratones generó la producción de anticuerpos específicos.
Estos resultados también le permitirán realizar la discusión y conclusión de la

práctica 1.
RESULTADOS:
CÁLCULOS


1. ¿Cuál es la finalidad de realizar un Dot- blot?
2. ¿Cuáles son los pasos principales para realizar un Dot-blot?
3. ¿Qué diferencias existen entre Dot-blot, Western-Blot y ELISA?
4. ¿Qué reactivos biológicos utilizará en la práctica?
5. ¿Para qué se requiere la Diaminobencidina (DAB)?
CONCLUSIONES:
[solo indicativo].
BIBLIOGRAFÍA:
http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm
109
110 LMMMIF
PRACTICA 12: INMUNOELECTROTRANSFERENCIA (WESTERN

BLOT)
OBJETIVOS:
Demostrar la presencia de anticuerpos en sueros de ratones inmunizados.

Determinar la especificidad de los anticuerpos generados en ratones
inmunizados.
COMPETENCIAS:
INTRODUCCIÓN:
La técnica de Inmunoelectrotransferencia, también llamado Western Blot o

Inmunobloting, es uno de los métodos más útiles para determinar la cantidad y
peso molecular de una proteína específica que se encuentran dentro de una
mezcla de proteínas u otras moléculas, ya que combina el poder de resolución
superior de la electroforesis en gel, la especificidad de los anticuerpos y la
sensibilidad de las pruebas enzimáticas.
Esta técnica es usada para separar proteínas y después identificar la proteína de

interés, utilizando un sistema de detección específico, principalmente con el uso
de anticuerpos. Consiste en realizar una electroforesis en gel de una mezcla de
proteínas, las cuales posteriormente se transfieren a una membrana y a esta se
le añade un primer anticuerpo específico para la proteína de interés, después se
incuba con un segundo anticuerpo marcado con un cromógeno, que puede ser
una molécula fluorescente, una enzima como la peroxidasa o la fosfatasa, las
cuales, al unirse con un sustrato, generan una reacción colorida.
El Western Blot se emplea directamente en el diagnóstico de muchas

enfermedades infecciosas o parasitarias como los son: infecciones virales como
HIV (SIDA) y hepatitis; por protozoos como Trypanosoma cruzi y la enfermedad
de Lyme; por bacterias como la tuberculosis; por parásitos como la cisticercosis,
entre otro más.
Estas pruebas tienen varias modalidades
1) Se puede utilizar para analizar la presencia de anticuerpos en el suero

de pacientes, lo que indican que el individuo ha estado en contacto con el agente
patógeno y ha desarrollado inmunidad. Aquellos antígenos que son reconocidos
por todos los pacientes conde un padecimiento dado (Antígenos
Inmunodominantes), son candidatos idóneos para ser empleados en pruebas
diagnósticas que involucren la búsqueda de anticuerpos.
2) En otro caso se puede utilizar para demostrar la presencia del agente

infeccioso en fluidos o células del paciente. Por ejemplo, en el caso de la infección
por HIV, el Western blot se utiliza como un análisis confirmatorio utilizando sangre
(suero) del paciente, en el cual se buscan proteínas relacionadas del virus.
111
112 LMMMIF
Equipo de
electroforesis. Agua destilada
Fuente de poder. mezcla de

30%
acrilamida
Agitador de
1.5 M Tris (pH 8.8)
columpio.
Membrana de
10% SDS
1 nitrocelulosa de 6
x 7 cm
10% APS
TEMED
1 Pipeta de 5 ml
Buffer de
1
Pipeta de 10 ml. solubilización
Buffer de corrida
Tris-Glicina -SDS
1 Micropipeta de 1
1x.
ml con puntas.
Buffer de
Micropipeta de
transferencia.Tris-
1 200 l con
Glicina-Metanol
puntas.
Micropipeta de 20
1 l con puntas.
Recipientes para
Solución de
colocar el gel y la
revelado DAB-
membrana.
H2O2-PBS 1x
Tubos de ensaye
de 15 ml con
tapón.
Guantes.
Lápiz.
Suero de ratones
no inmunes
Suero de ratones
inmunizados
(práctica1)
Anti IgG de ratón

acoplado a
peroxidasa.
TOXICOLOGÌA:


Riesgos a la salud:

ojos]
Primeros Auxilios:
ojos]
METODOLOGÍA:
113
114 LMMMIF
1) Diluya 1:2 la proteína utilizada para inmunización con buffer de

solubilización.
2) Prepare los geles de la siguiente manera:
Reactivo Gel separador 10% Gel concentrador 4%

(5ml) (1ml)
Agua destilada 2.0 ml 0.68 ml
Mezcla de acrilamida(*) al 30% 1.7 ml 0.17 ml
1.5 M Tris (pH 8.8) 1.3 ml 0.13 ml
10% SDS2 0.05 ml 0.01 ml
10% PSA3 0.05 ml 0.01 ml
TEMED4 0.002 ml 0.001 ml
(*) Neurotóxicos, usar guantes y no pipetear con la boca.
2 Lauril de sodio. 3 Persulfato de amonio. 4 N,N,N,N - Tetrametiletilendiamina.
3) Escoja el grosor del separador y coloque el vidrio pequeño sobre el más

grande como se indica en la Fig. 1. Después coloque ambos vidrios dentro del
sujetador (Fig. 2 y 3).
4) Coloque los cristales en la pinza, asegurándose de que no escurra líquido

por la parte inferior (Fig. 4).
5) Prepare el gel separador y concentrador, ambos sin PSA ni TEMED, ya que

estos compuestos polimerizan la acrilamida.
6) Agregue al gel separador las cantidades correspondientes de PSA y

