Análisis Intsrumental

Licenciatura en Análisis Alimentario

Qco. Marcos Colazzo
29 de agosto, 2018
Principios de análisis instrumental; Douglas
A. Skoog, F. James Holler y Stanley R. Crouch;
6ta Ed.; Cap. 28
Introduction to Modern Liquid
Chromatography; Lloyd R. Snyder, Wiley, 3era
Ed., 2010.
 Uno de varios métodos cromatográficos para la
separación y análisis de mezclas

- Aplicación casi universal (pocas muestras son excluidas)

- Excelente precisión (±0,5%)
- Disponible comercialmente amplio rango de equipos, columnas,
etc, que permiten el uso de HPLC para muchas aplicaciones
Una de las técnicas analíticas mas útil y ampliamente utilizada

- Propiedades generales de HPLC

- Breve historia
- Equipamiento
 ¿Qué es HPLC?

- La cromatografía líquida comenzó a inicios de 1900 (cromatografía

en columna)
- Un cilindro de vidrio se empacaba con un polvo finamente
dividido (ej: tiza), se aplicaba la muestra al inicio de la columna y
se adicionaba solvente
 Mezcla de
pigmentos
Pigmentos
separados
Concentración

Número de fracción
- Representa la culminación moderna del desarrollo de
la cromatografía líquida.
 Equipamiento
 Con algunas excepciones, no existen grandes variaciones en
diseño y en características.
 Los cambios cada vez son menores entre un modelo y otro
 ¿Qué sistema o fabricante es el mejor?
 Antes se obtenían los módulos de diferentes marcas, hoy en día no
es común (bomba, autosampler, columna, etc)
 El detector puede ser de otra marca (especialmente MS/MS)
Diagrama del sistema

DETECTOR
Control y Procesamiento
de datos

Reservorio
de solventes Descarte

Bomba Inyector Columna

Reservorio de solvente

 Parte simple pero esencial del sistema.

 Para aplicaciones isocráticas, solo es necesario
una botella.
 Para aplicaciones en gradiente es necesario
mas de una
 FM libre de material particulado (filtración
previa)
Reservorio de solvente

 La mayoría son de vidrio, excepto para

algunas aplicaciones.
 Importante: Limpieza
 Evitar ingreso de polvo (no utilizar
Parafilm)
 Utilizarsiempre filtro (frita) de
porosidad ≥10 µm
 Filtración de FM

 La operación de muchas partes del sistema se puede comprometer si

hay partículas (válvulas, tuberías, fritas, columnas)
 Muy importante el uso de FM libre de material particulado!
 Uso de solventes grado HPLC (prefiltrados por 0,2 µm)
 En caso de no contar con grado HPLC, FILTRAR!
Filtración de FM
 Equipo de filtración a vacío
 Se utilizan filtros de membrana de 0,45 µm
 Material del filtro depende del solvente (PTFE,
nitrocelulosa, nylon)
 Desgasificación de FM

 Problema común: burbujas de aire en la FM

 Pueden generar problemas en el sistema de la bomba y en el detector
 Solución: Desgasificación

 Burbujeo con He (remueve entre 80 y 90% del aire disuelto)

 A vacío (10 a 15 minutos remueve aprox. 70%) + ultrasonido
 En línea
 Desgasificación de FM

 En línea, es la técnica más utilizada

 Basado en la permeabilidad selectiva
al gas, de ciertas tuberías
 El módulo presenta una cámara de
vacío por donde pasa la tubería
 Tuberías y uniones

 Se utilizan para transportar la FM y conectar los diferentes módulos del

cromatógrafo
 Una mala selección y uso puede generar inconvenientes (volúmenes
muertos) que pueden comprometer la separación.
TUBERIAS
 Baja presión – (De reservorio a la bomba y de detector a descarte)
Teflon, Polipropileno, Polietileno, PEEK.
 Alta presión – (De bomba a detector) Acero inoxidable, PEEK
 Tuberías y uniones

UNIONES (Fittings)
 Alta presión – Presentan un ferrule al final de la tubería. (Acero
inoxidable o PEEK)
 Sistema de Bombeo

 Existen dos tipos: Tipo jeringa y de tipo reciprocante

 Actualmente la mayoría son bombas reciprocantes
 Muchos de los sistemas están diseñados para trabajar hasta 400bar
(usualmente se trabaja entre 150 y 200bar)
 Sistema de Bombeo

4 componentes principales

 Motor
 Pistón (zafiro)
 Sello de bomba
 Válvulas
Sistema de Bombeo
Sistema de Bombeo
 Sistema de Bombeo

 Un solo pistón con velocidad constante, utilizará la mitad del tiempo para
llenar la cámara y la otra mitad para entregar el solvente al sistema

 El resultado es un perfil con pulsos (de flujo y presión), no deseable en

HPLC
 Sistema de Bombeo

 Sistemas de un pistón modificados (ej: velocidad variable, amortiguación

de pulsos)

 No genera un flujo lo suficientemente estable para HPLC

 Sistema de Bombeo

 Una forma de atenuar las pulsaciones es utilizar dos pistones en paralelo,

de forma de que cuando uno está llenando la cámara, el otro está
entregando solvente al sistema
 Sistema de Bombeo

 Un diseño alternativo para la bomba de dos pistones es con sistema

acumulador (tándem)

 Un pistón (inferior) alimenta al otro (superior) al doble del flujo

 Autosampler

 La introducción de la muestra en la columna, requiere que una cantidad

conocida de muestra se inyectada en la fase móvil presurizada
 En análisis de rutina, la inyección debe ser precisa, exacta y automática.
 Es por esto que se utiliza una inyector automático (autosampler)
 Autosampler

 Válvula de inyección de 6 puertos

 Originada inicialmente para inyección manual
 Autosampler

 Inyección con loop completo (Ej: 20µL)

Muy preciso y exacto (generalmente no usado)
 Inyección con loop parcial (Ej: 20µL con loop de 100µL)
Utiliza jeringa calibrada
 Columna

 Es el “corazón” del HPLC

 Construidas con un tubo de acero inoxidable con DI uniforme
 Existen disponibles un enorme número de columnas de diversos precios
y rellenos (200 y más de 500 U$S)
 Columnas analíticas

 Miden entre 5 y 25 cm de largo.

 DI por lo general entre 3 y 5 mm
 Tamaños de partículas de rellenos entre 3 y 5 µm
 Las más utilizadas: 10 cm; 4,6 mm DI y 4,6 µm
 Aprox. 40 mil a 70 mil platos/m (10 mil platos/columna)
 Precolumnas

 Utilizadas para aumentar la vida de las columnas

 Elimina materia en suspensión, y componentes de muestras que se unen
irreversiblemente a la FE.
 Composición similar a la de la columna
 Se reemplaza
 Tipos de rellenos

 Actualmente se utilizan rellenos de partícula porosa

 Micropartículas porosas con diámetros entre 3 y 10 µm
 Partículas de sílice (relleno más común) o alúmina
 Las partículas se recubren con películas orgánicas unidas químicamente
a la superficie
Tipos de rellenos

 R=grupo alquilo o alquilo sustituido