Purificación de

inmunoglobulina A
secretora a partir
de calostro
humano.
● La inmunoglobulina A (IgA) es el isotipo de anticuerpo más abundante en las secreciones de las
superficies mucosales del tracto gastrointestinal, respiratorio y genitourinario y en secreciones
externas como el calostro, la leche materna, las lágrimas y la saliva.

En el presente trabajo se obtuvo inmunoglobulina A secretora a partir de calostro

humano mediante una combinación de métodos cromatográficos, y su presencia fue
demostrada mediante Dot blot. La fracción de IgA fue analizada mediante electroforesis
en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) bajo
condiciones reductoras, obteniéndose una elevada pureza al identificarse la presencia del
componente secretor, la cadena pesada y la cadena ligera de dicha inmunoglobulina, con
un patrón de migración correspondiente a sus respectivas masas molares.
MATERIALES Y MÉTODOS

Calostro humano

El calostro humano fue obtenido de madres sanas entre los 2 y 4 días posteriores al alumbramiento, colectado de forma
manual en frascos de vidrios estériles y almacenados a -20 °C.

Cromatografía de intercambio aniónico

La IgAsh fue purificada a partir de 50 mL de calostro humano, centrifugado durante 1 h a 330 000 g. Se obtuvieron tres fases
diferentes: una fase superior que contenía la fracción lipídica, una capa intermedia con la fase acuosa y el precipitado,
consistente en los elementos celulares del calostro humano. El suero se obtuvo acidificando la fase acuosa con NaCl 1mol/L, pH
6,4 y luego, centrifugado a 13 000 g durante 20 min. Se aplicaron 25 mL del suero en una columna DEAE Sepharose FF,
estabilizada con fosfato de sodio 10 mmol/L, pH 7,6. La fracción específica fue eluida con fosfato de sodio 100 mmol/L, pH 6,4.

Cromatografía de gel filtración

La fracción de IgA obtenida de la cromatografía de intercambio iónico fue aplicada en una columna cromatográfica con
dimensiones de 1,6 x100 cm, empaquetada con Superose 6 grado preparativo (Amersham Biotech, Suecia).
Caracterización de la IgAsh mediante Dot blot y SDS-PAGE

Se utilizó el ensayo de Dot blot para la identificación de la fracción conteniendo la IgAs posterior a la cromatografía de gel
filtración. Se aplicaron 100 µL de cada fracción obtenida en papel de nitrocelulosa bajo vacío. La membrana fue bloqueada con
3% de leche descremada en solución salina tamponada con fosfatos (SSTF) durante 30 min a 37 °C. Posteriormente, se incubó la
membrana con anti-IgA humana marcada con peroxidasa (Sigma), diluido 1/2000 en la solución SSTF-Tween 20-leche
descremada al 1,5%, durante 1 h en agitación a 37 °C. Se lavó cuatro veces con SSTF-Tween 20 durante 5 min, seguido un
lavado con SSTF. La reacción fue desarrollada con diaminobencidina (DAB, Sigma). La fracción de IgAsh identificada por Dot blot
(10 µL) fue incubada a 100 °C por 2 min en presencia de 2-mercaptoetanol (Merck, Alemania) y separada mediante SDS-PAGE
(gel de acrilamida al 12,5%) según ha sido descrito (8), seguido de tinción con R250 Azul Coomassie.
RESULTADOS

Cromatografia de intercambio anionico en

matriz de DEAE -Sepharosa

Perfil cromatografico de la IgA a partir del calostro

humano por cromatografia de intercambio anionico
en matriz de DEAE -Sepharosa

● Pico 1 : fraccion eludida en fosfato de sodio

10mmol/L ,ph 7,6
● Pico 2 : fraccion eludida en fosfato de sodio
100 mmol/L ,ph 6,4
● Pico 3: fraccion eludida con NaCl 1mol/L

La fracción de IgAs se obtuvo en un pico bimodal

al realizar cromatografía de intercambio aniónico
(P2), eluida con fosfato de sodio 100 mmol/L,
pH 6,4, teniendo en cuenta que el punto
isoeléctrico de esta inmunoglobulina es 6,5.
Cromatografia de gel de filtracion

Analisis mediante Dot blot de la presencia de IgAs

en las fracciones obtenidas de cromatografia de gel
de filtracion .Pico 1,Pico 2 y Pico 3 obtenidos de la
cromatografia de gel de filtracion,respectivamente.

Los carriles representan concentraciones

decrecientes de las fracciones evaluadas.

Para la purificación de la IgAs mediante gel

filtración se seleccionó una matriz de Superose 6,
teniendo en cuenta que posee un intervalo de
exclusión molecular entre 5 - 5000 kDa y la IgAsh
posee un tamaño molecular de 390 kDa. La
fracción obtenida de la cromatografía de gel
filtración fue identificada mediante Dot blot. Sólo
se obtuvo reconocimiento específico en la fracción
1 en todas las diluciones evaluadas.
Evaluacion mediante electroforesis
en SDS-PAGE de la IgAs purificada
● Carril 1 : Proteinas patrones con masas
molares expresadas en KD
● Carril 2 : Calostro humano
● Carril 3 : Fraccion de la IgAs
purificada.Todas mas muestras se
corrieron en condiciones reductoras.

Con el objetivo de evaluar la pureza e integridad de la IgAs, esta fue analizada

mediante PAGE-SDS, bajo condiciones reductoras

En la electroforesis se observa la presencia del componente secretor, las cadenas

pesadas y ligeras, con un patrón de migración correspondiente a sus masas molares
estimadas de 75, 50 y 25 kDa, respectivamente
DISCUSION

A partir de la purificación de calostro humano mediante la combinación de cromatografía de intercambio

aniónico y cromatografía de gel filtración, se obtuvo IgAs, lo cual demuestra que los métodos empleados
son efectivos para su obtención. Serán necesarios futuros estudios de caracterización para evaluar el
reconocimiento específico de esta inmunoglobulina frente a diferentes antígenos de micobacterias.

De igual modo, resultaría de gran interés evaluar la capacidad protectora de la IgAs proveniente de
calostro humano frente a la infección por Mycobacterium tuberculosis.
REFERENCIA BIBLIOGRAFICA

Nadine Álvarez, Oscar Otero, Gustavo Falero, Armando Cádiz, Ricardo Marcet, Ana E. Carbonell, María E.
Sarmiento, Mohd-Nor Norazmi, Armando Acosta.(2010).Purificación de inmunoglobulina A secretora a partir
de calostro humano.Referido de:
http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1025-028X2010000300005