TEMED.
7) Coloque el peine sobre los vidrios y llene con el gel separador

aproximadamente un 70% de los vidrios, cubra el resto con agua para favorecer
una polimerización homogénea.
8) Cuando ya esté polimerizado, agregue el PSA y el TEMED al gel

concentrador.
9) Retire el agua de los cristales y agregue el gel concentrador, colocando al

final el peine, evitando hacer burbujas.
10)Deje polimerizar perfectamente.
11)Prepare las muestras que se van a correr diluyendo 1:1 la muestra con el
buffer de solubilización que contiene -mercaptoetanol.
12)Hierva la muestra durante 5 min.
13)Retire el peine y coloque en el primer carril el Peso Molecular, y en los

siguientes carriles las muestras correspondientes, como se muestra en la Fig. 5
14)Coloque los cristales en la cámara de corrida la cual se llena con el Buffer

de corrida Tris-Glicina-SDS 1x (el cual es reutilizable).
NOTA: es importante que el separador del vidrio quede embonado con el

separador verde de la cámara.
15)Tomando en cuenta que el color rojo es positivo y el color negro (o azul)

es negativo, coloque los cables de la manera correcta y programe la fuente de
poder a 140 volts, 40 mAmpers por gel, durante 45 min o hasta que sea necesario.
16)Vigile el frente del recorrido (la línea azul), pare la fuente de poder cuando
esta línea se encuentre como a medio cm de final del gel.
115
116 LMMMIF
Transferencia del gel a la membrana.
17)Retire el gel del vidrio con la ayuda de una espátula y corte una esquina
de este para que pueda identificar la parte superior y el orden del gel.
18)Sumerja el gel de acrilamida en buffer de transferencia (debe de cubrir al

gel).
19)Recorte una membrana de nitrocelulosa de 6 x 7 cm y sumérjala en buffer

de transferencia, al igual que la esponja y el papel filtro del sándwich.
20)En el lado negro (negativo) coloque una fibra, un papel filtro y el gel (en
ese orden) tratando de no hacer burbujas, sobre él coloque la nitrocelulosa, un
papel filtro y una fibra. Retire las posibles burbujas presionando un tubo sobre la
superficie.
21)Empaque el sándwich y colóquelo dentro de la cámara con el lado blanco

coincidiendo con el lado rojo y el lado negro con su igual.
22)Llene la cámara con buffer de transferencia.
23)La fuente de poder se programa para la transferencia a 120 volts, 400 mA,
durante 1 hora. Una vez terminada la transferencia el gel se puede desechar.
24)La membrana se coloca en agua o amortiguador de fosfatos. El buffer de

transferencia se recicla, por lo que hay que filtrarlo antes de almacenarlo.
26)Bloquee las tiras con 10 ml de leche descremada al 3% PBS-Tween,

durante 1 hora a temperatura ambiente y en agitación, o de preferirlo, toda la
noche a 4° C.
27)Diluya 1:1000 con PBS los sueros de los ratones a probar, prepare 2 ml, y
coloque cada suero diluido en un tubo de 15 ml diferente. Marque bien los tubos
y la tira de papel antes de ponerlo.
28)Dentro de los tubos de 15 ml, deposite la tira correspondiente para cada

suero. Incube durante 1.30 h en agitación constante y a temperatura ambiente.
29)Lave durante 10 min con 5 ml de PBS-Tween en agitación constante.

Realice esta operación por triplicado.
30)Incube cada tira con 2 ml de anti-IgG de ratón peroxidasa diluida 1:5000

durante 1.30 h en agitación constante y a temperatura ambiente.
31)Lave como en el paso 29.
32)Junte todas las tiras y revele con 10 ml de la solución de revelado.
33)Detenga la reacción con agua destilada y anote sus observaciones.
RESULTADOS:
CÁLCULOS


117
118 LMMMIF
REPORTE DE LA PRÁCTICA.
De acuerdo con sus resultados responda las siguientes preguntas:
1. ¿Los ratones inmunizados produjeron anticuerpos contra los antígenos

utilizados? Compara con los sueros de ratones no inmunizados.
2. ¿Se produjeron anticuerpos contra una sola proteína o contra varias?
3. ¿La respuesta fue igual en todos los ratones inmunizados o en algunos fue
mayor?
CUESTIONARIO.
1. Describa las diferentes formas en las que se puede utilizar la

Inmunoelectrotransferencia para el diagnóstico, así como las características de
cada uno.
2. Describa brevemente los pasos para realizar el Western Blot.
3. ¿Qué precauciones debe de tomar para desarrollar esta práctica?
4. ¿Cuál es la función del Persulfato de amonio y del TEMED?
CONCLUSIONES:
[solo indicativo].
BIBLIOGRAFÍA:
Methods in Cell Biology (libro multimedia).
Instructivo BIO-RAD. Mini - Protean 3 Cell.
perso.wanadoo.fr/vincent.masson/ bioch/western.htm
PRACTICA 13: ENSAYO INMUNOLÓGICO LIGADO A UNA ENZIMA:

ELISA
OBJETIVOS:
El alumno identificará cuales son las infecciones habitualmente diagnosticadas
por medio del hemocultivo.
El alumno se familiarizará con los métodos de aislamiento e identificación
presuntiva de los agentes etiológicos de la septicemia.
El alumno aprenderá a interpretar los hallazgos reportados de un hemocultivo.
COMPETENCIAS:

INTRODUCCIÓN:
119
120 LMMMIF
La prueba de ELISA tiene un campo muy amplio para ser utilizada en la

investigación, el diagnóstico y en la terapéutica moderna.
Algunas de sus características son: alta sensibilidad, reproducibilidad y

especificidad.
El método puede ser automatizado y cuantitativo, es barato y no genera peligro

para el técnico que lo utiliza.
La técnica de ELISA se ha utilizado en la inmunología para estimar en soluciones,

como son suero u orina, cantidades en ng/ml o pg/ml de proteínas, péptidos o
fármacos. Esto ha dado paso a utilizar el método de ELISA en pruebas de
detección de agentes infecciosos como son VIH, tuberculosis, dengue, etc.
El fundamento para la prueba de ELISA se basa en fijar el anticuerpo o antígeno

a un soporte inerte (placa) que luego se hace reaccionar con el antígeno o
anticuerpo correspondiente, que estará marcado (llamado conjugado), por
ejemplo con una enzima como la peroxidasa o un fluorocromo, después se le
agrega un substrato cromogénico para se genere un cambio de color, el cual será
proporcional a la concentración de anticuerpo o antígeno que se tiene, finalmente
se determina el cambio de color por medio de un colorímetro, espectrofotómetro
o un equipo automatizado.
Los métodos más usuales de ELISA son:

 Método indirecto:
En este método se fija un antígeno a un soporte inerte y se incuba con los

anticuerpos, se lava y se incuba con un segundo anticuerpo marcado, dirigido
contra el primer anticuerpo. Si hay un reconocimiento específico del primer
anticuerpo por el antígeno la reacción se realiza y se observa un cambio de color
en el pozo. El ejemplo de este método lo podemos observar en la Figura 1.
 Método de Emparedado o Sándwich:
En este método se fija un anticuerpo a un soporte inerte, que reconoce

específicamente un antígeno, posteriormente se incuba con la mezcla de
SUBSTRATO
Figura 1 Figura 2
antígenos, de forma tal que el anticuerpo sólo va a reaccionar con el antígeno
específico, finalmente se lava y posteriormente se incuba con un segundo
anticuerpo marcado que reconoce al antígeno. El ejemplo de este método lo
podemos observar en la Figura 2. REFERENCIAS Nota, la introducción debe
tener entre 1 y 1.5 cuartillas
121
122 LMMMIF
Placa para ELISA PBS pH 7.4
Solución de
lavado: PBS pH
Incubadora.
7.4 + 0.05%
Tween 20
Solución
Micropipetas de amortiguadora
200 y 100 l con de bicarbonato
puntas de sodio a pH
9.6
Antígeno (el
Lector de ELISA mismo utilizado
en la práctica 1).
Suero de
ratones
inmunizados en
la práctica 1
Suero anti- IgG

de ratón
acoplado a
peroxidasa
Leche
descremada al
3% en solución
de lavado
Solución STOP
(H2SO4 4 N)
Solución de
revelado
Solución de revelado:
OPD 13 g en 1 ml de DMSO (0-4° C)
H2O2 130MM (fresco) 143 l H2O2 al 30% en 10 ml de H2O
Acetato de sodio 0.1 M, pH= 6.0 ajustar el pH con ácido cítrico 1 M, guardar a 4° C
TOXICOLOGÌA:


Riesgos a la salud:

ojos]
Primeros Auxilios:
123
124 LMMMIF
ojos]
METODOLOGÍA:
1. Prepare el antígeno a 10 g/ml en amortiguador de bicarbonato de sodio a

pH 9.6
2. Ponga 100 l en cada pozo de la placa de ELISA.
3. Incube 2 horas a TA o toda la noche a 4 °C
4. Lave con PBS -Tween 0.05% (200 l en cada pozo) durante 10 min,
después retire el PBS-Tween y realice la misma operación dos veces más.
5. Bloquee los pozos colocando 200 l de leche descremada 3% en PBS-
Tween durante 60 min o toda la noche a 4oC.
6. Retire la leche
7. Coloque los sueros diluidos en leche 3%- PBS-Tween (empezando la
dilución 1:50 hasta 1:1600), durante 45 min a 37° C. (coloque 200 l en cada
pozo).
8. Lave 3 veces con PBS-Tween como en paso 4.
9. Incube 45 min con -IgG de ratón marcada con peroxidasa (200 l/pozo),
diluido 1:8000 en BSA 3%- PBS-Tween.
10. Lave 3 veces con PBS-Tween como en paso 4.
11. Revele con 100 l de solución de revelado.
12. Incube 10-20 min. en la oscuridad.
13. No tire la solución de revelado. Pare la reacción agregando 100 l/pozo de
solución de STOP (H2SO4 4N), Tenga cuidado al manejar el ácido.
14. Lea a una  de 450/595 nm.
15. Grafique sus resultados y realice la interpretación
RESULTADOS:
CÁLCULOS
a. De acuerdo con sus resultados indique cuál ratón tiene la mayor

concentración de anticuerpos, cuál la menor y por qué hace esta
afirmación.
b. Teniendo en cuenta que obtuvo los sueros de los ratones que
inmunizó en la práctica 1, discuta cuál es la diferencia entre
inmunizar los ratones con adyuvante o sin adyuvante.
c. Compare cuáles son las ventajas y diferencias de esta técnica con
respecto a la práctica de Dot-Blot.

¿¿¿¿¿¿¿¿¿¿¿¿????????????????????
1. ¿Qué caracteriza a la prueba de ELISA?
2. ¿Qué diferencia a la prueba de ELISA de la de Western-Blot?
3. ¿Qué es lo que detectará en esta práctica?
4. ¿Qué tipo de ELISA realizó?
5. ¿Para qué requiere un anticuerpo anti IgG marcado con enzima?
CONCLUSIONES:
125
126 LMMMIF
[solo indicativo].
BIBLIOGRAFÍA:
Morilla G. A., Baustista G., C R. Manual de Inmunología. DIANA . México. 1986.
Bernal Fernández. G., Tesis de Maestría, Instituto de Investigaciones Biomédicas,

UNAM, México, 1998.
Multimedia Methods in Cell Biology
http://www.m.ehime-u.ac.jp/~yasuhito/Elisa.html
http://www.biology.arizona.edu/immunology/activities/elisa/main.html
PRACTICA 14 VIRUS PRIMERA PARTE
INOCULACIÓN DE EMBRIONES DE POLLO
OBJETIVOS:
El alumno conocerá las técnicas comúnmente utilizados para inocular huevos

fértiles de gallina.
Adiestrar al alumno en el manejo de las técnicas para la cosecha de
membranas y líquidos extraembrionarios, con el fin de recuperar, identificar y
titular el virus inoculado.
COMPETENCIAS:

INTRODUCCIÓN:
Rous y Murphy en 1911, utilizarón embriones de pollo para la propagación del

virus del Sarcoma. Para 1931 este estudio se expandía más y permitía estudiar
virus como el de la Enfermedad de Newcastle y el de la bronquitis infecciosa,
pudiendose replicar en embrión de pollo. Pero no llegarón a obtener resultados
127
128 LMMMIF
satisfactorios; hasta que Burneo y cols. (1940-1942), demostraron que los

Mixovirus, Herpesvirus y Arbovirus, crecián en embriones de pollo y pudieron ser
aislados. Los criterios para la infección difieren dependiendo del virus que se trate
y edad del embrión. Algunos virus producen cambios patológicos tales como
hemorragias, petequias en la membrana, muerte del embrión, etc. Sin embargo
otros virus no producen efectos tan notables y sin ninguna patología observable.
La infección y el crecimiento de tales virus como el de Influenza y el de Paperas
no producen signos notorios, pero pueden ser detectados por otras propiedades
como es la hemoaglutinación.
Hasta antes de los avances de los cultivos celulares, el embrión de pollo era uno
de los medios más comunes para la propagación, titulación, modificación y
producción de virus en la elaboración de vacunas, presentando ciertas ventajas y
desventajas.
Ventajas:
1. Los huevos embrionarios se pueden adquirir con facilidad

2. Son baratos
3. Son de fácil manejo
Desventajas:
1. Alto nivel e proteína (Inhibe el crecimiento del virus.

2. Posibilidad de contaminantes virales y bacterianos. Para evitarlo se
requiere trabajar con embriones libres de enfermedades cuyo costo es
mayor y difícil de conseguirlos.
Algunos de los factores que influyen sobre el crecimiento del virus en embrión de
pollo son:
1. Edad del embrión.

2. Vía de inoculación.
3. Dilución y volumen del inóculo.

4. Temperatura de incubación.
5. Tiempo de incubación tras la inoculación.
6. Estado fisiológico y nutrición de las aves, especialmente por lo que
respecta a deficiencias vitamínicas y al empleo de inhibidores o activadores
enzimáticos.
Observaciones:
Para el aprendizaje de la técnica de inoculación en huevo fértil por diferentes

vías, es recomendable la utilización de colorantes.
Es indispensable que se llegue al dominio de las técnicas de inoculación en el

embrión de pollo, por la selectividad que presentan algunos virus y de lo cuál
se elige la vía de inoculación, y por lo consiguiente la edad del embrión, para
llegar a buenos resultados. La sustitución arbitraria de la vía de inoculación o
de la edad del embrión, puede conducir al fracaso del experimento. Ya que
generalmente la cosecha de los materiales infectados del huevo embrionario
tiene como propósito recuperar a altas concentraciones de los virus
inoculados. Además es muy importante la revisión del cual se va a cosechar
ya que la mayor producción de virus se obtiene de embriones moribundos y no
de los embriones muertos. Algunos virus requieren de períodos de observación
cortos, cada 8 a 10 horas, mientras que para otros es suficiente una
observación cada 24 horas. Los embriones moribundos, los cuales presentan
movimientos lentos se pueden guardar en el refrigerador hasta el momento de
la cosecha general.
Respiración del embrión.
Los primeros 18 días de incubación son designados como período prenatal,

durante este período el intercambio de CO2 y O2 se lleva a cabo a través de
129
130 LMMMIF
la membrana coriolantoidea. Por el día 19 el embrión formado comienza a picar

el saco de aire y su respiración consiste en una difusión y convección del aire
de la cámara hacia los pulmones a
este periódo se le conoce como
Período Paranatal, del 19 al 21
día. El período Posnatral, comienza
después que el pollito picó el
cascarón, en ese momento se
pone en contacto con el aire
atmosférico y comienza su
respiración pulmonar.
camara de aire
cavidad alantoidea'
membrana corionatantoidea
cavidad amniotica
embrión
saco vitelino
albúmina
membrana del cascaron
cascaron
tareas específicas a resolver, etc ]
MATERIAL Y REACTIVOS:C
1 Ovoscopio 100 ml Tintura de Yodo
131
132 LMMMIF
Incubadora 100 ml Desinfectante

1
200 ml Solución salina

1 Baño de hielo
fisiológica
1 Centrifuga
Jeringa de insulina
1
Aguja calibre 22 de 1
1
pulgada de largo.
Aguja calibre 27 de 1
1
pulgada de largo
Aguja de 26 a 28 de calibre
1 y 1 pulgada, ¾ de largo
(aprox. 4.5 cm)
Aguja de calibre 27 de ½
1
pulgada
1 Aguja de calibre 26
1 Hisopos
1 Vela
1 Perforador
1 Lápiz
1 Bulbo
1 Tijeras
1 Charola para disección
Tubos para centrífuga
Matraces y cajas de petri
1 Pinzas para disección
1 Recipiente para desechos
Embriones de pollo de 9 a
12 días.
Embriones de pollo de 7 a
12 días.
Embriones de pollo de 10
a 11 días.
Huevos fértiles inoculados
TOXICOLOGÌA:
133
134 LMMMIF

[Introduzca generalidades como fórmula química, estado físico, punto de fusión,

Riesgos a la salud:

ojos]
Primeros Auxilios:
ojos].
METODOLOGÍA:
Primera parte
VIAS DE INOCULACIÓN
I. Cavidad Alantoidea
1. Seleccionar los embriones por transluminación, utilizando el ovoscopio,

delimitar la cámara de aire, localizar al embrión y marcar el sitio de
inoculación con una X, sobre la cámara de aire, cerca de la base y opuesto
al embrión.
2. Desinfectar con lugol y perforar en el sitio de inoculación (perforador).
3. Introducir la aguja hipodérmica en el huevo, aproximadamente media

pulgada, como marca la figura 2.
4. Depositar el inóculo (de 0.1 ml a 0.2 ml aproximadamente).
5. Retirar la aguja, sellar con parafina y volver a desinfectar.
6. Incubar a 37°C durante 18, 24, 48 horas, hasta muerte del embrión.
7. Observar y revisar durante 5 días a los embriones inoculados.
Figura 2. Inoculación en cavidad alantoidea
II. Cavidad Amniótica
1. Seleccionar los embriones por transluminación, utilizando el ovoscopio.

Marcar la cámara de aire, localizar al embrión y marcar el punto de
inoculación en el centro de la cámara de aire.
2. Desinfectar el sitio de inoculación y perforar.
3. Introducir la aguja hacia la sombra que da el embrión. Poner el inóculo en
la cavidad de 0.1 ml a 0.2 ml. Toda esta manipulación debe hacerse
observando el embrión en el ovoscopio. Ver figura 3.
4. Retirar la guja y sellar con la vela.
5. Seguir los pasos 6 y 7 de la vía de inoculación alantoidea.
135
136 LMMMIF
Figura 3. Inoculación en Cavidad

amniótica
III. Membrana Corioalantoidea
1. Seleccionar a los embriones de la misma manera y marcar la cámara de

aire, sobre la MCA, evitar no tocar algún vaso sanguíneo.
2. Desinfectar la zona de inoculación, sitio contrario al embrión, y la parte recta
hacia arriba de la cámara de aire.
3. Succionar con un bulbo a través de la perforación hecha en la cámara de
aire y observar en el ovoscopio la formación de una cámara de aire artificial,
mantener el huevo en posición horizontal con el punto de inoculación hacia
arriba.
4. Introducir ligeramente la aguja con el bisel hacia abajo y depositar el inóculo
en la MCA de 0.1 ml a 0.2 ml, balancear nuevamente el huevo para
distribuir el inóculo. Ver figura 4.
5. Sellar primero el sitio de inoculación y después la perforación sobre la

cámara de aire.
6. Incubar en posición horizontal con el punto de inoculación hacia arriba.
7. Incubar a 37°C.
Figura 4. Inoculación en membrana

corioalantoidea.
IV. Saco Vitelino
1. Seleccionar a los embriones de la misma forma, marcar la cámara de aire

y el punto de inoculación en el centro de esta.
2. Desinfectar el punto de inoculación y perforar la cáscara.
3. Insertar la aguja perpendicularmente e inocular de 0.5 ml a 1 ml. Ver figura
5.
4. Retirar la aguja y sellar.
5. Incubar a 37°C.
Cavidad alantoidea Saco vitelino
137
138 LMMMIF
Segunda parte
Cosecha de membranas y líquidos extraembrionarios.
I. Líquido Alantoideo
1. Seleccionar al ovoscopio los embriones vivos, delimitar la cámara de aire;

enfriarlos a 4°C durante 2 a 4 horas ó durante media hora a -70°C.
2. Colocar el huevo en la charola en posición vertical con el extremo perforado
hacia arriba, desinfectar la cáscara que cubra la cámara de aire.
3. Quitar el casquete que cubre la cámara de aire y la membrana de la cáscara
y membrana coriolantoidea, que forman la base de la misma.
4. Aspirar el líquido alantoideo con una pipeta o con una jeringa con aguja
calibrada de 18 y con ayuda del abatelenguas.
5. Mezclar los líquidos cosechados y centrifugart durante 10 minutos a 1500
r.p.m.
6. Guardar el sobrenadante en volumen de 0.5 ml a -70°C hasta su utilización.
II. Líquido amniótico.
1. Llevar a cabo los pasos 1 a 3 del punto anterior.

2. Levantar el saco amniótico con las pinzas y aspirar el líquido con la aguja
calibre 26.
3. Guardar el líquido cosechado a -70°C. hasta su utilización.
III. Saco vitelino.
1. Llevar a cabo los pasos 1 a 2 del punto anterior.
2. Depositar el contenido del huevo en una caja de petri.

3. Separar el saco vitelino del vitelio (facilita lavando la membrana con SSF)
4. Guardar a -70°C
IV. Membrana Corioalantoidea
1. Seleccionar al ovoscopio los embriones vivos y desinfectar el extremo

agudo del huevo.
2. Descartar en una caja de petri el contenido del huevo rompiendo la cáscara
por el extremo agudo y evitar el desprendimiento de la MCA con ayuda de
las pinzas.
3. Guardar las membranas a -70°C.
Nota: Si se está utilizando para titular un virus, lavar y extender en una caja de
petri, contar las lesiones sobre un fondo obscuro para calcular el número de
unidades formadoras de placas por ml, si se desea cosechar, triturar las
membranas y hacer una suspensión al 10% en PBS centrifugar y guardar a
-70°C.g
RESULTADOS:
Vía de Tipo 1° 2° 3° 4° 5° Lesiones características

inoculación de
virus
139
140 LMMMIF
CÁLCULOS

1. Por qué es importante determinar la edad del embrión de acuerdo a la
inoculación con diferentes virus.?
2. ¿Por qué algunos virus (lengua azul) se reproducen mejor en embrión de
pollo que en cultivos celulares??
3. Mencionar el uso de embrión de pato en virología.

4. Mencione cuales son las lesiones que causan determinados virus y cómo
se diagnostican.
5. ¿Qué virus pueden multiplicarse, titularse y cosecharse en embrión de
pollo?
CONCLUSIONES:
[solo indicativo].
BIBLIOGRAFÍA:
Frsehney R.I. "Culture of animal cells: A manual of basic Technique" Editorial

Wiley-Liss Segunda edicion 1991.
Francki R.I.B., Fauquet C.M., Knudson D.L., Brown F. "Clasification and
Nomenclature of Viruses" editorial Springer-Verlag
Wien 1991
Nermut M.V. and Steven A.C. "Animal Virus Structure" editorial Elsevier 1987
Zarate Aquino M.L. Kuno G Ortiz Mariote C., Guarneros Zarate J.E.,
Hernandez Franco C., Sanchez Romero A. "Arbovirus su Importancia en
América" Vol I y II Publicacion técnica del INDRE Nos 2 y 18 1991y
1992.
141
142 LMMMIF
CUADRO 11. VIRUS
VIRUS
SEGUNDA TERCERA
PRIMERA
PARTE
PARTE PARTE
LAVADO Y
VÍAS DE ESTERILIZACION DE CULTIVO PRIMARIO
DE EMBRIONES DE
INOCULACIÓN MATERIAL POLLO
MEMBRNA SACO
CAVIDAD CORIO-
ALANTOI- ALANTOIDEA VITELINO
DEA Y
143
144 LMMMIF
PRACTICA 15: VIRUS SEGUNDA PARTE LAVADO Y

ESTERILIZACIÓN DE MATERIAL PARA CULTIVO DE TEJIDOS
OBJETIVOS:
El alumno aprenderá las técnicas de lavado y esterilizado del material necesario para
realizar cultivos de tejidos.
COMPETENCIAS:

INTRODUCCIÓN:
Uno de los factores que contribuyen básicamente a un buen cultivo celular, es el

material con el que se va a realizar el trabajo.
El lavado de material en cultivo de tejidos, es uno de los procesos en los cuales

se le debe exigir el mayor esmero, ya que las superficies de cristal pueden estar
limpias, tal como habitualmente se define la limpieza y son sin embargo
completamente inadecuadas para los métodos de cultivo de tejido dependientes
de la adhesión y crecimientos de poblaciones celulares sobre el cristal. Aun
cuando las células se propagan en medios que contengan suero y otros líquidos
que proporcionan el desarrollo adecuado de las células en el cristal, es a menudo
difícil de preparar superficies que sean favorables para la adhesión y
multiplicación celular.
La gran tarea de que se adhieren las células es poder lograr confluencia en la

superficie del cristal y mantenerlo vivo. De aquí el poder llevar a cabo un buen
estudio, sobre los cambios que provocan algunos virus sobre las células.
Del material dependerá la buena preparación de los medios de cultivo y el cultivo

mismo. Aún en la actualidad, aunque la tecnología haya avanzado tanto, la
limpieza y esterilidad para el material debe ser escrupulosa. No pudiendo
minimizar en ningún momento la importancia de estos procesos fundamentales.
Sucede que el tratamiento para material de cultivo y preparación de medios de

cultivo, deben hacerse por personal especializado ya que consideran los detalles
importantes.
Factores importantes
La contaminación por bacterias o material trabajando con virus, deben ser

inactivadas por calor húmedo principalmente y también con hipoclorito de sodio.
Otro punto importante es la toxicidad, se ha visto que está relacionada con el no

permitir un crecimiento correcto de las células por la composición química del
cristal. Por lo que generalmente se usa vidrieria Pirex y Kimex, ya ha sido
comprobado que no permiten el desprendimiento de sustancias tóxicas para las
células. A menudo las células que se multiplican abundantemente en ciertas áreas
de la superficie del cristal mueren en áreas vecinas; a veces las áreas tóxicas no
afectan a las células hasta que se adhieren y comienzan a multiplicarse. Se ha
demostrado que la carga negativa total y la cantidad de sodio en el cristal sean la
causa de la toxicidad para las células.
Hoy en día se ha sustituido todo el material de vidriería por material de plástico

especial para cultivos celulares en los grandes países, teniendo para nosotros una
gran desventaja el de ya no poder re utilizarlo, ya que son desechables.
145
146 LMMMIF
El agua que se utiliza para este caso, es de gran importancia. Para obtener agua
destilada debe tratarse de manera especial, para que la cantidad de sales sea
reducida y por consiguiente el agua desionizada sea o tenga un alto grado de
pureza por el método de intercambio iónico. El tipo de desionizadores pueden ser:
Cartridge Barell y Millipore.
Los detergentes que se utilizan para este tratamiento reducen la tensión

superficial del agua para obtener un poder grande de limpieza. Es necesario que
las trazas de detergente sean removidas con facilidad sobre el cristal, y esto se
logra con algunos detergentes neutros como el Extran.
Un punto importante es la estandarización de los métodos de limpieza del

laboratorio, ya que dependerá de cada laboratorio, del material que tengan, agua,
personal, etc.
Tipos de Esterilización
La esterilización se define como el método por el cual un objeto o sustancia queda

libre de todo tipo de vida. Es importante tener el conocimiento de los métodos
existentes, para matar, remover o inhibir el crecimiento de microorganismos. La
esterilización se usa en una gran variedad de cosas para el trabajo de cultivo
celular, como son: medios de cultivo, vidriería, filtros, suero, material de cirugía,
etc., cada uno de diferente composición química y por lo tanto requieren de
diferentes procesos de esterilización. El método de esterilización en caliente quizá
sea el más utilizado, y este método es aplicado por tres métodos: calor húmedo,
calor seco e incineración.
Calor húmedo
Este método es quizá uno de los más involucrados, dando uso al vapor. Es el más
simple de los tratamientos y el aparato para llevar a cabo esto es simple, la
llamada autoclave. Esto funciona con vapor a 15 lb de presión, una temperatura
de 121°C, con un tiempo de 15 – 30 minutos. Deben ser consideradas las
siguientes precauciones:
1. El papel que se utiliza para tapar las bocas de los frascos u otros tipos de
material o soluciones deben de permitir circular el vapor libremente.
2. Líquidos procesados en pocos volúmenes requieren de tiempo y
temperatura normal, pero si el volumen es muy grande, se necesitará más
tiempo y más temperatura en contenedores especiales.
3. El llenado de los frascos debe ser hasta ¾ partes de su total, ya que si
fueran llenos se perdería una parte en la esterilización.
4. La válvula debe permitir circular un flujo fino de vapor.
5. El tiempo y la presión deben ser constantes en la esterilización.
Por este método puede ser esterilizado, algún tipo de vidriería, material de cirugía,
algunas soluciones sin proteínas, agua para que quede libre de pirógenos, filtros
preparados, gasas, jeringas, etc.
Calor seco
El calor seco en la esterilización también es muy utilizado, el horno donde se lleva

a cabo esta esterilización es un poco más difícil de que se tenga en un laboratorio,
pero se debe conseguir. La temperatura y el tiempo es más prolongado que en el
caso anterior, esta esterilización se lleva a cabo de 170 a 180 °C durante dos
horas. Estas condiciones deben ser constantes durante el tiempo de esterilización.
Se recomienda que durante la esterilización no se abra el horno para que se lleve

a cabo óptimamente. Todo tipo de vidriería se esteriliza por este método.
Generalmente se envuelven en papel aluminio para que el calor seco, penetre
147
148 LMMMIF
correctamente en todas las superficies. Se debe recordar que después de

terminada la esterilización se debe dejar enfriar para guardarlo, ya que puede
dañar el material.
Incineración
Se utiliza para bocas de frascos, tubos, para hojas de bisturí, fórceps, pinzas,
tijeras, después de sumergir el material de cirugía en alcohol al 70%.
Filtración
Es un método por el cual partículas de varios tipos pueden ser separados de un

medio líquido o gas. El filtro tiene poros, los cuales deciden que pasa del medio y
que se queda (generalmente partículas grandes).
Hay muchos diferentes tipos de filtros diseñados para diferentes sistemas, pero
esencialmente hay dos propósitos básicos de filtración: retención y separación.
Ocasionalmente es necesario esterilizar líquidos, los cuales no pueden sujetarse

a calor, como suero, soluciones azucaradas, enzimas, etc. Existen diferentes tipos
de filtro:
1. Filtros Seitz: consisten de celulosa incorporados con asbestos purificado,

existen de diferentes diámetros de poro.
2. Filtros de membrana: están hechos de esteres de celulosa, nylon, cloruro
de polivinilo, son membranas circulares y tienen diferentes grados de
porosidad y diámetro. Para volúmenes de 10 a 100 ml se pueden usar filtros
adaptados a jeringas hipodérmicas, y para más de 100 ml se utilizan
contenedores conectados a una compresora con presión positiva y filtros

Millipore estériles, con campana para recibir el líquido estéril.
Desinfectantes
Existen muchos tipos de desinfectantes. Lo importante es elegir uno no irritante

y que no manche.
Los yodoforos son desinfectantes no irritantes y que no manchan, estos bajan

la tensión de la solución y libera poco yodo. Esta puede ser efectiva para
hongos, bacterias, esporas y algunos virus.
Desinfectantes fenolicos, sales cuaternarias de amonio, soluciones alcoholicas

y Benzal son importantes desinfectantes, usados para la limpieza de áreas de
trabajo y aparatos.
Preparación de Material
Para la preparación del material se debe de tener mucho cuidado, ya que si

alguna parte quedara descubierta la esterilización sería nula.
El papel que es más utilizado para envolver el material es papel aluminio de

un grosor mediano.
Se envuelve todo el material de la boca principalmente. Las pipetas se taponan

con algodón, de manera que no queden muy apretados y se meten en
cartuchos separados según de la cantidad de que sean.
Las cajas de petri y jeringas se envuelven con papel estrasa o algo parecido.
149
150 LMMMIF
tareas específicas a resolver, etc.].
1 Autoclave 500 ml Hipoclorito de sodio 3%
1 Estufa Extraen al 3%
10 Tinas 1 Garrafón con agua

destilada
1 Rollo de papel aluminio 1 Garrafón con agua

desionizada
1 Paquete de Papel estrasa
1 Cinta testigo
1 Paquete de algodón
TOXICOLOGÌA:


Riesgos a la salud:

ojos]
Primeros Auxilios:
ojos]
METODOLOGÍA:
1. Si el material se encuentra contaminado se inactiva por calor húmedo o

por hipoclorito de sodio.
2. Se enjuagará y se pondrá en una tina con extran al 3% y 3% de hipoclorito
de sodio, toda la noche.
3. Lavar con mucho cuidado tratando de no rayar el material de cristal.
4. Enjuagar con agua corriente varias veces (5-10 veces).
5. Enjuagar 5 veces en 4 tinas con agua destilada
6. Enjuagar 5 veces en 3 tinas con agua desionizada.
151
152 LMMMIF
7. Se deja escurrir y se mete a secar 1 hora a 80°C.

8. Se envuelve el material de vidriería con papel aluminio, en la boca de los
frascos.
9. Se esteriliza en horno 2 horas a 180°C.
10. El material que no es de cristalería o que por lo tanto no resistan el calor
seco, se esterilizará por autoclave a 121°C por 15 minutos.
11. Transcurrido el tiempo de esterilización, sacar el material y guardarlo en
gabetas apropiadas.
RESULTADOS:
CÁLCULOS


1. ¿Por qué se debe usar agua destilada y desionizada?
2. ¿Cuál es el objetivo de enjuagar varias veces?
3. Mencione otros tipos de esterilización y en que se basan.
4. ¿Por qué el material de vidriería debe ser de buena calidad?
5. Mencione para qué se utiliza la mezcla crómica.

6. ¿Qué otros tipos de detergentes no iónicos se emplean en el lavado de
material para cultivo de tejidos?
7. ¿Cómo demostraría que el cultivo celular no se desarrollo o no se adhirió
por causa del mal lavado de material?
8. ¿Cómo trataría un material que por este método rutinario no estuviera
limpio?
9. ¿Qué diferencia encuentra entre retención y separación?, de un ejemplo.
CONCLUSIONES:
[solo indicativo].
BIBLIOGRAFÍA:
Frsehney R.I. "Culture of animal cells: A manual of basic Technique" Editorial
Wiley-Liss Segunda edicion 1991.
Francki R.I.B., Fauquet C.M., Knudson D.L., Brown F. "Clasification and
Nomenclature of Viruses" editorial Springer-Verlag
Wien 1991
153
154 LMMMIF

1992.
PRACTICA 16: VIRUS TERCERA PARTE CULTIVO PRIMARIO DE

EMBRIOM DE POLLO (FIBROBLASTOS)
OBJETIVOS:
El alumno conocerá la técnica de cultivo primario de embrión de pollo para facilitar el estudio
de los virus.
COMPETENCIAS:

INTRODUCCIÓN:
Falta redactar la introducción de esta práctica….
tareas específicas a resolver, etc.].
1 ovoscopio Azul de tripan al 0.1%
1 Centrífuga Alcohol al 70%
1 Agitador magnético Lugol
Embriones de pollo vivos
Suero Fetal Bovino
155
156 LMMMIF
Medio de crecimiento
Medio de mantenimiento
Embudos
Gasas estériles
Pinza estéril
Tijeras rectas estériles
Tijeras curvas estériles
Cajas de Petri
Cámara de Newbawer
Tubos para centrífuga
Vasos de precipitados
TOXICOLOGÌA:


Riesgos a la salud:

ojos]
Primeros Auxilios:
ojos]
METODOLOGÍA:
1. Se eligen huevos embrionados de 9 a 11 días de edad.

2. se observan al ovoscopio la viabilidad de los embriones.
3. Trabajando en condiciones estériles, se procede a limpiar los huevos por
inmersión en etanol al 70%.
4. se limpia con gasa estéril y se le pone un poco de lugol, en la parte donde
se encuentra la cámara de aire.
5. Se hace un pequeño orificio con cuidado con la punta de la tijera y se corta
toda la parte de arriba de la cámara de aire.
6. Se saca el embrión con pinzas estériles y se pone en una caja de petri
estéril, se lava dos veces con PBS.
7. Se cortan, ojos, pico, alas, patas y víceras, lo demás del cuerpo se lava dos
veces con PBS.
157
158 LMMMIF
8. Se corta en pequeños pedacitos y se pasa por una jeringa estéril a un

matraz de tripsinización, con 10 veces el volumen de tripsina al 0.25% de
volumen tisular, precalentada a 37°C.
9. Se pone en un agitador magnético durante 5 minutos.
10. Se pasa por un embudo con gasa estéril, y lo que quede en la parte de
arriba, se vuelve a poner en el matraz con el mismo volumen de tripsina y
se pone en el agitador magnético durante 20-30 minutos.
11. Se pasa por un embudo con gasa y se colecta, el líquido en tubos estériles
de centrífuga, con 10 ml de medio al 10% de suero ó se deja sedimentar y
se decanta el sedimento.
12. Se centrifuga durante 15 minutos a 1000 r.p.m.
13. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en medio
limpio.
14. Realizar el conteo en la cámara de Newbawer:
Se diluye 0.5 ml de suspensión más 0.1 ml de colorante.
Número total de células= Número de células contadas por 2400 por ml de

suspensión.
De los 4 cuadros primarios de las esquinas de la cámara de Newbawer, se

calcula el promedio y se multiplica por 6/5, considerar el titulo de dilución
con el colorante. Un cuadro tiene las siguientes dimensiones 1 mm x 0.1
mm por consiguiente el valor del factor de dilución es de 10 4 y nos dará el
número total de células por mililitro.
15. Se pone en cada botella una concentración de aproximadamente 2 x 10 6 ,

utilizando 15 ml por cada botella de medio de cultivo.
16. Se tapan herméticamente y se incuban a 37°C hasta confluencia en la
botella de leche, se cambiará el medio a las 24 horas.
17. Se podrá realizar pase ó se podrá infectar.
RESULTADOS:
CÁLCULOS


CONCLUSIONES:
[solo indicativo].
159
160 LMMMIF
Cuadro. 13 Cultivo primario de embrión de pollo (Fibroblastos)
BIBLIOGRAFÍA:
Frsehney R.I. "Culture of animal cells: A manual of basic Technique" Editorial Wiley-Liss
Segunda edicion 1991.
Francki R.I.B., Fauquet C.M., Knudson D.L., Brown F. "Clasification and Nomenclature of
Viruses" editorial Springer-Verlag
Wien 1991
1992.

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Facultad de Farmacia

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Universidad Autónoma del Estado de Morelos

Organización del Laboratorio: ................................................................................................................................. 11

Rubrica para reportes de laboratorio ....................................................................................................................... 11

Reglas de Laboratorio ...................................................................................................................................... 15

Reglas ADICIONALES AL LABORATORIO DE microbiología y parasitología ................................................... 16

Medidas de Seguridad ..................................................................................................................................... 17

PRACTICA 1: TOMA DE MUESTRA HUMANA E IDENTIFICACIÓN. .............................................................. 18

PARTE 1 HEMOCULTIVO .................................................................................................................................. 18

Actividades Preliminares: ................................................................................................................................. 19

Material y reactivos: ......................................................................................................................................... 19

Manejo ESPECÍFICO de residuos generados ................................................................................................. 24

DISCUSIÓN de resultados: .............................................................................................................................. 24

PRACTICA 2: TOMA DE MUESTRA HUMANA E IDENTIFICACIÓN. PARTE 1 COPROCULTIVO ............. 26

Actividades Preliminares: ................................................................................................................................. 26

Material y reactivos: ......................................................................................................................................... 27

Manejo ESPECÍFICO de residuos generados ................................................................................................. 34

DISCUSIÓN de resultados: .............................................................................................................................. 34

PRACTICA 3: TOMA DE MUESTRA HUMANA E IDENTIFICACIÓN. PARTE 2 EXUDADO FARÍNGEO Y

Actividades Preliminares: ................................................................................................................................. 35

Material y reactivos: ......................................................................................................................................... 36

Manejo ESPECÍFICO de residuos generados ................................................................................................. 47

DISCUSIÓN de resultados: .............................................................................................................................. 47

PRACTICA 4: TOMA DE MUESTRA HUMANA E IDENTIFICACIÓN. PARTE 3 UROCULTIVO ..................... 49

Actividades Preliminares: ................................................................................................................................. 50

Material y reactivos: ......................................................................................................................................... 50

Candida albicans .............................................................................................................................................. 57

Manejo ESPECÍFICO de residuos generados ................................................................................................. 58

DISCUSIÓN de resultados: .............................................................................................................................. 58

PRACTICA 5: MANEJO DE ANIMALES DE LABORATORIO .......................................................................... 59

Actividades Preliminares: ................................................................................................................................. 62

Material y reactivos: ......................................................................................................................................... 62

Manejo ESPECÍFICO de residuos generados ................................................................................................. 65

DISCUSIÓN de resultados: .............................................................................................................................. 65

PRACTICA 6: INMUNIZACIÓN DE ROEDORES ............................................................................................... 67

Actividades Preliminares: ................................................................................................................................. 68

Material y reactivos: ......................................................................................................................................... 68

Manejo ESPECÍFICO de residuos generados ................................................................................................. 72

DISCUSIÓN de resultados: .............................................................................................................................. 72

PRACTICA 7: FARMACOCINÉTICA ADME ...................................................................................................... 74

Actividades Preliminares: ................................................................................................................................. 75

Material y reactivos:c ........................................................................................................................................ 76

Manejo ESPECÍFICO de residuos generados ................................................................................................. 79

DISCUSIÓN de resultados: .............................................................................................................................. 79

PRACTICA 8: VÍAS DE ADMINISTRACIÓN ...................................................................................................... 80

Actividades Preliminares: ................................................................................................................................. 81

Material y reactivos: ......................................................................................................................................... 81

Manejo ESPECÍFICO de residuos generados ................................................................................................. 85

DISCUSIÓN de resultados: .............................................................................................................................. 86

PRACTICA 9: ABSORCIÓN DE FÁRMACOS Y PH. ......................................................................................... 87

Actividades Preliminares: ................................................................................................................................. 88

Material y reactivos: ......................................................................................................................................... 89

Manejo ESPECÍFICO de residuos generados ................................................................................................. 92

Practica 10 “Influencia del ph en la eliminación de fármacos” .................................................................... 95

Actividades Preliminares: ................................................................................................................................. 96

Material y reactivos: ......................................................................................................................................... 96

DISCUSIÓN de resultados: ............................................................................................................................ 101

Conclusiones: ................................................................................................................................................. 101

PRACTICA 11: DOT BLOT ............................................................................................................................... 103

Introducción: ................................................................................................................................................... 103

Actividades Preliminares: ............................................................................................................................... 104

Material y reactivos: ....................................................................................................................................... 105

Cuernavaca Morelos a _ de _del ___